Name: Valutazione dellimpatto di un nuovo sistema di processore di celle di raffreddamento su un impianto di isolamento delle cellule insulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Scopri un sistema di processore di celle raffreddato per migliorare la viabilità cellulare umana in ambienti GMP. Questo metodo utilizza centrifugazione a gradiente di densità e monitoraggio termocoppia digitale per garantire purezza e recupero ottimale delle cellule mononucleate.

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Gli autori desiderano ringraziare l'istituto genomico europeo per il diabete (ANR-10- LABEX-0046 a FP) e l'istituto metabolico del Qatar - Hamad medical corporation, Qatar. Gli autori ringraziano anche il Medical Research Center di Hamad Medical Corporation per il supporto alle spese di elaborazione degli articoli.

Questo protocollo ha utilizzato sangue intero scartato, non idoneo all'uso secondo le linee guida istituzionali per lo smaltimento. L'approvazione del comitato etico e il consenso informato non sono applicabili.
1. Configurazione del processore di cellule refrigerato
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un ambiente a camera pulita e il personale deve rispettare le procedure relative all'abbigliamento per camere pulite.
<ol>
	<li>Acquisto dell'attrezzatura
	<ol>
		<li>Acquistare un coperchio di ricambio in plexiglass. Acquistare il sistema di raffreddamento, composto da refrigeratore con controllore della temperatura del flusso di gas refrigerato meccanicamente, essiccatore dell'aria, regolatore di pressione e flusso, e la garanzia (opzionale). Vedere la Tabella dei Materiali per i riferimenti. 
		NOTA: Il costo totale è di 16.133 dollari statunitensi, escluse le spese di spedizione e doganali.</li>
		<li>Ordinare aria medica secca, un gas medicale compresso conforme al grado standard (riferimento della Farmacopea Europea 1238), presso il fornitore locale di gas medicali. Acquistare 2 bombole da 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; diametro x lunghezza).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione dell'attrezzatura (Figura 1 e Figura 2)
	<ol>
		<li>Introdurre l'attrezzatura nel cleanroom GMP (disinfettare prima di entrare nel cleanroom secondo le procedure GMP).</li>
		<li>Per l'aria compressa di grado medico, installare una linea per gas invece di posizionare direttamente la bombola nel cleanroom.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modifica del cell processor per il raffreddamento
	<ol>
		<li>Prima di tutto, rimuovere il coperchio in plexiglass. Conservare il coperchio originale in plexiglass nel caso ci siano problemi con la garanzia. Praticare un foro nel coperchio di ricambio del cell processor con un diametro corrispondente e adatto al diametro esterno della punta del beccuccio del dispositivo di raffreddamento, per evitare crepe nel coperchio della centrifuga (si raccomanda un diametro di 13,3 mm).</li>
		<li>Fissare le staffe insieme a un pezzo circolare di schiuma. Questo passaggio serve per evitare rotture e/o graffi al coperchio, per mantenere il beccuccio del refrigeratore in posizione sopra il cell processor, per proteggere il coperchio da una flessione eccessiva dovuta alla pressione elevata dell'aria iniettata, per sostenere il peso del beccuccio e, infine, per garantire la massima sicurezza all'operatore, consentendo un accesso libero e sicuro a tutte le funzioni necessarie del cell processor durante la procedura sperimentale.</li>
		<li>Collegare il sistema di raffreddamento al cell processor fissando il beccuccio di raffreddamento al foro nel plexiglass. Fissarlo con staffe e cuscinetti in schiuma.</li>
		<li>Posizionare l'alloggiamento del refrigeratore fino a 2,44 m (8 piedi) di distanza dal beccuccio. Collocare il controllore della temperatura in un armadietto separato, entro 1,83 m (6 piedi) dall'alloggiamento del refrigeratore.</li>
		<li>Impostare il punto di regolazione del refrigeratore a -40 °C per raffreddare il flusso d'aria nel refrigeratore. La temperatura dell'aria in uscita viene indicata continuamente sul display digitale con una risoluzione di 0,1 °C. Impostare digitalmente la temperatura in uscita a 0,1 °C mediante il controllore della temperatura.</li>
		<li>Regolare la pressione e la portata dell'aria sul modulo regolatore di pressione e flusso (Figura 2) prima di inviarla al refrigeratore. Impostare rispettivamente a 55 psi e 4 SCFM per raggiungere le condizioni ottimali su un flusso d'aria raffreddato a -30 °C ± 2 °C.</li>
		<li>Verificare che l'alimentazione del gas medico sia regolata a una pressione in uscita di 5 bar e che possa durare almeno 90 minuti, poiché ciò è necessario affinché l'aria compressa raggiunga -30 °C. 
		&#8203;NOTA: L'aria medica secca è un gas medicale compresso, e l'aria secca completamente pressurizzata rispetta il grado standard.</li>
		<li>Errogare 5 bar da un beccuccio del refrigeratore collegato al coperchio del cell processor attraverso un foro praticato nel coperchio della centrifuga. Iniettare l'aria medica refrigerata all'interno della coppa di centrifugazione del cell processor (Figura 2). Scegliere la posizione dell'iniezione dell'aria in modo che l'aria fredda sia diretta perpendicolarmente al bordo in alluminio del rotore della centrifuga.</li>
		<li>Quando si prepara il cell processor, assicurarsi che il rotore sia alla temperatura ambiente (18 °C). Impostare il termoregolatore automatico del sistema di raffreddamento a -30 °C e dirigere le iniezioni di aria fredda verso il rotore. 
		NOTA: Sono state testate diverse condizioni sperimentali per raggiungere un gradiente di temperatura ottimale di +4 °C, necessario per superare la resistenza termica del sistema separatore di cellule del cell processor e il riscaldamento del rotore durante la centrifugazione. Il termoregolatore programmato manterrà la temperatura obiettivo ottimale all'interno della macchina per l'elaborazione delle cellule durante la procedura, in particolare durante la centrifugazione, a una temperatura del cleanroom di +18 °C.
		<ol>
			<li>Configurare il cell processor con la prima fase di pre-raffreddamento per raffreddare il processore (senza il kit del cell processor) a +3 °C per 30-45 minuti, e la seconda fase di pre-raffreddamento, durante la quale il cell processor deve essere eseguito con il kit pre-raffreddato a +4 °C a 134 x g, per 5 minuti.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Conteggio delle particelle sospese nell'aria
<ol>
	<li>Valutare la conformità del dispositivo di raffreddamento all'ambiente di cleanroom GMP secondo lo standard ISO 14644-1 per analizzare l'impatto dei dispositivi termici durante la fase operativa.</li>
	<li>Utilizzare il monitoraggio del conteggio delle particelle per dimostrare che il livello richiesto di pulizia viene raggiunto nei punti critici di controllo a riposo e in funzionamento.
	<ol>
		<li>Il numero minimo di posizioni di campionamento dipende dall'area misurata. Calcolarlo mediante l'equazione 
		<img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;dove A è l'area del cleanroom o dello spazio controllato ad aria pulita in m2 e NL è il numero di posizioni di campionamento arrotondato per eccesso al numero intero successivo.</li>
		<li>Il volume di campionamento nell'aria è il volume minimo in ogni posizione. Assicurarsi che il volume d'aria sia sufficientemente ampio da consentire il conteggio di 20 particelle della dimensione maggiore specificata. Calcolare il volume di campionamento nell'aria mediante l'equazione 
		V= 20/C x 1000 
		dove V è il volume minimo di singolo campione per posizione, espresso in L, e C è il limite di classe (numero di particelle/m3).</li>
		<li>Per ogni posizione, a seconda dell'area, utilizzare uno o più campioni. Assicurarsi che il volume minimo campionato in ogni posizione sia di 2 L e che il tempo minimo di campionamento sia di almeno 1 minuto.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prima del campionamento, purificare il dispositivo contatore di particelle con un filtro di spurgo. Rimuovere il filtro e posizionarlo insieme alla sonda isocinetica per il campionamento.</li>
	<li>Posizionare lo strumento contatore di particelle nella posizione di campionamento identificata. Avviare la raccolta del campione dalla schermata principale del dispositivo contatore di particelle.</li>
	<li>Al termine del campionamento, spostare il dispositivo contatore di particelle nella posizione successiva. Una volta completate tutte le posizioni di campionamento, esaminare i dati e stampare un rapporto.</li>
	<li>Quando la concentrazione media di particelle in tutti i punti di campionamento nell'area risulta inferiore al limite di classe indicato in Tabella 1, considerare il locale conforme per quanto riguarda la concentrazione ammissibile di particelle.</li>
</ol>
3. Preparazione del gradiente ed elaborazione della separazione cellulare
<ol>
	<li>Prima dell'esperimento, raffreddare preventivamente le gradazioni di densità leggera e pesante e i kit del cell processor durante la notte a +4 &#176;C in un frigorifero.</li>
	<li>Preraffreddare il processore cellulare per 45 min a riposo (ovvero, accendere il processore cellulare prima dell'uso). Mantenere la temperatura tra +2 &#176;C e +5 &#176;C. Inserire il kit del processore cellulare preraffreddato a +4 &#176;C.</li>
	<li>Per il miscelatore a gradiente standard con doppia guaina refrigerata a etanolo (opzionale; Figura 3) collegare le due camere di vetro e posizionarle su un agitatore magnetico. Fissare con una pinza il tubo tra le due camere. Raffreddare il generatore di gradiente con un refrigeratore a circolazione di etanolo a 0 &#176;C.</li>
	<li>Preparare innanzitutto il caricamento dello strato pesante nella parte inferiore del sacchetto riempiendo la camera con 130 mL di soluzione densa di gradiente (HD; 1,087 g/mL). Caricare a una velocità della pompa di 150 mL/min.</li>
	<li>Una volta che il gradiente pesante è nel sacchetto, aggiungere 130 mL di gradiente ad alta densità (HD) al becher anteriore e 140 mL di gradiente a bassa densità (LD; 1,063 g/mL) a quello posteriore (morsetto chiuso).</li>
	<li>Scollegare l'emostatico/il morsetto tra le due camere e creare un gradiente continuo a una velocità della pompa di 50 mL/min.</li>
	<li>Preparare in anticipo cellule mononucleate da strato di buffy coat umano per la purificazione, ottenute da diversi sacchetti di buffy coat anonimi combinati, raccolti da scarti di sangue intero (da 40 mL a 60 mL di sangue intero sono stati aggiunti a 10 sacchetti di buffy coat), in base alla disponibilità della banca del sangue.
	<ol>
		<li>Separazione delle MNC
		<ol>
			<li>Utilizzare la centrifugazione su gradiente di densità per l'isolamento di cellule mononucleate umane a bassa densità. Per eseguire questa procedura, seguire i passaggi descritti di seguito.</li>
			<li>Per la preparazione delle cellule, calcolare il volume di sangue (sangue intero anticoagulato o buffy coat sospeso). Diluire il sangue con una soluzione tampone in rapporto 2-4 volte il volume, mescolando per inversione. Maggiore è la diluizione del sangue, migliore sarà la purezza delle cellule mononucleate.</li>
			<li>Preparare il buffer mescolando il tampone fosfato con un anticoagulante. Calcolare il numero di provette necessarie dividendo il volume di sangue per 35 mL e versare 15 mL di soluzione a gradiente di densità 1,073 in ciascuna provetta.</li>
			<li>Stratificare gradualmente 35 mL della sospensione di sangue diluito sopra il gradiente di densità, versandolo delicatamente sulla superficie del gradiente di densità mediante una siringa da 60 mL collegata a un ago; per volumi più piccoli, utilizzare una pipetta. Evitare di disturbare l'interfaccia, poiché ciò comprometterebbe la formazione di un adeguato strato di cellule mononucleate.</li>
			<li>Centrifugare a 400 x g per 20 min a 20 &#176;C senza interruzioni (accelerazione&#160;0, decelerazione&#160;0). Dopo la centrifugazione, raccogliere delicatamente lo strato di interfaccia delle cellule mononucleate utilizzando una pipetta sterile. Trasferire le cellule in un altro nuovo tubo conico da 50 mL.</li>
			<li>Lavare le cellule 2 volte con tampone (PBS con anticoagulante aggiunto). Per il primo lavaggio, riempire il tubo contenente le cellule con tampone fino a 50 mL. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 20 &#176;C per centrifugare le cellule (accelerazione&#160;9, decelerazione&#160;0). Rimuovere delicatamente tutto il soprannatante con attenzione.</li>
			<li>Eseguire il secondo lavaggio per la rimozione delle piastrine. Risospendere il pellet in un volume di 50 mL di tampone. Centrifugare a 200-300 x g per 10 min a 20 &#176;C (accelerazione&#160;9, decelerazione&#160;0).</li>
			<li>Ricostituire le cellule a un volume finale di 5 mL; queste cellule dovrebbero avere una densità specifica simile a quella dei MNC a bassa densità &#60;1.073. Misurare la densità specifica del gradiente con un densimetro.</li>
			<li>Risospendere il pellet in un volume finale di 100 mL aggiungendo 95 mL di mezzo per gradiente ad alta densità (1,083 g/mL) in un sacchetto di trasferimento. Utilizzare questo prodotto per la purificazione mediante separatore cellulare. Il volume finale di 100 mL contiene cellule e mezzo per gradiente ad alta densità 1,083. 
			NOTA: L'anello di cellule bianche può essere conservato in frigorifero per una notte in PBS contenente 0,5% di BSA o plasma autologo. L'anello di cellule bianche può anche essere lavato.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Caricare in superficie i gradienti preformati con un massimo di 30 mL di MNC isolati dal buffy coat, sospesi in 100 mL di mezzo di conservazione concentrato, utilizzando una pompa peristaltica a 25 mL/min. Mantenere il gradiente a +4 &#176;C.</li>
	<li>Misurare continuamente la temperatura all'interno del processore cellulare mediante una termosonda precalibrata. Utilizzando una termocoppia digitale collegata a una termosonda sterile, monitorare la temperatura dei gradienti e delle cellule durante il processo.</li>
</ol>
4. Ottimizzazione di diversi passaggi del caricamento in gradiente
<ol>
	<li>Inserire il kit del processore cellulare preraffreddato a +4 °C. Caricare il gradiente pesante (130 mL) a +4,5 °C. Al termine del caricamento del gradiente, impostare la centrifuga a una velocità relativamente bassa (537 x g) per minimizzare il calore generato dal rotore.</li>
	<li>Spegnere il processore cellulare per permettere al sistema idraulico di tornare ai livelli precedenti all'esecuzione e rilasciare l'aria.</li>
	<li>Riavviare il processore cellulare a 537 x g e aggiungere i gradienti ad alta (130 mL) e bassa (140 mL) densità per creare un gradiente di densità continuo a +4,3 °C e con una portata di 50 mL/min.</li>
	<li>Caricare il buffy coat (30 mL) con 100 mL di mezzo di conservazione freddo a +6 °C e una portata di 25 mL/min. Aggiungere 50 mL (25 mL x 2) di soluzione di lavaggio.</li>
	<li>Dopo 5 min a +5 °C, raccogliere il gradiente centrifugato in 12 bottiglie con una portata di 100 mL/min.</li>
	<li>Riempire i tubi con mezzo di lavaggio (M199 + 20% albumina umana + 10% penicillina-streptomicina). Riempire il tubo 1 con 100 mL di mezzo di lavaggio e 150 mL di cellule e i tubi da 2 a 12 con 225 mL di mezzo di lavaggio e 25 mL di cellule.</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreatic+islet+isolation+around+Europe%3A+results+of+a+survey+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study.</a> Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+pancreatic+digest+before+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Storage of pancreatic digest before islet purification.</a> Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).</li>
<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
<li>de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in type 1 diabetes.</a> BMJ. 342, (2011).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Le strutture di isolamento delle isole di tutto il mondo hanno adottato per decenni la purificazione delle isole umane in un processore cellulare riutilizzato. Sebbene alcuni impianti di produzione di isolotti continuino a lavorare gli isolotti in un processore di celle non refrigerato, la maggior parte dei centri utilizza una versione refrigerata del processore di celle 10,11,15. I centri posizionano il processore di celle in u...

Il trapianto di isole per il diabete di tipo 1 grave può ripristinare la secrezione endogena di insulina ed è diventato lo standard di cura in un certo numero di paesi1. L'isolamento delle isole è una procedura in più fasi che include la digestione enzimatica calda e meccanica del pancreas, seguita da fasi raffreddate per il recupero del tessuto digerito e dalla purificazione delle isole con gradienti di densità continui o discontinui su un processore cellulare. Il raffreddamento rapido rallenta la fase di digestione enzimatica e protegge le isole dagli enzimi digestivi liberati dalla contaminazione delle cellule acinose. Il processore cellulare è stato originariamente progettato per separare i componenti cellulari del sangue a temperatura ambiente2. È stato riproposto per purificare le isole pancreatiche umane di Langerhans nel 19893. Per tre decenni, le isole umane sono state purificate per studi clinici e, più recentemente, standard di cura, sia in un processore cellulare con gradienti discontinui4 o gradienti di densità continui1 realizzato con un creatore di gradienti1 o equivalente mixer computerizzato5,6,7. Altri gruppi hanno riportato la purificazione delle isole da grandi mammiferi e dall'uomo utilizzando grandi bottiglie di plastica cilindriche8,7,9, che hanno sostanzialmente migliorato l'efficacia della purificazione e la qualità delle isole.
Infatti, considerando il gold standard per purificare le isole umane per il trapianto clinico10,11, il processore cellulare prodotto era senza refrigerazione. Come diretta conseguenza della mancanza di refrigerazione, gli isolotti sono stati esposti a temperature crescenti durante la fase di purificazione. Durante la centrifugazione, si verifica un aumento incontrollato della temperatura a causa dell'attrito meccanico del rotore12,13. I processori cellulari sono stati adattati con un sistema di raffreddamento nei centri di isolamento delle isole che ha aumentato statisticamente la secrezione di insulina indotta dal glucosio e la vitalità cellulare, confermando il vantaggio di mantenere le isole pancreatiche a basse temperature durante la procedura di purificazione14,15.
Va notato che alla fine degli anni '80, 10 prototipi refrigerati sono stati costruiti per ridurre i danni alle isole durante la purificazione del gradiente di densità, ma non hanno ricevuto ulteriore attenzione. I prototipi del processore di celle si basavano sul raffreddamento del mandrino e della ciotola con glicole polietilenico refrigerato. In particolare, le soluzioni per la purificazione delle isole, comprese le soluzioni per la conservazione degli organi e i gradienti di densità dei polisaccaridi, possono essere deleterie per la vitalità delle isole se utilizzate a temperatura ambiente o superiore16,17,18. È stato valutato un confronto tra le diverse strategie di raffreddamento del processore di celle per la purificazione delle celle insulari rispetto al processore originale di celle non refrigerate per combattere l'aumento incontrollato della temperatura che si verifica a causa dell'attrito del rotore. Sono stati fatti diversi tentativi per raffreddare il processore cellulare durante la purificazione delle isole umane. Il processore di celle può essere alloggiato temporaneamente o permanentemente in una cella frigorifera appositamente progettata per mantenere una temperatura di 0-8 °C19 durante la centrifugazione a gradiente attualmente utilizzata presso i centri di isolamento delle isole presso l'Università dell'Illinois Chicago19, Università di Miami14, strutture dell'Università di Oxford15e l'Università di San Francisco (l'unità di raffreddamento personalizzata racchiude il processore della cella). Un'altra modifica include il raffreddamento del nucleo del mandrino del processore della cella con un sistema di raffreddamento che utilizza il raffreddamento ad azoto liquido controllato elettronicamente a Ginevra, Svezia e Repubblica Ceca15,19. Un'altra alternativa a metà del 2000 era il raffreddamento del nucleo del processore della cella con un'unità di condizionamento dell'aria12 o con il raffreddamento a liquido dell'albero presso l'Università di Lille.
Le modifiche al raffreddamento del processore della cella non sono prontamente disponibili e comportano rischi (umidità, accumulo di condensa) all'interno degli ambienti della camera bianca GMP, tra cui la perdita di garanzia e il rifiuto del costruttore di riparare la macchina. Di conseguenza, alcuni centri di isolotti, tra cui Milano, Italia, Oslo, Norvegia ed Edimburgo, Scozia, non utilizzano un sistema di raffreddamento per i processori di celle durante il processo di purificazione dell'isola15.
Il presente studio è stato progettato per testare l'efficacia di un dispositivo di raffreddamento prontamente disponibile di nuova concezione in combinazione con un sistema di elaborazione cellulare minimamente modificato. In breve, il raffreddatore ad aria qui descritto è uno scambiatore di calore refrigerato meccanicamente che controlla la temperatura di 1 piede cubo standard al minuto (SCFM) di gas secco tra -40 °C e -100 °C. Questo sistema di raffreddamento richiede un'alimentazione di aria medicale secca. L'aria fluirà attraverso la linea e lo scambiatore di calore e uscirà attraverso l'ugello (7,9 mm). Un riscaldatore situato all'interno dell'ugello fornisce calore per controllare la temperatura del flusso d'aria. È stato acquistato un coperchio della centrifuga in plastica solida di ricambio e sono state apportate modifiche minime. Nel coperchio è stato praticato un foro di 13,3 mm di diametro e l'aria raffreddata è stata erogata dall'ugello di raffreddamento al processore di celle attraverso il foro nel coperchio della centrifuga. L'aria medicale raffreddata è stata iniettata all'interno della tazza di centrifugazione del processore di celle con un controllo costante della temperatura dei liquidi o dei gradienti di densità.
Abbiamo valutato le prestazioni tecniche del processore a celle raffreddate e l'impatto dell'elemento di raffreddamento sull'ambiente della camera bianca GMP. L'obiettivo principale era quello di raggiungere una temperatura robustamente bassa (<10 °C) durante la purificazione delle isole umane per preservarne la vitalità. Utilizzando una separazione della densità del buffy coat come proxy per l'isolamento delle isole, abbiamo determinato l'efficacia di questo protocollo di raffreddamento sulla vitalità cellulare.

<table><tbody><tr><td>Equipaggiamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore di particelle d'aria</td><td>Lasair III&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AirJet XR40&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>FTS system XR40</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di Biosicurezza</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeratore di Raffreddamento a Circolazione</td><td>Julabo</td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991&nbsp;</td><td>Terumo BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di raffreddamento conico</td><td>Biorep</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>Creatore di gradienti a doppia camicia&nbsp;</td><td>personalizzato in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KJT-Termometro a termocoppia</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI93551N</td><td>Per misurare la temperatura dei liquidi</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico...</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880014</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica&nbsp;</td><td>Termometro MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>per temperatura COBE</td></tr><tr><td>Bagno di perline senz'acqua</td><td>Cole-Parmer</td><td>10122-00</td><td></td></tr><tr><td>Materiali e reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD kit di enumerazione delle cellule staminali</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>344563</tr><tr><td>Kit tubi COBE 2911</td><td>Terumo BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici 250ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Densità gradiente 1.1</td><td>Biochrom&nbsp;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglie monouso graduate</td><td>Thermo fisher</td><td>382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina umana 20%&nbsp;</td><td>Kedrion Biopharma</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio M199&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>99-784-CM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubi</td><td>Masterflex Masterflex</td><td>96400-6</td><td></td></tr><tr><td>Aria Secca Medica</td><td>Linde Healthcare</td><td>Medi On 22</td><td></td></tr><tr><td>Matitalina-streptomicina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Thermoprobe</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>Termosensore</td></tr><tr><td>Trypan blu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr> Università <tr><td>del Wisconsin Belzer (UW)</td><td>Ponte della Vita&nbsp;</td><td>RM/N 4055</td><td>Mezzo di conservazione</td></tr></tbody></table>

valutazione dell'impatto di un nuovo sistema di processore di celle di raffreddamento su un impianto di isolamento delle cellule insulari

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

L'attrezzatura standard per la terapia cellulare, incluso il processore cellulare gold standard per purificare le isole umane per il trapianto clinico, è raramente refrigerata, esponendo potenzialmente le cellule a temperature elevate durante la fase di centrifugazione. I sistemi di raffreddamento personalizzati hanno un vantaggio diretto sulla vitalità e sul funzionamento delle isole umane. Il presente studio è stato progettato per testare l'efficacia di un sistema di processore a celle raffreddate di nuova concezione, prontamente disponibile, che richiede modifiche minime e per valutare il suo impatto sulla vitalità delle cellule umane e sull'ambiente della camera bianca GMP. Il sistema di raffreddamento, uno scambiatore di calore refrigerato meccanicamente impostato a -30 °C, è stato utilizzato per fornire aria secca raffreddata di grado medico alla ciotola del processore di celle attraverso un foro praticato nel coperchio della centrifuga. Con la limitata disponibilità di donatori di pancreas in Qatar, la validazione del sistema è stata effettuata con la purificazione continua in gradiente di densità del buffy coat di midollo osseo umano raggruppato. La sterilità, la turbolenza e la conta delle particelle sono state misurate in camere bianche di classe C e classe B. Non si è sviluppata alcuna turbolenza intorno al processore della cella raffreddata e non sono state generate particelle sospese nell'aria in eccesso di 0,5 μm e 5 μm secondo gli standard GMP delle camere bianche. All'inizio e alla fine delle fasi di raccolta, la temperatura è salita rispettivamente a 21,50 °C ± 0,34 °C e 21,93 °C ± 0,20 °C nel processore a celle non raffreddate e a soli 10,9 °C ± 0,17 °C e 11,16 °C ± 0,35 °C nel processore a celle raffreddate (p <0,05). Il processore di celle raffreddate ha portato sia a un migliore recupero (98%) della frazione di celle mononucleate che alla vitalità (100% ± 2%) della post-elaborazione. Il nuovo sistema di raffreddamento riduce efficacemente il calore prodotto dal processore della cella senza avere alcun impatto del particolato sull'ambiente della camera bianca GMP. Il processore a celle raffreddate qui descritto è un metodo economico ($ 16.000 senza includere tasse, sdoganamento e trasporto) e minimamente invasivo per fornire un raffreddamento robusto. Attualmente, questa tecnologia nella struttura di terapia cellulare GMP viene applicata all'isolamento e al trapianto di cellule insulari umane per il programma clinico.

L'impatto del processore cellulare refrigerato sul cleanroom GMP è stato inizialmente quantificato. Metodi standardizzati hanno utilizzato un contatore di particelle per misurare la contaminazione da particolato aerodisperso in un ambiente di cleanroom GMP di classe C e classe B, in punti critici vicini al processore cellulare e al sistema di raffreddamento ad aria pressurizzata. I risultati hanno dimostrato che non si è sviluppata alcuna turbolenza intorno all'apparecchiatura. I dati registrati hanno mostrato l'assenza ...

Il protocollo qui descrive un sistema di processore di celle di raffreddamento personalizzato compatibile con una camera bianca GMP (Good Manufacturing Practices) per migliorare la vitalità delle celle dopo l'elaborazione.

Valutazione dell'impatto di un nuovo sistema di processore di celle di raffreddamento su un impianto di isolamento delle cellule insulari

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

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