Name: Inibizione optogenetica della contrattilità dellactomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Scopri l'inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila. Questo metodo consente di studiare rapidamente la morfogenesi tessutale.

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Gli autori ringraziano Ann Lavanway per il supporto all'imaging. Gli autori ringraziano il laboratorio Wieschaus e il laboratorio De Renzis per la condivisione dei reagenti e il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock di mosche. Questo studio è supportato da NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 e American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 a BH.

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 in Drosophila

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Questo protocollo descriveva l'uso combinato dell'optogenetica e dell'ablazione laser per sondare i cambiamenti nella tensione tissutale immediatamente dopo l'inattivazione della contrattilità dell'actomiosina. Lo strumento optogenetico qui descritto sfrutta la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN) per inibire in modo acuto la contrattilità endogena dell'actomiosina Rho1 e Rho1-dipendente. Una precedente caratterizzazione di Opto-Rho1DN nel contesto della formazione di solchi ventrali di Drosophila ha dimost...

La contrattilità dell'actomiosina, la forza contrattile esercitata dalla miosina II non muscolare (di seguito «miosina») sulla rete di F-actina, è una delle forze più importanti nel modificare la forma delle cellule e nel guidare la morfogenesi a livello tissutale 1,2. Ad esempio, l'attivazione della contrattilità dell'actomiosina nel dominio apicale delle cellule epiteliali provoca una costrizione apicale, che facilita una varietà di processi morfogenetici, tra cui il ripiegamento epiteliale, l'estrusione cellulare, la delaminazione e la guarigione delle ferite 3,4,5,6,7 . L'attivazione della miosina richiede la fosforilazione della sua catena leggera regolatrice. Questa modifica allevia la conformazione inibitoria delle molecole di miosina, consentendo loro di formare fasci di filamenti di miosina bipolari con più domini di testa su entrambe le estremità. I filamenti bipolari di miosina guidano il movimento antiparallelo dei filamenti di actina e provocano la generazione della forza contrattile 1,8,9.
La piccola GTPasi RhoA della famiglia Rho, evolutivamente conservata, svolge un ruolo centrale nell'attivazione della contrattilità dell'actomiosina in vari contesti cellulari 10,11. Rho1 funziona come un interruttore bimolecolare legando GTP (forma attiva) o GDP (forma inattiva)12. Il ciclo tra Rho1 legato al GTP o al GDP è regolato dalle sue proteine attivanti la GTPasi (GAP) e dai fattori di scambio dei nucleotidi guanina (GEF)13. I GEF hanno la funzione di facilitare lo scambio di PIL con GTP e quindi di attivare l'attività di Rho1. I GAP, d'altra parte, potenziano l'attività GTPasica di Rho1 e quindi disattivano Rho1. Rho1 attivato promuove la contrattilità dell'actomiosina attraverso l'interazione e l'attivazione dei suoi effettori a valle, la chinasi associata a Rho (Rok) e la Diafana14. Rok induce l'attivazione della miosina e la contrattilità dell'actomiosina fosforilando la catena leggera regolatoria della miosina15. Inoltre, Rok inibisce anche la fosfatasi a catena leggera regolatrice della miosina e quindi promuove ulteriormente l'assemblaggio del filamento di miosina16. Rok può anche fosforilare le chinasi LIM che, una volta attivate, impediscono il disassemblaggio dell'actina fosforilando e inibendo il fattore di depolimerizzazione dell'actina cofilina17,18. Diaphanous è un nucleatore di actina della famiglia delle formine che promuove la polimerizzazione dell'actina, fornendo una base per l'interazione della miosina con 19,20,21.
Mentre i meccanismi cellulari che attivano la contrattilità dell'actomiosina sono stati ben chiariti, la nostra comprensione della sua funzione nella regolazione del rimodellamento dinamico dei tessuti rimane incompleta. Per colmare questa lacuna di conoscenze sono necessari approcci in grado di inattivare rapidamente l'actomiosina in specifiche regioni tissutali in vivo e di registrare l'impatto immediato sul comportamento e sulle proprietà dei tessuti. Questo protocollo descrive l'uso di un approccio optogenetico per inibire in modo acuto la contrattilità dell'actomiosina durante l'invaginazione del mesoderma di Drosophila, seguito dalla misurazione della tensione epiteliale mediante ablazione laser. Durante la gastrulazione di Drosophila, le cellule precursori del mesoderma localizzate ventralmente subiscono una costrizione apicale e si invaginano dalla superficie dell'embrione formando un solco orientato antero-posteriormente22,23. La formazione di solchi ventrali è stata a lungo utilizzata come modello per studiare il meccanismo del ripiegamento epiteliale. La formazione di solchi ventrali è amministrata dal sistema di pattern dorso-ventrale in Drosophila24,25,26,27. L'espressione di due fattori di trascrizione, Twist e Snail, situati sul lato ventrale dell'embrione, controlla la formazione del solco ventrale e specifica il destino delle cellule mesodermiche28. Twist e Snail attivano il reclutamento di Rho1 GEF RhoGEF2 all'apice delle cellule precursori del mesoderma attraverso una via recettoriale accoppiata a proteina G e una proteina adattatrice RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Successivamente, RhoGEF2 attiva la miosina in tutta la superficie apicale del potenziale mesoderma attraverso la via chinasica Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La miosina attivata forma una rete di actomiosina supracellulare in tutta la superficie apicale del mesoderma primordiale, le cui contrazioni guidano la costrizione apicale e provocano un rapido aumento della tensione del tessuto apicale 14,37,40.
Lo strumento optogenetico descritto in questo protocollo, Opto-Rho1DN, inibisce la contrattilità dell'actomiosina attraverso il reclutamento sulla membrana plasmatica dipendente dalla luce blu di una forma dominante negativa di Rho1 (Rho1DN)41. Una mutazione T19N in Rho1DN elimina la capacità della proteina mutante di scambiare il GDP con il GTP e quindi rende la proteina perennemente inattiva34. Una successiva mutazione in Rho1DN, C189Y, elimina il suo naive segnale di targetingdi membrana 42,43. Quando Rho1DN viene infuso nella membrana plasmatica, si lega e trattiene i GEF di Rho1, bloccando così l'attivazione di Rho1 e l'attivazione mediata da Rho1 della miosina e dell'actina34,44. Il reclutamento di Rho1DN sulla membrana plasmatica è ottenuto attraverso un modulo di dimerizzazione dipendente dalla luce derivato dal Criptocromo 2 e dal suo partner di legame CIB1. Il criptocromo 2 è un fotorecettore del criptocromo attivato dalla luce blu in Arabidopsis thaliana45. Il criptocromo 2 si lega a CIB1, una proteina basica elica-loop-elica, solo nel suo stato fotoeccitato45. In seguito si è scoperto che la regione di omologia della fotoliasi N-terminale conservata (PHR), dal criptocromo 2 (CRY2PHR, di seguito denominato CRY2) e il dominio N-terminale (aa 1-170) di CIB1 (da qui in poi CIBN) sono importanti per la dimerizzazione indotta dalla luce46. Opto-Rho1DN contiene due componenti. Il primo componente è la proteina CIBN fusa con un'ancora CAAX, che localizza la proteina sulla membrana plasmatica47. Il secondo componente è CRY2 marcato con mCherry fuso con Rho1DN41. In assenza di luce blu, CRY2-Rho1DN rimane nel citoplasma. Dopo la stimolazione con luce blu, CRY2-Rho1DN viene indirizzato alla membrana plasmatica attraverso l'interazione tra CIBN ancorato alla membrana e CRY2 eccitato. Opto-Rho1DN può essere attivato dalla luce ultravioletta A (UVA) e dalla luce blu (400-500 nm, picco di attivazione a 450-488 nm), o da un laser pulsato da 830-980 nm durante l'esecuzione di stimolazione a due fotoni41,46,47,48. Pertanto, Opto-Rho1DN è stimolato dalle lunghezze d'onda normalmente utilizzate per eccitare la GFP (488 nm per l'imaging a singolo fotone e 920 nm per l'imaging a due fotoni). Al contrario, le lunghezze d'onda comunemente utilizzate per l'eccitazione di mCherry (561 nm per l'imaging a singolo fotone e 1.040 nm per l'imaging a due fotoni) non stimolano il modulo optogenetico e quindi possono essere utilizzate per l'imaging di pre-stimolazione. Il protocollo descrive gli approcci utilizzati per ridurre al minimo il rischio di stimolazione indesiderata durante la manipolazione del campione.
L'ablazione laser è stata ampiamente impiegata per rilevare e misurare la tensione nelle cellule e nei tessuti49. Studi precedenti hanno dimostrato che, quando l'intensità del laser è adeguatamente controllata, l'ablazione laser a due fotoni che impiega un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso può compromettere fisicamente alcune strutture subcellulari (ad esempio, le reti corticali di actomiosina) senza causare il rapimento della membrana plasmatica50,51. Se il tessuto è sotto tensione, l'ablazione laser di una regione di interesse all'interno del tessuto provoca un immediato rinculo verso l'esterno delle cellule adiacenti alla regione ablata. La velocità di rinculo è funzione dell'entità della tensione e della viscosità del mezzo (citoplasma) che circonda le strutture sottoposte a rinculo49. A causa della profondità di penetrazione superiore dei laser nel vicino infrarosso e della capacità di ottenere un'ablazione focale ben confinata, l'ablazione laser a due fotoni è particolarmente utile per rilevare la tensione dei tessuti in vivo. Come dimostrato in questo protocollo, questo metodo può essere facilmente combinato con l'inattivazione della contrattilità dell'actomiosina mediata da Opto-Rho1DN per studiare l'impatto diretto della contrattilità cellulare dipendente da Rho1 sulla meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>Piastra con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Utilizzata per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Piastra Petri da 60 mm e 15 mm con coperchio</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>Utilizzata per la preparazione</td></tr><tr><td>dei campioni Panno nero per coprire il microscopio</td><td>Online</td><td>NA</td><td>Utilizzato per evitare la stimolazione luminosa indesiderata</td></tr><tr><td>Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25% ipoclorito di sodio)</td><td>VWR</td><td>10028-048</td><td>Utilizzato per la decorinazione degli embrioni</td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>Utilizzato per il set-up incrociato</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Dumont Style 5 pinzette</td><td>VWR</td><td>102091-654</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Strumento per ciglia (realizzato in zibellino rosso puro #2)</td><td>VWR</td><td>22940-834</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>FluoView (Software)</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Utilizzato per l'acquisizione di immagini e la stimolazione optogenetica</td></tr><tr><td>Olio di alocarburi 27</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td>Utilizzato per la visualizzazione dello stadio embrionale</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Utilizzato per l'analisi delle immagini</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>Utilizzato per l'analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Stereoscopio Nikon SMZ-745</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Microscopio multifotone Olympus FVMPE-RS con laser ultraveloci a doppia linea InSight DS per l'imaging multifotone simultaneo a doppia lunghezza d'onda, un obiettivo a immersione in acqua 25x/NA1.05 (XLPLN25XWMP2) e un'unità di stimolazione IR/VIS per fotoattivazione/stimolazione. Questo sistema è inoltre dotato di un filtro TRITC (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) e un'unità di illuminazione a fluorescenza che emette luce bianca.</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Utilizzato per l'acquisizione di immagini e la stimolazione optogenetica</td></tr><tr><td>SP Bel-Art Scatola di conservazione per congelatore in polipropilene da 100 posti (scatola nera a prova di luce per il trasferimento dei campioni)</td><td>VWR</td><td>30621-392</td><td>Utilizzato per evitare la stimolazione luminosa indesiderata</td></tr><tr><td>Schermo filtrante UV per FM1403 Fluores (schermo in plastica rosso-arancio)</td><td>Bolioptics</td><td>FM14036151</td><td>Utilizzato per evitare la stimolazione</td></tr> <tr><td>luminosa indesiderataLampada frontale VITCHELO V800 con luci LED bianche e rosse</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td>Utilizzato per evitare stimoli luminosi indesiderati</td></tr></tbody></table>

inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Le forze contrattili generate dall'actina e dalla miosina II non muscolare ("contrattilità dell'actomiosina") sono fondamentali per i cambiamenti morfologici di cellule e tessuti su più scale di lunghezza, come la divisione cellulare, la migrazione cellulare, il ripiegamento epiteliale e la morfogenesi ramificata. Una comprensione approfondita del ruolo della contrattilità dell'actomiosina nella morfogenesi richiede approcci che consentano la rapida inattivazione dell'actomiosina, che è difficile da ottenere utilizzando approcci genetici o farmacologici convenzionali. Il protocollo presentato dimostra l'uso di un sistema di dimerizzazione optogenetica basato su CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, per inibire la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con precisi controlli temporali e spaziali. In questo sistema, CRY2 è fuso con la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN), mentre CIBN è ancorato alla membrana plasmatica. La dimerizzazione mediata dalla luce blu di CRY2 e CIBN provoca una rapida traslocazione di Rho1DN dal citoplasma alla membrana plasmatica, dove inattiva l'actomiosina inibendo Rho1 endogeno. Inoltre, questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'accoppiamento dell'inattivazione dell'actomiosina mediata da Opto-Rho1DN con l'ablazione laser per studiare il ruolo dell'actomiosina nella generazione di tensione epiteliale durante la formazione del solco ventrale di Drosophila . Questo protocollo può essere applicato a molti altri processi morfologici che coinvolgono la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con modifiche minime. Nel complesso, questo strumento optogenetico è un potente approccio per analizzare la funzione della contrattilità dell'actomiosina nel controllo della meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.

Negli embrioni non stimolati sottoposti a costrizione apicale, Sqh-mCherry si è arricchito nella regione medioapicale delle cellule mesodermiche ventrali, mentre CRY2-Rho1DN-mCherry era citosolico (Figura 1A). L'ablazione laser all'interno del dominio di costrizione ha portato a un rapido rinculo del tessuto lungo l'asse A-P (Figura 1B,C). Negli embrioni stimolati, il segnale CRY2-Rho1DN-mCherry è diventato localizzato sulla membrana plasmatica,...

La contrattilità dell'actomiosina svolge un ruolo importante nella morfogenesi cellulare e tissutale. Tuttavia, è difficile manipolare la contrattilità dell'actomiosina in vivo in modo acuto. Questo protocollo descrive un sistema optogenetico che inibisce rapidamente la contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 negli embrioni di Drosophila , rivelando l'immediata perdita di tensione epiteliale dopo l'inattivazione dell'actomiosina in vivo.

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

La nostra ricerca studia la morfogenesi tissutale, la formazione di complesse strutture tissutali tridimensionali in fase di sviluppo. Siamo interessati ai geni e alle molecole che regolano la morfogenesi e cerchiamo di comprendere i principi fisici alla base della morfogenesi. Ad esempio, come vengono generate le forze meccaniche e come guidano la riabilitazione dei tessuti.Le forze contrattili generate dall'actina filamentosa e dalla miosina II non muscolare, nota anche come contrattilità dell'actomiosina, sono una delle forze più importanti che guidano la morfogenesi dei tessuti. La nostra ricerca attuale affronta il modo in cui la contrattilità dell'actomiosina media il ripiegamento dei fogli cellulari epiteliali del sangue, un meccanismo fondamentale di costruzione dei tessuti nello sviluppo. Una comprensione approfondita del ruolo della contrattilità dell'actomiosina nel ripiegamento epiteliale e in altri processi morfogenetici richiede approcci in grado di inattivare rapidamente l'actomiosina nel momento e nel luogo designati e registra l'impatto immediato del comportamento e delle proprietà dei tessuti.Tuttavia, questo è difficile da ottenere utilizzando approcci genetici convenzionali. L'approccio descritto in questo protocollo è progettato per affrontare il modo in cui le cellule e i tessuti rispondono a cambiamenti improvvisi nelle forze meccaniche che normalmente guidano il rimodellamento dei tessuti. Questa è una domanda importante, ma è stata difficile da affrontare a causa di approcci limitati che possono alterare rapidamente le forze meccaniche nei tessuti intatti.In questo studio, abbiamo sviluppato uno strumento optogenetico per inattivare rapidamente l'actomiosina in specifiche regioni tissutali negli embrioni di Drosophila. Abbiamo scoperto che la combinazione di questi due con l'ablazione laser per studiare l'impatto diretto della contrattilità dell'actomiosina sulla meccanica tissutale nel ripiegamento epiteliale. I nostri risultati forniscono nuove informazioni sul meccanismo meccanico del mezzo di costrizione apicale al ripiegamento epiteliale.Con modifiche manuali, il protocollo può essere facilmente adattato per studiare la funzione della contrattilità dell'actomiosina in un'ampia gamma di processi morfogenetici.

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