Name: Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Scopri il protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus laevis e Xenopus tropicalis per studi di trascrittomica e proteomica. Questo metodo ottimizza la qualità dei campioni tissutali e facilita la collaborazione tra laboratori.

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Questo lavoro è stato supportato dal OD031956 di sovvenzione OD R24 del NIH e dal HD073104 della sovvenzione NICHD R01. Ringraziamo Darcy Kelly per le utili discussioni e gli input iniziali su questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan per la loro assistenza e supporto, nonché i nostri tre revisori anonimi per il loro feedback.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le regole e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
NOTA: Sebbene il metodo primario di eutanasia descritto sia considerato una tecnica accettabile per l'eutanasia dall'American Veterinary Medical Association12, non è stato trovato per portare alla cessazione di un battito cardiaco13. Anche il metodo secondario frequentemente usato di doppia pithing non impedisce questo, né rimuove il cuore dall'animale. Il dissanguamento di animali anestetizzati è considerato un metodo umano ed efficace per l'eutanasia di successo12. Poiché mantenere i tessuti freschi attraverso l'eutanasia è l'obiettivo di questo protocollo, è utile che il cuore continui a battere attraverso l'eutanasia primaria con MS-222 e che la perfusione sia essa stessa un metodo di eutanasia secondario attraverso il dissanguamento.
1. Preparazione
<ol><li>Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia e perfusione descritta in questo protocollo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 5 g/L MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio. Il volume dovrebbe essere maggiore del volume richiesto per coprire completamente gli animali sottoposti a eutanasia. Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.</li>
	<li>Preparare 500 μL di 180 U/mL di eparina in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per X. laevis o 200 μL per X. tropicalis.</li>
	<li>Eseguire l'eutanasia primaria ponendo lo Xenopus in questa soluzione (dal punto 1.2); L'animale rimarrà sommerso per un totale di 1 ora.</li>
	<li>Conferma che lo Xenopus ha perso la sua risposta al dolore pizzicando il piede 15 minuti nell'eutanasia. Se l'animale è reattivo, riportarlo alla soluzione di eutanasia fino a quando questa risposta non viene persa.</li>
	<li>Pesare lo Xenopus ed effettuare eventuali misurazioni aggiuntive necessarie prima del campionamento.</li>
	<li>Utilizzando un ago da 31 G, iniettare X. laevis con 250 μL e X. tropicalis con 100 μL di 180 U/mL di eparina in PBS (dal punto 1.3) nella muscolatura di ciascun arto anteriore.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 1 mL/g del peso animale di 54 U/mL di eparina in PBS perfufato. Gli individui più esperti con questo protocollo possono scoprire che è necessario meno media per completare la perfusione.</li>
	<li>Utilizzare un ago ipodermico da 22 G per perfondere X. laevis e un ago ipodermico da 25 G per X. tropicali s. Smussare l'ago di perfusione tagliando la punta con tronchesi (Figura 1)14. NOTA: Questo riduce la probabilità che l'ago penetri attraverso il ventricolo se spostato. Oltre a smussare, l'ago può essere leggermente macinato con una pietra o una lima affilante, ma rimanendo comunque abbastanza affilato da perforare il ventricolo.</li>
	<li>Preparare la pompa attaccando l'ago tagliato e facendo circolare 54 U/mL di perfusato di PBS eparinizzato (dal punto 1.8). Assicurarsi di eliminare tutte le bolle d'aria dal tubo per eliminare la possibilità di embolia d'aria, che porta a una diminuzione dell'efficienza di perfusione o al guasto (vedere Tabella 1). Mantenere il mezzo di perfusione sul ghiaccio per tutta la durata della procedura.</li>
	<li>Se la pompa non è programmabile, con l'ago in posizione, misurare il volume pompato del fluido con le diverse impostazioni per determinare quali impostazioni sono più vicine a 5 mL/min e 10 mL/min. Queste portate saranno utilizzate indipendentemente dalla specie. Se la pompa di perfusione è programmabile, calibrarla con l'ago in posizione, seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Posizionare la superficie di dissezione (vassoio o foglio di schiuma) su un'inclinazione all'interno di un contenitore secondario o disporla per facilitare il drenaggio del sangue.</li>
	<li>Una volta che la rana è stata nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e ricontrollare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzico del piede.</li>
	<li>Posizionare la rana sul dorso e fissare ogni arto (Figura 2). Se è necessario preservare il tessuto degli arti, è possibile posizionare spilli sottili attraverso le dita o graffette a forma di U intorno agli arti.</li>
	<li>Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi. (Figura 2)</li>
	<li>Utilizzare una pinza per afferrare la linea alba e allontanarla dalla cavità celomica (Figura 3). Usa con attenzione le forbici per tagliare la muscolatura. Fai due lembi fuori dalla parete della cavità e taglia o appunta tutti i lembi fuori strada.</li>
	<li>Utilizzare le forbici da dissezione per tagliare le ossa coracoidi e tagliare via il tessuto in eccesso per ottenere un migliore accesso al cuore (Figura 3).</li>
	<li>Il cuore dovrebbe ancora battere. Se il cuore ha smesso di battere prima della perfusione, notare che la freschezza del campione è stata compromessa.</li>
</ol>2. Perfusione
<ol><li>Identificare lo stomaco e spostarlo delicatamente in modo che sia sopra il lobo sinistro del fegato (alla destra dello spettatore), con la sua vascolarizzazione visibile per tutta la durata della procedura. Identificare un polmone e afferrarlo per la punta usando una pinza tissutale. Tirare il polmone all'esterno della cavità celomica e fissarlo attraverso la punta (Figura 4). Fallo delicatamente, poiché i vasi sanguigni rotti non si fondono bene. Nota se il sangue è visibile all'interno del lobo, in quanto ciò influenzerà la capacità di determinare il completamento della procedura.</li>
	<li>Prendere un'immagine della cavità celomica per valutare meglio l'efficienza della perfusione e potenzialmente identificare i tessuti anomali in un secondo momento.</li>
	<li>Identificare il pericardio sottile e tirarlo insegnato con una pinza tissutale (Figura 5). Perforare delicatamente il pericardio usando la punta delle forbici per iridectomia, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle tre camere del cuore.</li>
	<li>Utilizzare una pinza per afferrare delicatamente il ventricolo dal suo apice. Applicare una pressione limitata in modo che vi sia spazio sufficiente tra le superfici di trazione della pinza per il passaggio dell'ago di perfusione (Figura 6).</li>
	<li>Inserire l'ago attraverso la chiusura della pinza nella camera del ventricolo, facendo attenzione a non perforare attraverso il ventricolo (Figura 7). Bloccare la pinza tissutale in posizione utilizzando un supporto per aghi utilizzando un emostato. NOTA: Questa tecnica stabilizza la posizione dell'ago, che è ancora affilato. Anche il serraggio dell'ago direttamente al ventricolo causerà danni inutili, rendendo più difficile il riserraggio in caso di necessità (vedere Tabella 1).</li>
	<li>Avviare il flusso della pompa a circa 5 ml/min. Le tre camere del cuore e del tronco arterioso si ingorgeranno (Figura 8; vedi Tabella 1).</li>
	<li>Con le forbici, lanciare con attenzione il padiglione auricolare destro (alla sinistra dello spettatore); Il sangue si riverserà. Impostare la portata a 5 ml/min o aumentarla a 10 ml/min.</li>
	<li>Continuare fino a quando la vascolarizzazione dello stomaco sbianca (vedi Tabella 1), quindi lanciare il padiglione auricolare sinistro del cuore (alla destra dello spettatore). Se la portata è ancora di 5 ml/min, aumentarla a circa 10 ml/min.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di trasferimento per sciacquare la cavità celomica nei mezzi di perfusione, per aiutare a mantenere la visibilità e per valutare meglio il colore del perfusato che scorre dai padiglioni auricolari.</li>
	<li>Tenere l'ago in posizione fino a quando il perfusato che scorre dai padiglioni auricolari è chiaro (vedere Tabella 1) e il polmone ha perso la sua tonalità rossa (vedere Tabella 1; Figura 9).</li>
</ol>

Perfusione sanguigna nelle rane artigliate africane per trascrittomica e proteomica

<ol><li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog%2C+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li>
<li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis+Daudin%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li>
<li>Miodoński, A. J., Bär, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+%28Rana+temporaria%2C+Rana+esculenta%29.+Scanning+electron-microscopic+%28SEM%29+study+of+microcorrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li>
<li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).</li>
<li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus%3A+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li>
<li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).</li>
<li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%2C+2020+edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).</li>
<li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Clinics+of+North+America.+Exotic+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li>
<li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertebrate+heart%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li>
<li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+protocol+for+lizards%2C+including+a+method+for+brain+removal%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Questo protocollo descrive le tecniche tradizionali di dissezione per accedere alla cavità celomica. Anche altre tecniche sono accettabili, a condizione che causino danni minimi ai tessuti, che il cuore sia accessibile e che il polmone e lo stomaco siano visibili. Allo stesso modo, la maggior parte degli strumenti di dissezione elencati può essere facilmente sostituita con elementi comparabili.
Mentre sono stati fatti tentativi per ottimizzare l'efficacia di questa procedura, i risultati posso...

La perfusione di anfibi su tutto il corpo viene regolarmente completata ai fini della conservazione e della fissazione 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, queste procedure avvengono a una velocità che limita il numero di campioni freschi che possono essere prelevati per animale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un protocollo di perfusione sanguigna efficace in Xenopus, dando priorità alla velocità della tecnica. Il protocollo richiede meno di 10 minuti per animale per X. tropicalis e meno di 15 minuti per X. laevis animale. Le priorità secondarie sono la facilità di replica e l'uso di apparecchiature facilmente acquisibili in modo che i campioni di alta qualità possano essere ampiamente condivisi tra i laboratori Xenopus.
Le rane Xenopus sono ampiamente utilizzate nella ricerca biomedica per studiare i processi biologici e patologici fondamentali conservati tra le specie. Questo tetrapode ha una relazione evolutiva più stretta con i mammiferi rispetto ad altri modelli acquatici, avendo polmoni, un cuore a tre camere e arti con dita. La comunità internazionale utilizza efficacemente Xenopus per ottenere una comprensione più profonda delle malattie umane attraverso modelli approfonditi della malattia e analisi molecolare della funzione genica correlata alla malattia. I numerosi vantaggi di Xenopus come modello animale li rendono strumenti inestimabili per studiare le basi molecolari dello sviluppo umano e delle malattie; Questi vantaggi includono: grandi dimensioni di ovociti ed embrioni, alta fecondità, facilità di alloggiamento, rapido sviluppo esterno e facilità di manipolazione genomica. È stato stimato che Xenopus condivida ~ 80% dei geni della malattia umana identificati7.
Rispetto ai modelli di mammiferi popolari, Xenopus è un modello rapido ed economico, con la facilità di abbattimento del morfolino e la disponibilità di transgenici efficienti e mutazioni genetiche mirate utilizzando CRISPR8. La spettrometria di massa quantitativa e la trascrittomica monocellulare sono state applicate con successo agli embrioni di Xenopus9,10, ma un recente atlante cellulare di Xenopus laevis mostra che la composizione della maggior parte dei tessuti è dominata dai tipi di cellule del sangue 11. Sviluppando una tecnica che dissangua il tessuto a un ritmo rapido e utilizzando mezzi refrigerati, la freschezza del campione è minimamente influenzata dalla perfusione. Ciò è particolarmente importante per le applicazioni in cui l'obiettivo è quello di profilare l'espressione fisiologicamente imperturbata di mRNA o proteine.

<table><tbody><tr><td>5x Lente d'ingrandimento con luce LED e supporto</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>la luce non deve produrre calore</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Pinza da dissezione a punta fine</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione affilate piont, dritte 6,5"</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>I</td> fogli di polistirolo <td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>sono un'alternativa accettabile</td></tr><tr><td>Contenitore per eutanasia</td><td>Articolo in plastica negli Stati Uniti</td><td>. 2860</td><td>contenitori opachi alternativi accettabili</td></tr><tr><td>Coperchio del contenitore per eutanasia</td><td>Plastica USA</td><td>Articolo&nbsp; 3047</td><td></td></tr><tr><td>Perni di dissezione fine Living</td><td>Systems Instrumentation</td><td>PIN-#3</td><td></td></tr><tr><td>Aghi ipodermici per uso generale, 22 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>per X. laevis</td></tr><tr><td>Aghi ipodermici per uso generale, 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>per X. tropicalis</td></tr><tr><td>Eparina, mucosa</td> <td>intestinale suinaLe forbici per iride MilliporeSigma</td><td>37-505-410MG</td><td></td></tr> 6<tr><td>"</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>sono un'alternativa accettabile</td></tr><tr><td>Luer-adattatore da barbiglione maschio Luer con anello di bloccaggio</td><td>amazon.com</td><td>B09PTX6M2Z</td><td>dimensioni dipenderanno dal tubo della pompa utilizzato</td></tr><tr><td>Mayo-Hegar porta ago</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-966</td> le <td>pinze per zanzare sono un'alternativa accettabile</td></tr><tr><td>MS-222: Sincaina (precedentemente tricaina)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pompa dosatrice per liquidi peristaltici 5&ndash; 100 mL/min</td><td>amazon.com</td><td>B07PWY4SM6</td><td>qualsiasi pompa peristaltica in grado di pompare 5-10 mL/min è accettabile</td></tr><tr><td>Pietra per affilare</td><td>VWR</td><td>470150-112</td><td>opzionale; per aghi opacizzanti</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio, polvere, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per campioni, seghettate</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Perni a T per la dissezione</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe per insulina corte ultrafini,</td> tronchesi a filo <td>VWR</td><td>BD328438</td><td></td>da 31 G</tr><tr><td>, tronchesi a taglio laterale ultra affilati e potenti da 6 pollici</td><td></td><td>amazon.com B087P191LP</td><td></td></tr></tbody></table>

efficace perfusione sanguigna rapida in xenopus

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Gli xenopus sono stati potenti organismi modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre 100 anni. Qui viene definito un protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus, volto a una riduzione costante e drastica del sangue all'interno di tutti i tessuti. La perfusione viene effettuata inserendo un ago direttamente nel ventricolo del cuore e pompando soluzione salina eparinizzata tamponata fosfato (PBS) attraverso il sistema vascolare. La procedura può essere completata in circa 10 minuti per animale. Il sangue è dominato da poche proteine e tipi di cellule molto abbondanti, creando numerosi problemi poiché queste proteine mascherano la maggior parte delle altre molecole e tipi di cellule di interesse. La caratterizzazione riproducibile di tessuti adulti di Xenopus con proteomica quantitativa e trascrittomica monocellulare trarrà beneficio dall'applicazione di questo protocollo prima del prelievo d'organo. I protocolli per il campionamento dei tessuti sono definiti in documenti di accompagnamento. Queste procedure mirano alla standardizzazione delle pratiche in Xenopus di diverso sesso, età e stato di salute, in particolare X. laevis e X. tropicalis.

Dopo una perfusione riuscita, tutti i tessuti (escluso il fegato in Xenopus pigmentato) saranno nettamente più leggeri e meno saturi di sangue. I principali vasi sanguigni diventeranno meno evidenti (Figura 10) e i tessuti (escluso il fegato) risciacqueranno in modo pulito nel tampone dopo essere stati campionati. Mentre la corretta esecuzione del protocollo può essere confermata solo dalla qualità dei dati provenienti da campioni di tessuto dissanguato, diversi problemi tipici, le ...

Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.

Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Questa procedura è incentrata sull'utilizzo umano dei modelli di anfibi in modo da massimizzare l'efficienza. Le pratiche di standardizzazione possono essere applicate ai campioni prelevati e conservati presso la colonia di origine, mitigando i rischi di biosicurezza ed eliminando lo stress da trasporto degli animali. La profusione può essere completata rapidamente, massimizzando il tempo disponibile per campionare i tessuti mentre sono ancora freschi.Questa freschezza è particolarmente importante per la profilazione proteomica e trascrittomica. Questo protocollo è dettagliato ed esplicito, rendendolo utilizzabile per le persone con un'ampia varietà di background. Ciò facilita la condivisione di campioni di alta qualità tra i laboratori Xenopus.Insieme a questa tecnica di profusione, si sta lavorando a un protocollo altrettanto completo per il campionamento standardizzato di tutti i principali organi.

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Biologia

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l' Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura.

DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Normotermica ex situ cuore aspersione (ESHP), conserva il cuore in uno stato di semi-fisiologico, palpitante. Quando eseguito in una modalità di lavoro, ESHP offre l'opportunità di eseguire valutazioni sofisticate del donatore attuabilità di funzione e organo di cuore. Qui, descriviamo il nostro metodo per la valutazione delle prestazioni del miocardio durante ESHP.

Normotermica Ex Situ cuore aspersione in modalità di lavoro: valutazione della funzione cardiaca e il metabolismo

Qui viene presentato un protocollo di perfusione vascolare materna-fetale ex vivo per consentire la somministrazione di un articolo di prova nella vascolarizzazione materna e per valutare il trasferimento placentare di particelle xenobiotiche o agenti farmacologici oltre alle alterazioni in fisiologia placentare.

Perfusione ex vivo della placenta del roditore

Un protocollo è descritto per la perfusione in situ del corpo inferiore del topo, tra cui la vescica, la prostata, gli organi sessuali, l'osso, il muscolo e la pelle del piede.

Creazione in Situ Circuito Chiuso Perfusione di Organi Addominali Inferiori e Arti Hind in Topi

Questo articolo presenta una guida per il campionamento di sei organi significativi e diversi in Xenopus adulto a cui è possibile accedere rapidamente e facilmente: il ventricolo cardiaco, il lobo del fegato, il pancreas, i corpi adiposi, i reni accoppiati e la pelle.

Tecniche per il campionamento rapido di sei organi cruciali in Xenopus adulto

Questo protocollo introduce un metodo rapido per l'imaging vascolare tridimensionale quantitativo a montaggio intero utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso. L'efficacia del metodo è dimostrata utilizzando il sistema arterioso dell'arco faringeo del modello di embrione di pollo, con forze emodinamiche quantificate tramite fluidodinamica computazionale.

Imaging rapido ad alta risoluzione a montaggio intero della vascolarizzazione di piccoli animali per studi quantitativi

Questa è la prima parte di un protocollo di campionamento completo di Xenopus . I tessuti campionati sono il ventricolo cardiaco, il tronco arterioso, il lobo del fegato sinistro, la cistifellea, il polmone, il pancreas, la milza, la laringe, l'esofago, lo stomaco, l'intestino, i testicoli, i corpi adiposi, l'ovidotto, i reni accoppiati, il plesso sciatico, la pelle, il timo e l'intero occhio.

Tecniche efficienti per il campionamento completo di tessuti accessibili in Xenopus adulto

Qui, presentiamo un protocollo per un sistema di perfusione normotermico ex vivo open source e modificabile, progettato per superare l'alto costo e la limitata flessibilità delle piattaforme esistenti, consentendo un uso più accessibile, economico e iterativo nella ricerca biomedica preclinica.

Un sistema di perfusione normotermica open-source progettato per i ricercatori

Scopri il protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus laevis e Xenopus tropicalis per studi di trascrittomica e proteomica. Questo metodo ottimizza la qualità dei campioni tissutali e facilita la collaborazione tra laboratori.

Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus

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