Name: Un framework open-source per il calcolo della massa di molecole terapeutiche basate su anticorpi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Scopri il framework open-source mAbScale per calcolare con precisione le masse di anticorpi monoclonali, bispecifici e conjugati. Questo strumento migliora l'accuratezza nello sviluppo di terapie biologiche.

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Gli autori ringraziano Robert Schuster per l'assistenza nella verifica dei dati.

Il flusso di lavoro di alto livello per mAbScale è illustrato nella Figura 2. Ogni fase ha rami decisionali interni più sofisticati, cicli e combinatoria. Un flusso di lavoro algoritmico dettagliato che descrive il processo di calcolo è presentato nella Figura 1 supplementare. L'output dell'applicazione viene salvato in formato foglio di calcolo nella cartella selezionata dall'utente. Il file di output è costituito da più fogli di lavoro separati, che possono essere classificati come input dell'utente, calcoli del peso molecolare e riferimenti per le derivazioni di massa isotopiche medie (l'output di esempio è fornito in tabelle supplementari). I fogli di lavoro di input dell'utente includono le sequenze di amminoacidi proteici e altre informazioni inserite dall'utente, le masse elementari medie e le masse dei glicani, che vengono utilizzate per calcolare la composizione elementare e i diversi pesi molecolari. I fogli di calcolo del peso molecolare includono la composizione chimica di varie forme, la massa ridotta con e senza glicosilazione e modificazione chimica e la massa intatta con e senza glicosilazione e modificazione chimica. I fogli contenenti le masse di semi-anticorpi verranno generati automaticamente se l'utente inserisce due diversi HC e/o due diversi LC nella pagina di input dell'utente, poiché i semianticorpi sono impurezze primarie che devono essere identificate e quantificate rispetto all'eterodimero desiderato. È possibile accedere al codice sorgente di mAbScale tramite il seguente repository: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> Figura 2: Panoramica dei passaggi coinvolti nel calcolo delle composizioni elementari e delle masse utilizzando l'applicazione. La codifica a colori può essere utilizzata per collegarsi al flusso di processo descritto nella Figura 1 supplementare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Apertura dell'applicazione mAbscale
<ol><li>Aprire l'applicazione software facendo doppio clic sull'icona del file eseguibile.</li>
</ol>2. Inserimento della sequenza
<ol><li>Immettere le sequenze di catene pesanti e catene leggere nelle rispettive caselle di testo contrassegnate con 1 senza spazi.<ol><li>Per i bsAbs, aggiungi altre catene pesanti o leggere nella seconda serie di caselle di testo contrassegnate con 2. Lasciare 2 vuoti per gli anticorpi monoclonali con catene pesanti identiche e catene leggere.</li>
		<li>Selezionare le caselle di controllo N-Terminal Cyclization e/o C-Terminal Clipping , se queste varianti di terminali a catena pesante sono applicabili.</li>
		<li>Aggiungere eventuali modifiche chimiche, inclusi linker e payload per le molecole ADC, alle caselle di testo Heavy Chain Chem Mod e/o Light Chain Chem Mod.<ol><li>Specificate le modifiche come composizioni elementari, ad esempio CaCl2. La modifica verrà aggiunta alla rispettiva subunità o catena proteica. NOTA: Una composizione chimica può anche essere sottratta da una subunità o catena anteponendo alla composizione elementare un segno -. Ad esempio, -H2O sottrarrà una molecola d'acqua dalla composizione e dalla massa della subunità.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Specificare il numero di legami disolfuro
<ol><li>Specificare il numero di legami disolfuro nelle molecole proteiche nella casella di testo Numero totale di disolfuri.</li>
	<li>Immettere il numero di disolfuri di HC non ridotti nella casella di testo Disolfuri di HC non ridotti e il numero di disolfuri LC non ridotti nella casella di testo Disolfuri LC non ridotti, a seconda dell'entità della riduzione (completa o parziale). NOTA: L'analisi della massa ridotta delle subunità di anticorpi monoclonali comporta la riduzione/separazione delle catene pesanti e leggere legate al disolfuro.</li>
	<li>Se la glicosilazione è presente sulla catena leggera mAb, selezionare la casella di controllo La catena leggera è glicosilata .</li>
</ol>4. Impostazione della cartella di output ed esecuzione dell'applicazione
<ol><li>Fare clic sul pulsante Sfoglia per selezionare una cartella di output per la casella di testo Cartella di output .</li>
	<li>Immettere il nome del file di output senza estensione (viene salvato automaticamente come .xlsx) nella casella di testo File Excel (no ext). </li>
	<li>Fare clic sul pulsante Invia per avviare l'applicazione. Il file di output si trova nella cartella designata. NOTA: Le masse elementari e l'elenco dei glicani possono essere personalizzati modificando i file di testo delimitati Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1) e Glycan.csv (Supplementary Coding File 2), rispettivamente. Questi file devono essere inseriti nella stessa cartella del file eseguibile mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) per l'esecuzione dell'applicazione. L'applicazione verrà chiusa automaticamente dopo un'esecuzione. L'utente dovrà riavviare l'app se è necessario un secondo calcolo.</li>
</ol>

Uno strumento basato su Python per il calcolo accurato della massa di entità bioterapeutiche

<ol><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li>
<li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li>
<li>Wang, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+biology%2C+and+structure-based+therapeutics+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018).</li>
<li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li>
<li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li>
<li>Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosimilar%2C+biobetter%2C+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li>
<li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+LC-MS%3A+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up%2C+middle-up+and+intact+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li>
<li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li>
<li>Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li>
<li>Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobotham%2C+AC+%22Approaches+to+the+Purification%2C+Analysis+and+Characterization+of+Antibody-Based+Therapeutics%22">Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics</a>. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).</li>
<li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li>
<li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li>
<li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+%28IUPAC+Technical+Report%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ame2012+atomic+mass+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+C%22%5BJournal%5D)">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li>
<li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li>
<li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies%3A+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li>
<li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure%2C+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li>
<li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li>
<li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring%3A+Strategies+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li>
</ol>

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mAbScale fornisce un'interfaccia utente intuitiva con la flessibilità di modificare gli elementi costitutivi per i calcoli di massa ed elementari. Ci si aspetta che gli utenti abbiano una conoscenza di base della molecola bersaglio per utilizzare l'applicazione, derivare le masse corrette e interpretare i risultati. Ad esempio, il foglio di uscita di massa intatto o ridotto può essere travolgente a causa delle numerose file di masse intatte o ridotte, poiché il database predefinito dei glicani contiene 88 glicani legati ...

Negli ultimi due decenni, la bioterapia si è evoluta fino a diventare un pilastro della moderna industria farmaceutica. La pandemia di SARS-CoV2 e altre condizioni potenzialmente letali hanno ulteriormente aumentato la necessità di uno sviluppo più rapido e più ampio di molecole biofarmaceutiche 1,2,3.
Il peso molecolare bioterapeutico è fondamentale per l'identificazione della molecola, in combinazione con altri saggi analitici. Le masse delle subunità intatte e ridotte sono utilizzate durante tutto il ciclo di vita della scoperta e dello sviluppo come parte delle strategie di controllo volte a mantenere la qualità, come descritto nel QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Lo sviluppo analitico nell'industria biofarmaceutica si basa in larga misura sulle misurazioni di massa per l'analisi della massa intatta e la caratterizzazione profonda utilizzando la mappatura dei peptidi o il monitoraggio con il metodo multi-attributo (MAM). Al centro di queste tecniche che utilizzano le moderne piattaforme di spettrometria di massa (MS) c'è la capacità di fornire misurazioni di massa accurate ad alta risoluzione (HR/AM). La maggior parte degli strumenti HR/AM produce precisioni di massa nell'intervallo di 0,5-5 ppm, che scalano con l'intervallo di massa. La capacità di misurare con precisione le masse per le grandi molecole intatte consente l'identificazione rapida e sicura delle terapie a grandi molecole. Poiché la risoluzione isotopica non può essere raggiunta utilizzando le condizioni sperimentali tipiche per molecole di grandi dimensioni (&gt;10 kDa), è necessario calcolare le masse medie per il confronto e l'identificazione 5,6.
Un tipico spettro di massa di proteine intatte o subunità rappresenta il profilo complessivo della proteoforma, che contiene informazioni composite sulle varie forme molecolari risultanti da modificazioni post-traduzionali (PTM) e da eventuali differenze di struttura primarie, come clip o varianti di sequenza. La natura relativamente semplice e ad alta produttività di queste misure le rende interessanti per la caratterizzazione e come controlli di monitoraggio in-process 7,8. L'analisi dei dati per questi esperimenti di solito richiede all'utente di definire lo spazio di ricerca per le forme molecolari (gamma di PTM o altre forme molecolari). Per le proteine glicosilate, questo spazio di ricerca è in gran parte guidato dall'eterogeneità dei glicoformi. Le combinazioni di più PTM, le configurazioni del legame disolfuro e altre variazioni lungo la struttura primaria rendono il calcolo di tutte le possibili forme molecolari un compito noioso. Pertanto, il calcolo manuale delle possibili forme molecolari è un processo che richiede tempo e risorse con un alto potenziale di errore umano.
Qui presentiamo uno strumento di calcolo della massa che è stato sviluppato considerando le caratteristiche più importanti delle molecole bioterapeutiche, come mAbs, bsAbs, ADC, ecc. Lo strumento consente di incorporare facilmente le variabili dello spazio di ricerca per il calcolo coerente delle masse e delle composizioni elementari. La natura modulare di questo strumento consentirà di svilupparlo ulteriormente e di applicarlo al calcolo della massa e alla corrispondenza della massa per altre modalità.
Il modulo GUI consente all'utente di specificare l'input per il calcolo della massa, come mostrato in Figura 1; In particolare, l'utente inserisce sequenze di amminoacidi di una sola lettera per catene di anticorpi leggeri e pesanti. Le modifiche comuni per la ciclizzazione N-terminale a catena pesante e il clipping della lisina con terminale C sono incluse come caselle di controllo. Inoltre, la formula chimica/composizione elementare può essere aggiunta/sottratta da queste catene proteiche attraverso la rispettiva casella di testo Chem Mod . Ciò consente all'utente la flessibilità di aggiungere una composizione elementare che include più modifiche post-traduzionali o un carico utile di piccole molecole nel caso di un ADC. Poiché la maggior parte degli anticorpi monoclonali terapeutici sono progettati per rimuovere i siti di glicosilazione nella catena leggera, la glicosilazione nella catena leggera è lasciata facoltativa e può essere specificata utilizzando una casella di controllo sulla GUI.
Una variante tipica dell'analisi della massa intatta per gli anticorpi è un'analisi di massa a subunità ridotte, in cui la catena leggera viene staccata dalla catena pesante riducendo i legami disolfuro intercatena. A seconda della forza dell'agente riducente utilizzato, i legami disolfuro intracatena possono essere scissi o meno. Gli utenti hanno la flessibilità di inserire il numero totale di legami disolfuro a seconda del sottotipo di IgG o nel caso di un ADC9 coniugato con cisteina.
L'applicazione calcola le masse in modo bottom-up, in cui le composizioni elementari vengono prima calcolate per le singole catene pesanti e catene leggere. Successivamente, la ciclizzazione N-terminale della catena pesante (HC) Lys-clipping viene presa in considerazione regolando le composizioni elementari calcolate. Eventuali modifiche chimiche specificate vengono quindi applicate alle catene pesanti e/o leggere. A seconda del tipo di analisi e dei modelli di legame disolfuro specificati dall'utente, il numero di idrogeni viene regolato per le due catene polipeptidiche. Le masse glicosilate HC e catene leggere (LC) (facoltative) vengono calcolate in base all'input dell'utente. Infine, vengono combinate più masse HC e LC e i numeri di legame disolfuro vengono aggiornati automaticamente per il calcolo della massa intatta.
Con molecole più grandi come le proteine intatte, le masse monoisotopiche non possono essere misurate a causa del difetto di massa additivo quando si utilizzano spettrometri di massa con il tipico potere risolutivo. Invece, le masse nominali o medie sono misurate o riportate 5,10,11,12,13. Le masse elementari medie possono variare in base alla fonte utilizzata per le masse curate14,15. Sebbene le differenze nelle masse elementari possano essere piccole, possono sommarsi a valori significativi per i calcoli del peso molecolare di grandi molecole. Le masse elementari medie utilizzate per impostazione predefinita nell'applicazione software sono mostrate nella Tabella supplementare 1. Per gli ambienti regolamentati come il campo della ricerca e sviluppo biofarmaceutico (R&amp;S), è importante mantenere masse molecolari coerenti perché le variazioni delle masse possono implicare modifiche all'entità molecolare durante i depositi normativi. Per garantire la coerenza nell'uso delle masse elementari, un dizionario delle masse elementari è incluso nello strumento software come file di testo con valori separati da virgole (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Allo stesso modo, è incluso un elenco curato di composizioni di glicani tipicamente viste sugli anticorpi monoclonali: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Entrambi i file vengono salvati nella stessa cartella di un'applicazione eseguibile e possono essere modificati dall'utente per utilizzare uno specifico elenco di masse elementari o una libreria di glicani.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> Figura 1: Interfaccia GUI per l'applicazione mAbScale. Il modulo GUI consente all'utente di specificare l'input per il calcolo della massa. L'utente inserisce sequenze di amminoacidi di una sola lettera per le catene di anticorpi leggeri e pesanti. Le modifiche comuni per la ciclizzazione N-terminale a catena pesante e il clipping della lisina C-terminale sono incluse come caselle di controllo. Le formule chimiche/composizioni elementari possono essere aggiunte/sottratte tramite la rispettiva casella di testo Chem Mod . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Sistema Acquity UPLC&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>Sistema modulare</td></tr><tr><td>Coniugato anticorpo-farmaco (ADC)</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>Molecola proprietaria</td></tr><tr><td>BEH 200 SEC colonna&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>176003904</td><td></td></tr><tr><td>MAb bispecifico</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>Molecola proprietaria</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics, Cupertino, CA</td><td>https://proteinmetrics.com/byos/ Versione 4.5</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW</td><td>GPMAW</td><td>http://www.gpmaw.com/</td><td></td></tr> acqua <tr><td>di grado LC-MS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>mAb standard&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>186009125</td><td>Waters Humanized mAb Mass Check Standard</td></tr><tr><td>mAbScale</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Apache License, versione 2.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa Xevo G2 Q-TOF</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>Sistema modulare</td></tr></tbody></table>

un framework open-source per il calcolo della massa di molecole terapeutiche basate su anticorpi

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

Le masse bioterapeutiche sono un mezzo per verificare l'identità e l'integrità strutturale. La spettrometria di massa (MS) di proteine intatte o subunità proteiche fornisce un semplice strumento analitico per le diverse fasi dello sviluppo biofarmaceutico. L'identità della proteina è confermata quando la massa sperimentale della MS è all'interno di un intervallo di errore di massa predefinito della massa teorica. Sebbene esistano diversi strumenti computazionali per il calcolo dei pesi molecolari di proteine e peptidi, non sono stati progettati per l'applicazione diretta a entità bioterapeutiche, hanno limitazioni di accesso a causa di licenze a pagamento o richiedono il caricamento di sequenze proteiche su server host. 
Abbiamo sviluppato una routine modulare di calcolo della massa che consente di determinare facilmente le masse medie o monoisotopiche e le composizioni elementari delle glicoproteine terapeutiche, compresi gli anticorpi monoclonali (mAb), gli anticorpi bispecifici (bsAb) e i coniugati anticorpo-farmaco (ADC). La natura modulare di questo framework di calcolo basato su Python consentirà in futuro l'estensione di questa piattaforma ad altre modalità come vaccini, proteine di fusione e oligonucleotidi, e questo framework potrebbe anche essere utile per l'interrogazione di dati di spettrometria di massa top-down. Creando un'applicazione desktop autonoma open source con un'interfaccia utente grafica (GUI), speriamo di superare le restrizioni relative all'uso in ambienti in cui le informazioni proprietarie non possono essere caricate su strumenti basati sul Web. Questo articolo descrive gli algoritmi e l'applicazione di questo strumento, mAbScale, a diverse modalità terapeutiche basate su anticorpi.

È stata selezionata una varietà di anticorpi monoclonali per rappresentare diversi tipi di anticorpi monoclonali. È stato selezionato uno standard di anticorpi monoclonali disponibile in commercio per rappresentare un anticorpo monoclonale convenzionale con catene pesanti identiche, catene leggere identiche e un sito di glicosilazione legato all'N nella regione Fc. Per ampliare l'utilizzo dell'applicazione sono stati scelti anche un anticorpo monoclonale con un'ulteriore glicosilazione legata all'azoto a catena leggera, ...

Questo articolo descrive l'uso di un'applicazione software, mAbScale, per il calcolo delle masse per terapie proteiche basate su anticorpi monoclonali.

Un framework open-source per il calcolo della massa di molecole terapeutiche basate su anticorpi

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

La sfida con il calcolo accurato della massa per le grandi molecole proteiche è il difetto di massa associato alla misurazione. Di conseguenza, è possibile misurare solo le masse medie. Piccole differenze di massa elementare possono accumularsi causando discrepanze significative in grandi molecole paraterapeutiche come gli anticorpi monoclonali.Il nostro strumento affronta in modo esplicito la sfida nel calcolo della massa coerente per le terapie a base di anticorpi, come MAP, bispecifici e coniugati farmaco-anticorpo. I ricercatori nello spazio di sviluppo biofarmaceutico commerciale devono fare affidamento su calcoli manuali o strumenti che non dipendono dalla comunicazione con server esterni a causa del coinvolgimento di informazioni proprietarie. Gli strumenti esistenti richiedono una licenza o non sono costruiti tenendo conto delle esigenze specifiche dello sviluppo biofarmaceutico.MapScale offre un'interfaccia user-friendly e un framework open source adattabile per utenti e sviluppatori. Supporta il mantenimento di più versioni delle masse elementari e degli elenchi di modifica e consente la condivisione degli elenchi per mantenere la coerenza nei calcoli. Il codice può essere condiviso a livello aziendale utilizzando server interni o distribuzione basata su cloud con accesso controllato per proteggere le informazioni proprietarie.

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In questo video, dimostriamo l'uso della fotometria di massa per studiare le interazioni antigene-anticorpo in una camera di flusso. La luce focalizzata si diffonde in modo diverso in base alla massa delle molecole. Un rivelatore raccoglie la luce diffusa e genera il modello di interferenza sotto forma di punti di varia intensità, che si correlano con le masse molecolari.

Fotometria di massa per studiare le interazioni antigene-anticorpo a livello di singola molecola

Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Peptidi virali-derivati accoppiati a anticorpo-coniugati (ACs) è un approccio guadagnando slancio a causa del potenziale di trasporto molecolare payload con accumulo di cellule aumentata del tumore. Utilizzando metodi comuni per valutare la coniugazione di peptide, AC e accumulo intracellulare di payload e targeting tumorale, questo protocollo consente ai ricercatori durante le fasi iniziali di sviluppo chiave.

Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale

Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.

Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

Che incorporano un derivato del ciclopropene di lisina in anticorpi permette il collegamento di site-specific, rapido ed efficiente delle molecole tetrazine-cuscinetto per generare i coniugati di anticorpo-farmaco.

Codifica genetica di un aminoacido Non-canonica per la generazione di anticorpo-farmaco coniugati attraverso una reazione di Bioorthogonal veloce

Qui, descriviamo i protocolli per l'analisi e la visualizzazione della struttura e costituzione di repertori di anticorpo intero. Ciò comporta l'acquisizione di vaste sequenze di RNA di anticorpo usando il sequenziamento di nuova generazione.

Identificazione dei Mouse e dei repertori di anticorpo umano mediante sequenziamento di nuova generazione

Questo studio mirava a presentare una strategia per identificare le interazioni farmaco-peptidico. La strategia prevede la biopanning di peptidi corti che riconoscono farmaci basati su un biosensore QCM (Quartz-Crystal Microbalance), seguito da un'analisi bioinformatica per valutare quantitativamente le informazioni ottenute per il riconoscimento del farmaco e l'annotazione dei siti di legame farmacologico sulle proteine.

Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

Qui, presentiamo un metodo per identificare i composti che modulano il meccanismo ADCC, un importante meccanismo di uccisione delle cellule tumorali degli anticorpi antitumorali. L'effetto citotossico delle cellule NK è misurato negli sferoidi delle cellule del cancro al seno in presenza di Trastuzumab. L'analisi delle immagini identifica le cellule killer vive e morte e le cellule bersaglio negli sferoidi.

Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci

flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ​​ordinate e disordinate.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Scopri il framework open-source mAbScale per calcolare con precisione le masse di anticorpi monoclonali, bispecifici e conjugati. Questo strumento migliora l'accuratezza nello sviluppo di terapie biologiche.

Un framework open-source per il calcolo della massa di molecole terapeutiche basate su anticorpi

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