Name: Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Scopri l'analisi della densità mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale. Questo metodo quantitativo rivela alterazioni metaboliche tra ratti magri e obesi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Scuola di Medicina e dall'Istituto per la Ricerca sull'Obesità del Tecnologico de Monterrey. La Figura 3A è stata creata con il software Scientific Image and Illustration.

Analisi microscopica confocale dei mitocondri muscolari di ratto

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Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

I mitocondri sono organelli con un'elevata capacità di rimodellamento. Il loro contenuto, la loro densità e la loro distribuzione possono essere rapidamente modificati attraverso l'attivazione dei meccanismi di fusione e fissione mitocondriale, noti come dinamica mitocondriale1, e l'equilibrio tra i meccanismi di turnover mitocondriale: la biogenesi mitocondriale e la via di degradazione dei mitocondri specializzata, la mitofagia21,22. Il contenuto e la morfologia mitocondriale possono variare a seconda del tipo di cellula e dello stadio di sviluppo e possono essere rimodellati sotto diversi stimoli fisiologici e patologici 17,22,23,24. Pertanto, lo studio della morfologia mitocondriale è stato rilevante per oltre mezzo secolo25. In particolare, l'analisi dei mitocondri attraverso la microscopia elettronica è stata la tecnica standard applicata in molteplici studi26.
Gli studi di fluorescenza al microscopio confocale hanno acquisito rilevanza negli ultimi anni grazie alla loro capacità di imaging di mitocondri a diverse profondità di fibra, che potrebbero aiutare a comprendere meglio il ruolo dei mitocondri nel muscolo scheletrico in diverse condizioni adattative e disadattive27. In questo studio viene descritta una metodologia per l'analisi della densità e della distribuzione dei mitocondri nelle fibre muscolari scheletriche vive mediante microscopia confocale. Una delle principali sfide del lavoro con le fibre muscolari scheletriche vive è quella di evitare la contrazione dai processi di isolamento fino alla registrazione confocale mitocondriale. Per raggiungere questo obiettivo, viene utilizzata una soluzione ad alto contenuto di Mg e ATP Relax17 per mantenere le fibre rilassate per almeno 2 ore, il che dà il tempo sufficiente per eseguire il processo di isolamento delle fibre, il carico di fluorofori e l'acquisizione del segnale mitocondriale mediante microscopia confocale. Un punto critico del protocollo è l'ottenimento meccanico delle fibre poiché richiede alta precisione e tessuto fresco; Tuttavia, è possibile ottenere fasci di fibre vitali dal muscolo di ratto con questa tecnica precedentemente utilizzata e riportata28. L'ottenimento di fibre intatte permette di preservare il sarcolemma e l'ambiente intracellulare, mantenendo il crosstalk metabolico e funzionale tra le strutture cellulari28,29.
A differenza del lavoro con tessuti o cellule fisse, l'acquisizione di immagini fluorescenti per l'imaging di cellule vive mediante microscopia confocale consente il monitoraggio in tempo reale dell'effetto di diverse condizioni sperimentali. Il presente protocollo può essere utilizzato per esplorare i cambiamenti nella densità e nella distribuzione mitocondriale in tempo reale ed esplorare le differenze tra i gruppi sperimentali, come gli esempi qui presentati tra fibre derivate da Lean e Ob (Figura 3 e Figura 4). Va sempre considerato che l'imaging di cellule vive implica la standardizzazione di condizioni di lavoro ottimali con un danno cellulare minore. Il tempo di lavoro, la qualità delle soluzioni utilizzate, i parametri di acquisizione e l'esposizione dei laser devono essere finemente controllati. Di seguito, quindi, si riportano le considerazioni essenziali.
I mitocondri delle fibre muscolari non possono essere registrati interamente longitudinalmente dalla microscopia confocale a causa delle dimensioni della fibra e del danno della fibra che può essere causato da una lunga esposizione al laser. Tuttavia, con questa tecnica viene registrato un campione rappresentativo della fibra. Sebbene sia possibile registrare l'intero spessore della fibra muscolare scheletrica di un ratto mediante microscopia confocale, ciò implica un tempo di registrazione e un'esposizione al raggio laser più lunghi. Nel caso dei ratti di controllo, non sono stati riscontrati problemi con queste registrazioni. Tuttavia, le fibre provenienti da condizioni patologiche possono essere più suscettibili ai danni, come osservato nelle fibre dei ratti Ob. Di conseguenza, è preferibile acquisire una pila di immagini confocali rappresentative ottenute a diverse distanze Z. Quando viene registrata solo una sezione dello spessore della fibra, si consiglia di prelevare la pila alla stessa profondità su tutte le fibre testate poiché la distribuzione e la densità mitocondriale possono variare in base alla sua posizione all'interno della fibra. L'acquisizione del segnale ad una profondità superiore a 15 μm è raccomandata per ottenere immagini confocali rappresentative dell'FMI, evitando le popolazioni SSM che si trovano vicino alla periferia.
Durante l'acquisizione confocale, è necessario tenere conto di alcune importanti considerazioni. Innanzitutto, la selezione dell'obiettivo a immersione considerando l'ingrandimento, l'elevato NA e il mezzo di immersione. Poiché le cellule sono mantenute in un mezzo di incubazione idrofilo, l'indice di rifrazione del mezzo di incubazione e immersione deve essere simile per ottenere un buon segnale e scansionare in profondità nel tessuto. Di solito si ottiene utilizzando una lente dell'obiettivo a immersione in acqua. Le immagini confocali della Figura 3 e della Figura 4 sono state acquisite con un obiettivo a immersione in acqua 20x, 0,7 NA. Questo obiettivo consente di registrare la fibra in tutta la sua profondità, ma è stata decisa la scansione a 15, 18 e 21 μm poiché è possibile ottenere immagini confocali rappresentative dell'IMF con segnale ad alta intensità di fluorescenza e danni minori alla fibra. Altri ingrandimenti, come il 40x e l'olio come mezzo di immersione, possono essere presi in considerazione, ma devono essere valutati.
In secondo luogo, la dimensione dei pixel per l'acquisizione delle immagini viene calcolata in base al teorema di Nyquist, che consente la selezione di una dimensione dei pixel appropriata che evita il sovracampionamento (maggiore esposizione laser) e il sottocampionamento (porta a una minore risoluzione)30. Il calcolo dipende dalle caratteristiche della lente dell'obiettivo selezionata e dalla lunghezza d'onda (~90 nm). Può essere regolato con lo zoom; Pertanto, solo un'impostazione di zoom fornisce una dimensione ottimaledei pixel 30. Tuttavia, in pratica, lo zoom dipende anche dall'area del campione da analizzare. Pertanto, trovare l'equilibrio consente di lavorare con una dimensione dei pixel che si avvicina di più al criterio di Nyquist e che si adatta anche all'area da analizzare. La Figura 3 e la Figura 4 sono state acquisite con una dimensione dei pixel di 150 e 190 nm, che ha permesso di analizzare l'intera larghezza della fibra che è ~50-80 μm.
In terzo luogo, è necessario utilizzare un diametro stenopeico appropriato che impedisca alla luce sfocata di raggiungere il rilevatore. Tipicamente, 1 Airy è considerata la dimensione ottimale del foro stenopeico poiché consente la rilevazione di ~80% dei fotoni provenienti dal piano di fuoco30. Tuttavia, alcuni campioni biologici colorati che mostrano bassi livelli di fluorescenza richiedono un aumento del foro stenopeico30. Le immagini confocali della Figura 3 e della Figura 4 sono state acquisite con una dimensione del foro stenopeico di 3 Airy a causa di un segnale basso catturato con un Airy inferiore. È importante considerare che l'aumento dell'intensità del segnale derivante dall'aumento della dimensione del foro stenopeico porta alla riduzione della risoluzione a causa dell'aumento della luce catturata fuori fuoco. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare una dimensione del foro stenopeico il più vicino possibile a 1 ariosa.
Se adeguatamente acquisite, le immagini confocali possono essere elaborate per ottenere informazioni quantitative sulla densità e la distribuzione mitocondriale. Indipendentemente da ciò, la fase critica di elaborazione dell'immagine di soglia deve essere eseguita prima dell'analisi per migliorare la quantificazione del segnale. Durante questo passaggio cruciale, viene definito il valore dell'intensità di fluorescenza che separa i pixel positivi per i mitocondri da quelli dello sfondo. La soglia può essere definita da un adattamento gaussiano del picco che rappresenta i mitocondri quando l'istogramma dell'immagine mostra due picchi, uno corrispondente allo sfondo e l'altro ai mitocondri. Tuttavia, non sempre si ottiene una distribuzione bimodale in ciascuna delle immagini, quindi è necessario applicare altri metodi di soglia.
In questo protocollo viene descritta l'implementazione della soglia di Otsu, che è un metodo non parametrico e non supervisionato progettato per trovare il valore di soglia quando i due picchi non sono separati o sono presenti altri picchi31. Otsu può essere facilmente applicato utilizzando una piattaforma open-source per l'analisi di immagini biologiche; Tuttavia, è possibile testare altri metodi di soglia. Lo stesso metodo di soglia deve essere applicato a tutte le immagini confocali e deve essere calcolato indipendentemente per ciascuna immagine confocale. L'applicazione della soglia a un intero stack porta a risultati errati. Una volta ottenute le immagini binarie dopo il processo di soglia, l'analisi della densità mitocondriale e della FFT può essere facilmente effettuata seguendo le istruzioni descritte in questo protocollo. Tuttavia, quando si eseguono entrambe le analisi, è necessario prestare attenzione per evitare di includere nuclei e capillari, in quanto ciò comporterebbe errori di quantificazione. Per quanto riguarda la densità, è sufficiente sottrarre i pixel, ovvero l'area occupata dai nuclei o dai capillari, dai pixel o dall'area totale da analizzare. Inoltre, quando si esegue l'analisi FFT, è necessario verificare che il segnale mitocondriale sia dritto. Al contrario, quando il segnale mitocondriale è inclinato, può produrre profili che non rappresentano la distribuzione longitudinale mitocondriale, producendo dati errati sullo spettro FFT. Inoltre, è possibile applicare una fase di pre-elaborazione per ridurre il rumore nelle immagini. Questo protocollo descrive due fasi di pre-elaborazione facoltative utilizzando un filtro mediano e la deconvoluzione 2D. Gli effetti di questi metodi di pre-elaborazione sull'immagine e sul contenuto di densità mitocondriale sono presentati nella Figura supplementare S1. È importante considerare che, sebbene queste pre-elaborazioni possano migliorare la qualità dell'immagine, possono anche comportare la perdita di alcuni dettagli dell'immagine. Pertanto, devono essere utilizzati con cautela e applicati in modo coerente a tutte le immagini analizzate.
Nonostante i suoi vantaggi, la microscopia confocale è limitata da una risoluzione laterale (XY) di 180-250 nm quando si verificano le condizioni ottimali per l'acquisizione32. Il diametro mitocondriale è ~200-700 nm, vicino al limite di diffrazione della microscopia confocale; pertanto, le strutture sub-mitocondriali non possono essere adeguatamente rilevate33 e non possono essere valutate mediante analisi di densità e FFT mostrate in questo protocollo. Altre tecniche di microscopia a super-risoluzione, come la microscopia stocastica a ricostruzione ottica (STORM), la nanoscopia a deplezione di emissione stimolata (STED) o la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), possono essere esplorate per risolvere le strutture sub-mitocondriali32. In questo protocollo, le immagini confocali dei mitocondri sono ottenute utilizzando il fluoroforo TMRE, che dipende dal potenziale di membrana mitocondriale. Pertanto, l'intensità della fluorescenza mitocondriale può variare in base al loro potenziale di membrana. Prima dell'analisi dei dati viene eseguito un processo di soglia per superare questo problema. Tutti i pixel al di sopra di una soglia definita sono considerati positivi per il segnale mitocondriale indipendentemente dal loro valore di fluorescenza. Tuttavia, va notato che i mitocondri con un potenziale di membrana molto basso non possono essere risolti con questa tecnica. Pertanto, si raccomandano studi complementari sulla quantificazione del contenuto proteico mitocondriale. Un vantaggio dell'utilizzo di TMRE è che le immagini confocali possono essere utilizzate anche per l'analisi del potenziale di membrana mitocondriale, ma è necessario eseguire controlli adeguati con agenti di disaccoppiamento come il carbonilcianuro-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP). Inoltre, le istruzioni per l'analisi della densità e della distribuzione mitocondriale possono essere ottenute utilizzando indicatori fluorescenti verdi per i mitocondri, che caricano i mitocondri indipendentemente dal loro potenziale di membrana, ma la strategia di incubazione e le impostazioni di acquisizione confocale devono essere standardizzate.
Dato che la struttura dei mitocondri è correlata a funzioni mitocondriali e cellulari essenziali, il protocollo qui descritto può fornire preziose informazioni sul loro rimodellamento durante la malattia o da un particolare insulto da stress. Potrebbe contribuire a una migliore comprensione delle funzioni chiave del muscolo scheletrico governato dai mitocondri, come la produzione di energia, o in cui i mitocondri svolgono un ruolo importante nell'interazione con altri organelli, come l'accoppiamento contrazione-metabolismo. Seguire le istruzioni del protocollo consente di stimare la densità e la distribuzione mitocondriale nel muscolo scheletrico vivo. Le fasi del protocollo sono suddivise in tre fasi principali incentrate sulla dissezione del fascio muscolare scheletrico, sulla scansione al microscopio confocale e sull'analisi delle immagini, in cui sono incluse istruzioni dettagliate e considerazioni importanti. In particolare, il protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per esplorare ulteriori passaggi Z per la ricostruzione mitocondriale completa all'interno della fibra in base alle esigenze dell'utente. Ad esempio, l'immagine confocale e le fasi di analisi possono essere testate per studiare strutture cellulari con distribuzione simile, come la TT in campioni vivi e fissi.

I mitocondri formano reti altamente dinamiche che sono regolate principalmente dall'equilibrio tra il loro allungamento (fusione) e frammentazione (fissione)1,2, che sono modulate dall'espressione e dall'attività di proteine come la Mitofusina 1 e 2 (Mfn1 e Mfn2), e l'atrofia della proteina ottica 1 (Opa1), che regolano la fusione della membrana mitocondriale esterna e della membrana interna, rispettivamente 1,2. La proteina correlata alla dinamina (Drp1) regola prevalentemente la fissione mitocondriale quando è fosforilata nel Ser6163.
Nel muscolo scheletrico, è stato ben stabilito che la rete mitocondriale è organizzata in sottopopolazioni strutturalmente ben definite in base alla loro vicinanza a diverse regioni cellulari (miofibrille, sarcolemmi e nuclei)4,5. I mitocondri situati proprio sotto il sarcolemma sono chiamati mitocondri subsarcolemmali (SSM), quelli situati tra i filamenti contrattili sono chiamati mitocondri intermiofibrillari (IMF) e la sottopopolazione mitocondriale intorno ai nuclei è chiamata rete mitocondriale perinucleare (PMN). Inoltre, è stato suggerito che queste sottopopolazioni mitocondriali abbiano funzioni regionali-specifiche e siano metabolicamente specializzate 4,5.
Il mantenimento dell'omeostasi energetica cellulare, che consente la funzione metabolica e contrattile, dipende in larga misura dall'interazione e dalla comunicazione su siti specifici attraverso la rete mitocondriale (ad esempio, l'interazione IMF e SSM)4,6. Oltre alle interazioni della rete mitocondriale, il mitocondrio può interagire anche con altri organelli, formando complessi strutturali e funzionali. A questo proposito, è stato dimostrato che l'IMF può essere localizzato adiacente al reticolo sarcoplasmatico (SR) e in prossimità delle unità di rilascio di Ca2+ (CRU), formate dai tubuli trasversali (TT)7. Questo fatto è rilevante a causa del ruolo dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ nella regolazione della sintesi di ATP e dell'apoptosi. Recentemente, è stato anche suggerito un potenziale ruolo nella regolazione dei transienti citosolici di Ca2+ 8.
Le TT sono invaginazioni di sarcolemmi che hanno una distribuzione periodica lungo l'asse longitudinale dei cardiomiociti e delle fibre muscolari scheletriche 9,10, simile alla distribuzione IMF 5. I cambiamenti nella distribuzione delle TT hanno importanti implicazioni fisiologiche, dato il loro ruolo nella funzione contrattile. Tuttavia, questi cambiamenti sono stati valutati principalmente nei cardiomiociti. L'utilizzo dell'analisi FFT (Fast Fourier Transform) consente la conversione di segnali periodici dal dominio della distanza al dominio della frequenza, ottenendo uno spettro FFT che indica la frequenza e la regolarità del segnale11,12,13. Sebbene vi siano prove che l'organizzazione della rete mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche sia essenziale per l'adattamento a diverse condizioni metaboliche, poiché durante la rigenerazione dopo una lesione muscolare14,15, la maggior parte delle analisi viene eseguita qualitativamente.
Inoltre, dato che la disfunzione mitocondriale è stata associata a diverse malattie legate al muscolo scheletrico (ad esempio, atrofia da disuso)2 e non muscolari, in particolare le malattie metaboliche, e la perdita associata di massa muscolare (ad esempio, atrofia)16, la valutazione quantitativa della rete mitocondriale e della distribuzione nel muscolo scheletrico assume rilevanza. Recentemente, una differenza significativa nella distribuzione longitudinale dei mitocondri delle fibre muscolari gastrocnemie tra un gruppo obeso (Ob; Zucker fa/fa ratti), e un gruppo magro (Lean; Zucker +/+ ratti) è stato identificato attraverso FFT17. Questo studio ha dimostrato l'utilità della FFT nell'analisi della distribuzione mitocondriale. Pertanto, questo protocollo presenta una metodologia per studiare i mitocondri nelle fibre muscolari scheletriche vive da immagini ottenute mediante microscopia confocale a fluorescenza. La densità mitocondriale viene quantificata mediante la soglia di fondo e viene descritta anche l'analisi della distribuzione mitocondriale longitudinale mediante analisi FFT. Nella Figura 1 viene presentato uno schema del flusso di lavoro.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato sale disodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti in vetro borosilicato</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software per microscopio confocale Leica Application Suite&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>Creatina fosfochinasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Acido aspartico potassio sat emiidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&acuto; Acido N&acuto;-tetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0.7 IMM obiettivo&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Acido malico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico sale monosodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UC Davis Health</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma open source per l'analisi di immagini biologiche Fiji&nbsp;</td><td>Pubblico, gestito dal gruppo Eliceiri/LOCI, dal gruppo Jug e dal laboratorio Tomancak. Fiji</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>Fosfocreatina sale disodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>PSF Generator (PSF_Generator.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di calcolo Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, estere etilico</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

Il mitocondrio è un organello che può essere allungato, frammentato e rinnovato in base alle esigenze metaboliche delle cellule. Il rimodellamento della rete mitocondriale consente ai mitocondri sani di soddisfare le richieste cellulari; Tuttavia, la perdita di questa capacità è stata correlata allo sviluppo o alla progressione di diverse patologie. Nel muscolo scheletrico, si osservano cambiamenti nella densità mitocondriale e nella distribuzione in condizioni fisiologiche e patologiche come l'esercizio fisico, l'invecchiamento e l'obesità, tra gli altri. Pertanto, lo studio della rete mitocondriale può fornire una migliore comprensione dei meccanismi legati a tali condizioni.
Qui, viene descritto un protocollo per l'imaging mitocondriale di fibre muscolari scheletriche vive di ratti. Le fibre vengono sezionate manualmente in una soluzione rilassante e incubate con un indicatore fluorescente di imaging su cellule vive dei mitocondri (estere etilico tetrametilrodamina, TMRE). Il segnale mitocondriale viene registrato mediante microscopia confocale utilizzando la modalità di scansione XYZ per ottenere immagini confocali della rete mitocondriale intermiofibrillare (IMF). Successivamente, le immagini confocali vengono elaborate mediante thresholding e binarizzazione. L'immagine confocale binarizzata tiene conto dei pixel positivi per i mitocondri, che vengono poi contati per ottenere la densità mitocondriale. La rete mitocondriale nel muscolo scheletrico è caratterizzata da un'alta densità di popolazione IMF, che ha una distribuzione longitudinale periodica simile a quella dei tubuli T (TT). La Fast Fourier Transform (FFT) è una tecnica di analisi standard eseguita per valutare la distribuzione delle TT che permette di trovare la frequenza di distribuzione e il livello della loro organizzazione. In questo protocollo viene descritta l'implementazione dell'algoritmo FFT per l'analisi della distribuzione mitocondriale longitudinale nel muscolo scheletrico.

Seguendo il presente protocollo, l'analisi della densità e della distribuzione dei mitocondri può essere ottenuta nel muscolo scheletrico vivo. Il protocollo è suddiviso in tre fasi principali: dissezione del fascio muscolare scheletrico, scansione al microscopio confocale e analisi delle immagini. La panoramica del flusso di lavoro è illustrata nella Figura 1. La Figura 2A mostra un muscolo gastrocnemio di ratto intero in una capsula di Petri, che segna la testa laterale da cui si ottengono le fibre, mentre la Figura 2B mostra i fasci di fibre nella soluzione Relax. Mediante microscopia confocale, i mitocondri possono essere registrati lungo la profondità della fibra muscolare scheletrica viva utilizzando l'indicatore fluorescente TMRE. TMRE è un fluoroforo cationico lipofilo che viene selettivamente accumulato all'interno dei mitocondri in base al potenziale di membrana mitocondriale20.
Un'immagine confocale ottimale dell'IMF può essere ottenuta selezionando una distanza Z superiore a 15 μm di profondità all'interno della fibra (Figura 3A). La Figura 3B mostra immagini confocali XY rappresentative dei mitocondri carichi di TMRE acquisite lungo la distanza Z delle fibre muscolari gastrocnemie (da 15 a 21 μm). Le immagini confocali sono state elaborate mediante thresholding per trasformarle in immagini binarie per consentire l'analisi mitocondriale. La Figura 3B (pannello di sinistra) mostra una fibra di un ratto Lean esercitato. Rappresenta un record confocale previsto dei mitocondri delle fibre muscolari scheletriche poiché ha un modello coerente lungo la fibra. Al contrario, abbiamo selezionato una fibra da un ratto Ob (Figura 3B, pannello di destra) che mostra alterazioni sostanziali nel contenuto e nella distribuzione mitocondriale. La Figura 3C mostra la quantificazione dell'area delle fibre occupata dai mitocondri espressa come densità mitocondriale, ottenuta da ciascuna immagine binarizzata (mostrata nel pannello B). Come previsto, la fibra Ob presentava una densità mitocondriale inferiore. È stato quantificato in modo coerente lungo la distanza Z analizzata, che si osserva anche nella Figura 3D quando viene calcolata la densità mitocondriale per pila conforme alle tre immagini confocali acquisite a 15, 18 e 21 μm.
Analogamente all'analisi della densità mitocondriale, la scansione confocale di un indicatore fluorescente per l'imaging di cellule vive, come TMRE, consente di studiare l'organizzazione longitudinale dei mitocondri nel muscolo scheletrico vivo. L'IMF presenta un'organizzazione periodica in banda I vicina al TT7, che può essere analizzata da FFT per quantificare la frequenza del segnale mitocondriale e il livello di organizzazione17. La Figura 4 mostra le differenze nell'organizzazione dell'IMF riscontrate nei gastrocnemi derivati da ratti Lean e Ob e come la FFT permette di trovare i cambiamenti nella distribuzione del segnale mitocondriale. Le Figure 4A,B mostrano ROI longitudinali selezionate in posizione centrale e laterale nella fibra per l'analisi FFT. Prima di eseguire la FFT, viene calcolata la soglia per la sottrazione di background. Quindi, l'immagine viene binarizzata; Queste procedure eliminano le variazioni nei livelli di intensità della fluorescenza del segnale mitocondriale. L'immagine binaria fornisce il profilo grafico della distribuzione della fluorescenza necessario per eseguire la FFT.
La Figura 4C,D mostra le ROI selezionate nei pannelli A e B con i relativi profili di stampa (pannelli superiori). Dai profili del grafico, si possono osservare differenze nella distribuzione della fluorescenza tra le fibre derivate da ratti Lean e Ob, nonché le variazioni tra ROI all'interno della stessa fibra. Per ogni profilo di appezzamento, viene presentato il rispettivo spettro FFT (pannelli inferiori). Il picco dello spettro FFT massimo indica la frequenza FFT (asse X) della distribuzione del segnale mitocondriale lungo l'asse longitudinale. Può essere trasformato in un valore di distanza vicino a 2 μm nelle ROI laterali e centrali dal ratto Lean. In particolare, l'ampiezza FFT del picco è un indice della regolarità del segnale mitocondriale e i cambiamenti in questa ampiezza rivelano alterazioni nella distribuzione mitocondriale.
Le Figure 4E,F mostrano le differenze nello spettro FFT tra le fibre derivate da Lean e Ob in cui sono stati analizzati rispettivamente i ROI laterali e centrali. Nelle ROI laterali (Figura 4E) la frequenza della distribuzione longitudinale mitocondriale era simile nelle fibre magre e derivate da Ob; tuttavia, l'ampiezza del picco massimo di FFT nelle fibre derivate da Ob era più alta, il che è in accordo con la maggiore regolarità del segnale osservata nell'immagine in Figura 4B. Ciononostante, il ROI centrale (Figura 4F) dell'Ob è osservato come esempio di riduzione critica del picco FFT rispetto a Lean quando è presente un'importante alterazione della distribuzione mitocondriale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> Figura 1: Schema per l'analisi mitocondriale nel muscolo scheletrico mediante microscopia confocale. Questo schema riassume le fasi principali del protocollo in tre fasi separate. La prima fase, la dissezione dei fasci di fibre muscolari del gastrocnemio, è suddivisa in tre fasi successive, l'isolamento del muscolo gastrocnemio, seguito dalla dissezione meccanica del muscolo in fasci per effettuare infine una selezione visiva di quelli vitali. La seconda fase consiste nell'acquisizione di immagini di cellule vive mediante microscopia confocale, che consiste nell'incubazione con il fluoroforo (TMRE) per 20 minuti a temperatura ambiente per posizionare le fibre nella camera. Successivamente, vengono effettuate le impostazioni appropriate nel microscopio per condurre l'acquisizione delle immagini confocali. Durante la terza fase, vengono condotte l'elaborazione delle immagini confocali e l'analisi dei dati. A partire dall'elaborazione delle immagini, in cui è necessaria una soglia per generare immagini binarie da cui vengono eseguiti i calcoli della densità mitocondriale e la distribuzione mitocondriale per FFT. Abbreviazioni: TMRE = estere etilico di tetrametilrodamina; FFT = Trasformata di Fourier veloce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> Figura 2: Dissezione del fascio di muscolo scheletrico. (A ) Testa di gastrocnemio laterale di ratto sezionata (freccia nera) in una capsula di Petri con soluzione Relax. (B) Immagine rappresentativa dei fasci di fibre muscolari del gastrocnemio nella soluzione Relax prima del carico di TMRE. Abbreviazione: TMRE = estere etilico di tetrametilrodamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> Figura 3: Analisi della densità mitocondriale. (A) Illustrazione che rappresenta la distanza Z raccomandata per la scansione confocale dei mitocondri IMF nelle fibre muscolari scheletriche. (B) Serie di immagini confocali di mitocondri carichi di TMRE nelle fibre muscolari scheletriche, ottenute da un ratto Zucker +/+ (Lean) esercitato e da un ratto Zucker fa/fa obeso (Ob) registrato alla distanza Z (da 15 a 21 μm di profondità). Le immagini sono state elaborate mediante thresholding e trasformate in immagini binarie. (C) Mito-densità calcolata delle fette confocali ottenute a diverse distanze Z osservate nel pannello B. (D) La mito-densità ottenuta dalla pila composta dalle immagini osservate nel pannello B. Le immagini nel pannello B sono 65 x 50 μm. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: Mito-densità = Densità mitocondriale; IMF = mitocondri intermiofibrillari; Ob = obeso; SSM = mitocondri subsarcolemmali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> Figura 4: Analisi della distribuzione mitocondriale mediante FFT. Immagini confocali rappresentative di mitocondri caricati con l'indicatore fluorescente TMRE acquisite a 21 μm della profondità delle fibre muscolari scheletriche ottenute da un ratto Zucker +/+ esercitato (Lean, pannello A) e da un ratto obeso Zucker fa/fa (Ob, pannello B). Le immagini sono state elaborate mediante thresholding e trasformate in immagini binarie. ROI laterali e centrali del pannello A (pannello C) e del pannello B (pannello D) con i rispettivi profili di intensità di fluorescenza (grafico superiore) e spettro FFT (grafico inferiore). La FFT è stata calcolata a partire da ROI con 256 pixel di larghezza, che corrisponde a una dimensione del ROI di 39 x 5 μm nel pannello A e a una dimensione del ROI di 50 x 5 μm nel pannello B. Il pannello E mostra le differenze dello spettro FFT riscontrate tra i mitocondri derivati da ratti Lean e Ob nella ROI laterale, mentre il pannello F mostra le differenze dello spettro FFT della ROI centrale. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: U.A. = Unità Arbitrarie; FFT = Trasformata di Fourier veloce; ROI = regioni di interesse; Ob = obeso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale in 100 mL</td>
			<td>Ceppo </td>
		</tr><tr><td>K-aspartato</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>20 millimetri</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>20 millimetri</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Acido L-glutammico</td>
			<td>3 milioni di minuti</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Acido malico</td>
			<td>3 milioni di minuti</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,1 millimetri</td>
			<td>10 milioni di metri</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM libero Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,00002 mM di Ca2+ libero</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fosfocreatina di-Na</td>
			<td>5 milioni di metri</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr><tr><td>Creatinfosfochinasi</td>
			<td>5 U/mL</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>5 milioni di metri</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7,3 (con NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Rilassare i reagenti della soluzione e la concentrazione.
Figura supplementare S1: Effetto dei metodi di pre-elaborazione delle immagini. (A) Immagini confocali rappresentative di mitocondri caricati con l'indicatore fluorescente TMRE acquisite a una profondità di 18 μm in fibre muscolari scheletriche ottenute da un ratto Zucker +/+ esercitato (Lean, pannello superiore) e da un ratto Zucker fa/fa obeso (pannello inferiore), insieme alle rispettive immagini ottenute dopo pre-trattamento utilizzando la soglia di Otsu, il filtro mediano e la soglia di Otsu, e la deconvoluzione 2D e la soglia di Otsu. (B) Tracciare il profilo della mito-densità ottenuta dalle immagini confocali (pannello A) dopo preprocessing con metodi diversi. Le immagini nel pannello A sono di 65 x 50 μm. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: 2D-Decon = deconvoluzione 2D; Mito-densità = Densità mitocondriale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare i cambiamenti nella densità mitocondriale e nella distribuzione longitudinale mediante imaging del muscolo scheletrico vivo utilizzando la microscopia confocale per la scansione della rete mitocondriale.

Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

Il rimodellamento della rete mitocondriale avviene in condizioni fisiologiche di stress e patologiche. Tuttavia, gli effetti del rimodellamento mitocondriale in un muscolo scheletrico rimangono incompletamente compresi. Questo protocollo consente di quantificare i cambiamenti dei mitocondri nel muscolo scheletrico vivo, migliorando la nostra comprensione dell'interazione tra alterazioni mitocondriali e funzione cellulare.Lavorare con i muscoli scheletrici vivi presenta sfide a causa della contrazione delle fibre durante l'isolamento e della sensibilità all'immagine durante la scansione confocale. Questo protocollo descrive un processo di isolamento che utilizza una soluzione di rilassamento, consentendo l'analisi delle fibre muscolari vitali per la valutazione mitocondriale tramite microscopia confocale. Il nostro protocollo affronta la mancanza di flussi di lavoro per analizzare quantitativamente le reti mitocondriali nelle fibre muscolari scheletriche.I passaggi qui descritti consentono agli utenti di sfruttare al meglio le immagini ottenute dalla microscopia confocale utilizzando l'elaborazione delle immagini mediante thresholding e l'analisi di Fourier veloce per ottenere la quantificazione della densità e della distribuzione mitocondriale. Siamo interessati allo studio dell'alterazione del muscolo scheletrico, in particolare della dinamica mitocondriale e del rimodellamento strutturale mitocondriale durante le avversità e di come possono essere modulate attraverso interventi come l'esercizio fisico e il digiuno intermedio.

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Qui descriviamo il localizzatore di eventi mitocondriali (MEL), un plugin di ImageJ utile per quantificare i cambiamenti tridimensionali nell'attività di fissione e fusione mitocondriale nel tempo. Descriviamo anche una pipeline di elaborazione delle immagini utile per la pulizia delle micrografie prima dell'analisi in ImageJ.

Comprensione dei cambiamenti nella morfologia mitocondriale attraverso micrografie a fluorescenza dinamiche e tridimensionali

Iniezioni locali di un colorante mitocondriale con etichetta di dotante terminale di cellula di Schwann in vivo per microscopia confocale. Questo metodo utilizza prove di concetto dimostrate su tessuto muscolare scheletrico di topi con muscoli sani o malati per fornire una visualizzazione mitocondriale ad alta risoluzione.

Metodi per la quantificazione in situ della morfologia mitocondriale nelle cellule muscolari e terminali di Schwann di topi

Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

Scopri l'analisi della densità mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale. Questo metodo quantitativo rivela alterazioni metaboliche tra ratti magri e obesi.

Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale (Video) | JoVE Journal

Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale

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