Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule
May 12th, 2023
Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.
L'obiettivo principale di questo protocollo è studiare l'interazione di fattori genetici e ambientali nel contesto dello sviluppo cardiaco e il loro contributo ai difetti cardiaci congeniti. Gli approcci a singoli nuclei come l'RNA-seq a singolo nucleo e l'atassicità a nucleo singolo stanno emergendo come metodi chiave per studiare l'eterogeneità cellulare nella salute e nella malattia durante lo sviluppo del cuore. Un passo limitante di questi esperimenti è che tutto il campione deve essere eseguito contemporaneamente.
Mentre si lavora con tutte le condizioni sperimentali, raccogliere materiale abbastanza fresco per tutte le condizioni contemporaneamente potrebbe essere difficile. Sebbene negli ultimi anni ci siano stati progressi significativi nel campo in cella singola, la difficoltà principale è l'elaborazione di campioni liberi. Evitare la difficoltà è estremamente utile per identificare il meccanismo molecolare alla base dei difetti delle cardiopatie congenite.
Questo protocollo descrive i passi da seguire per isolare con successo nuclei di alta qualità da sospensioni di cellule cardiache congelate ottenute da embrioni di topo. E il nostro protocollo è compatibile con i singoli nuclei a valle RNA-seq e i singoli nuclei atassici. Speriamo che questa procedura aiuti i ricercatori interessati e li incoraggi a utilizzare questo potente metodo per le loro ricerche.
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Panoramica
Questo protocollo delinea la preparazione dei nuclei cellulari dal tessuto cardiaco per studiare lo sviluppo cardiaco e i difetti cardiaci congeniti. Sottolinea l'importanza degli approcci a singolo nucleo nella comprensione dell'eterogeneità cellulare in salute e malattia.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biologia cardiaca
- Eterogeneità cellulare
- Difetti cardiaci congeniti
Sfondo
- Il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo è un metodo chiave per studiare lo sviluppo cardiaco.
- Comprendere le interazioni genetiche e ambientali è cruciale per affrontare i difetti cardiaci congeniti.
- L'elaborazione di campioni freschi rimane una sfida significativa in questi studi.
- Identificare i meccanismi molecolari alla base delle malattie cardiache congenite è essenziale per far progredire il trattamento.
Scopo dello studio
- Indagare l'interazione dei fattori genetici e ambientali nello sviluppo cardiaco.
- Contribuire alla comprensione dei difetti cardiaci congeniti.
- Utilizzare approcci a singolo nucleo per studiare l'eterogeneità cellulare.
Metodi utilizzati
- Microdissezione del tessuto cardiaco.
- Dissorciazione enzimatica per ottenere cellule singole.
- Congelamento e isolamento di cellule progenitrici vitali.
- Sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e saggi di accessibilità della cromatina.
Principali risultati
- Preparazione di successo di nuclei cellulari vitali puri.
- Approfondimenti sull'eterogeneità cellulare durante lo sviluppo cardiaco.
- Identificazione dei meccanismi molecolari relativi ai difetti cardiaci congeniti.
- Dimostrazione della fattibilità degli approcci a singolo nucleo nella ricerca cardiaca.
Conclusioni
- Le tecniche a singolo nucleo sono efficaci per studiare lo sviluppo cardiaco.
- Comprendere l'eterogeneità cellulare è vitale per affrontare i difetti cardiaci congeniti.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per perfezionare questi metodi e migliorare l'elaborazione dei campioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Single-nucleus isolation from frozen mouse cardiac progenitor cells enables high-resolution epigenomic and transcriptomic profiling, overcoming the limitations of fresh tissue requirements. This capability supports robust investigation of cellular heterogeneity and regulatory mechanisms in heart development, directly impacting early discovery and target validation for congenital heart disease. Flexible sample handling and compatibility with dual-omics platforms enhance portfolio-wide experimental design and data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene regulatory networks in cardiac progenitor populations.
- Supports functional target validation by linking chromatin state to gene expression at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate pathways implicated in congenital heart defects.
- Improves predictive confidence in early-stage cardiac disease models.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality nuclei preparations suitable for standardized snRNA-seq and snATAC-seq workflows.
- Reduces technical variability by allowing batch processing of frozen samples across experimental conditions.
- Enables reproducible quantitative outputs for downstream compound or genetic perturbation screens.
- Supports scalable integration with microfluidic and high-throughput sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant cardiac progenitor systems.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust single-cell data.
- Supports identification of translational biomarkers for congenital heart disease research.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol positions itself at the interface of early discovery and preclinical research, enabling dual-omics profiling from frozen cardiac samples and supporting iterative hypothesis testing across the discovery continuum.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven analysis of gene expression and chromatin accessibility in cardiac progenitors.
- Screening: Delivers reproducible nuclei inputs for high-throughput sequencing assays.
- Analytics: Provides quantitative single-nucleus data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Preserves disease-relevant cellular states for biomarker and mechanism studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for cardiac single-nucleus studies across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable nuclei isolation from frozen samples.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization and cross-study data integration for cardiac research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cell handling, and nuclei isolation techniques.
- Demands access to microfluidic platforms and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and viability assessment protocols.
- Adaptable to various cardiac developmental stages and experimental models.
- Dependent on rigorous quality control of nuclei integrity and viability prior to sequencing.
