Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico
2 giugno 2023
La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca2+ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.
CaV1.1, un membro dei canali ionici voltaggio-dipendenti, ha quattro sensori di tensione distinti. L'evidenza suggerisce che alcuni sensori di tensione contribuiscono maggiormente all'attivazione del recettore della rianodina o alla corrente di calcio. Miriamo a essere in grado di identificare il ruolo preciso di ciascun sensore di tensione nell'accoppiamento eccitazione-contrazione e nell'attivazione dei canali del calcio.
L'accoppiamento eccitazione-contrazione è stato studiato fin dai primi anni '50, ma i dettagli molecolari di come avviene questo processo sono ancora sconosciuti. I recenti progressi nella struttura microscopica del canale ciroelettronico, la caratterizzazione della nuova proteina accessoria CaV1.1, la scoperta della variante di splicing alternativo del canale e l'identificazione di mutazioni che causano malattie hanno riacceso l'interesse in questo campo. Molte tecniche sono utilizzate nel nostro campo, dall'elettrofisiologia classica e biologia molecolare a tecniche più nuove come la microscopia crioelettronica, la simulazione dinamica molecolare, la degradazione proteica mirata e la fluorometria funzionale diretta dal sito, nonché cellule ingegnerizzate o modelli animali.
Attualmente, il carburante deve affrontare diverse sfide sperimentali. In un muscolo scheletrico, il corretto traffico e la comunicazione tra CaV1.1 e RyR1, insieme a molte proteine regolatorie, è fondamentale per supportare l'accoppiamento eccitazione-contrazione. I metodi per studiare direttamente queste interazioni proteina-proteina tra CaV1.1 e RyR1 sono mancanti o incompleti.
Il laboratorio del Dr.Martin Schneider ha lavorato per decenni sull'accoppiamento eccitazione-contrazione, caratterizzando i meccanismi di rilevamento della tensione in CaV1.1, il rilascio di calcio e gli eventi localizzati di rilascio di calcio, noti come scintille di calcio. Recentemente, il nostro laboratorio ha implementato nuove tecniche ottiche per studiare varie fasi dell'accoppiamento eccitazione-contrazione e del movimento del sensore di tensione nelle cellule muscolari adulte funzionanti. Mentre questo è stato fatto in precedenza in un sistema di espressione eterologo, il nostro protocollo ora consente di tracciare i cambiamenti conformazionali nei sensori di tensione CaV1.1 durante un potenziale d'azione propagato nel suo ambiente nativo.
La nostra nuova tecnica ci permetterà di studiare il movimento preciso del sensore di tensione necessario per l'accoppiamento eccitazione-contrazione. Vogliamo sapere quali residui di carica in ogni S4 sono critici per la sua funzione, o esattamente ogni traslocazione S4, e tutto ciò che è traslocato è legato all'apertura del CaV1.1 o all'attivazione del recettore della rianodina.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio analizza il movimento dei sensori di voltaggio nei canali del calcio sensibili al voltaggio Kv1.1, fondamentali per l'accoppiamento eccitazione-contrazione nel muscolo scheletrico murino. Utilizzando la fluorimetria funzionale con mutagenesi mirata, i ricercatori riescono a seguire in tempo reale i movimenti di questi domini proteici nel loro contesto cellulare nativo.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Accoppiamento eccitazione-contrazione
- Canali ionici attivati dal voltaggio
- Movimenti dei domini proteici
Sfondo
- Kv1.1 possiede quattro sensori di voltaggio distinti collegati alla segnalazione del calcio.
- Comprendere i loro ruoli precisi potrebbe chiarire i meccanismi alla base della contrazione muscolare.
- Le tecniche precedenti non erano in grado di studiare queste dinamiche in ambienti nativi.
Metodi Utilizzati
- Fluorimetria funzionale con localizzazione specifica
- Fibre muscolari scheletriche di roditore
- Marcatura con proteine fluorescenti e registrazione delle correnti ioniche
Risultati principali
- Monitoraggio in tempo reale dei movimenti del sensore di voltaggio durante i potenziali d'azione.
- Modifiche di configurazione dei sensori di voltaggio Kv1.1 correlate all'accoppiamento eccitazione-contrazione.
- Convalidato l'effetto di residui con carica specifica sulla funzionalità del sensore di voltaggio.
Conclusioni
- Lo studio fornisce informazioni sul comportamento dinamico dei sensori di voltaggio fondamentali per la funzione muscolare.
- Questa metodologia migliora la comprensione sia della fisiologia normale sia degli stati patologici associati all'eccitazione muscolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fluorimetria funzionale mirata in cellule muscolari scheletriche native consente l'analisi in tempo reale dei cambiamenti conformazionali dei canali ionici attivati dal voltaggio, fornendo direttamente informazioni per la validazione precoce delle proteine bersaglio e la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca sull'eccitabilità muscolare. Questo approccio colma il divario tra sistemi eterologhi e modelli fisiologicamente rilevanti, aumentando la capacità predittiva per portafogli mirati ai canali ionici. La sua integrazione favorisce decisioni più informate di tipo go/no-go nei percorsi di scoperta e preclinici focalizzati su indicazioni neuromuscolari e sulle canalopatie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della funzione del sensore di voltaggio in fibre muscolari native per una valida conferma del bersaglio.
- Chiarisce il contributo meccanicistico di specifici domini del canale all'accoppiamento eccitazione-contrazione.
- Supporta la previsione con maggiore affidabilità collegando riarrangiamenti strutturali a risposte funzionali in sistemi rilevanti per la patologia.
- Facilita la riduzione del rischio biologico confermando l'interazione con il bersaglio in contesti fisiologicamente rilevanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di fibre muscolari validati per lo screening successivo di modulatori che influenzano la conformazione o la funzione dei canali.
- Consente letture quantitative e riproducibili, basate su fluorescenza ed elettrofisiologia, per la standardizzazione dei saggi.
- Permette la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma adattando il protocollo ad altri canali ionici e proteine.
- Migliora l'affidabilità della valutazione dei composti integrando misurazioni strutturali e funzionali in tempo reale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie utilizzando fibre muscolari murine adulte per garantire continuità traslazionale.
- Permette decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio fornendo un'analisi meccanicistica dei difetti nell'accoppiamento eccitazione-contrazione.
- Supporta l'allineamento dei biomarcatori attraverso la misurazione quantitativa della dinamica del sensore di voltaggio correlata agli esiti funzionali.
- Riduce i rischi nei programmi preclinici mirati alle canalopatie ioniche validando ipotesi meccanicistiche in tessuto nativo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale del bersaglio fino all'identificazione di composti promettenti e agli studi meccanicistici preclinici, in particolare per programmi relativi a canali ionici e all'eccitabilità muscolare.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi misurando direttamente i movimenti del sensore di voltaggio durante il potenziale d'azione.
- Screening: Fornisce sistemi pronti per i saggi, riproducibili, con uscite quantitative di fluorescenza e corrente.
- Analisi: Offre misurazioni quantitative risolte nel tempo dei cambiamenti conformazionali per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca Translazionale: Mantiene la continuità utilizzando fibre muscolari native, favorendo l'allineamento con biomarcatori e modelli di malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile adattabile ad altri canali ionici e proteine di membrana nei tessuti muscolari ed eccitabili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi dei canali ionici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi funzionali in sistemi nativi.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento/cessazione e l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi meccanicistici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento regolati dal rischio di programmi mirati ai canali ionici e ai muscoli.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, imaging a fluorescenza e biologia molecolare per la progettazione dei costrutti e l'interpretazione dei dati.
- Necessita di strumentazione specializzata per la registrazione simultanea di fluorescenza e corrente nelle fibre muscolari.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità su diversi bersagli e costrutti di canali ionici.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei protocolli di trasfezione e marcatura.
- Limitazioni potenziali includono colorazioni di fondo e artefatti dovuti al movimento, che richiedono controlli sperimentali accurati.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:55
Construct Design for Transfecting Cysteine‐Engineered Voltage‐Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers
4:05
Assessment of EGFP‐Positive Fiber Electrical Activity, Cysteine Staining, and Signal Acquisition
