Name: Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Scopri la perfusione epatica normotermica ex vivo nel topo per studiare i meccanismi molecolari del rigeneramento d'organo. Questo sistema permette di identificare nuovi additivi per il perfusato e salvare organi marginali.

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Durante la stesura di questo documento, ho ricevuto un grande sostegno e assistenza. Vorrei ringraziare in particolare il mio compagno di squadra XinPei Chen per la sua meravigliosa collaborazione e il supporto paziente durante la mia operazione.

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le attuali normative e linee guida tedesche per il benessere degli animali e le linee guida ARRIVE per la segnalazione della ricerca sugli animali. Il protocollo di sperimentazione animale è stato approvato dal Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Germania (numero di approvazione: UKJ - 17 - 106).
NOTA: I topi maschi C57BL/6J del peso di 34 ± 4 g (errore medio ± standard della media [SEM]) sono stati utilizzati come donatori di fegato. Sono stati mantenuti in condizioni ambientali controllate (50% di umidità e 18 - 23 ° C) con libero accesso a chow di topo standard e acqua. Durante la procedura chirurgica, è stata mantenuta una frequenza respiratoria superiore a 60 respiri / min e la temperatura corporea è stata mantenuta al di sopra di 34 ° C.
1. Preparazione
<ol><li>Impostazione della tabella delle operazioni
	<ol><li>Autoclave tutti gli strumenti chirurgici e materiali di consumo per scopi di sterilizzazione.</li>
		<li>Accendere tutte le apparecchiature, compresa la scheda riscaldante e l'elettrocoagulazione.</li>
		<li>Introdurre una siringa da 50 mL con 25 mL di soluzione salina eparinizzata (2.500 U/L) in un incubatore caldo (37 °C).</li>
		<li>Posizionare gli strumenti chirurgici, la sutura di seta 6 - 0, il piccolo applicatore di cotone sterile, la soluzione salina veterinaria (500 ml) e le spugne di garza non tessuta (10 cm x 10 cm) sul tavolo operatorio in modo appropriato.</li>
		<li>Posizionare un ago da 26 G sul tavolo operatorio per creare un piccolo foro nel coperchio della provetta da microcentrifuga da 0,5 mL per ricevere il tubo biliare per la raccolta della bile.</li>
		<li>Posizionare la cannula (cannula in poliuretano 1 Fr o cannula in polietilene UT - 03) e una provetta sterilizzata da microcentrifuga da 0,5 ml per la raccolta della bile sul tavolo operatorio.</li>
	</ol></li>
	<li>Cannula venosa porta autoprodotta
	<ol><li>Tenere la cannula 2 Fr con una pinza e perforare la parete con un ago da 30 G a una distanza di 1 cm dall'estremità della cannula. Spingere l'ago attraverso la cannula fino a quando la punta dell'ago diventa visibile.</li>
		<li>Tagliare la punta della cannula ottenendo un triangolo acuto.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di soluzione salina eparinizzata
	<ol><li>Preparare 25 ml di soluzione salina eparinizzata con una concentrazione finale di 2.500 UI/ml.</li>
		<li>Rimuovere tutte le bolle d'aria e posizionare la siringa nell'incubatore a 40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dimostrazione del sistema di perfusione
	<ol><li>Vedere la Figura 1 per i componenti principali del sistema di perfusione della macchina.</li>
	</ol></li>
	<li>Allestimento della camera d'organo
	<ol><li>Vedere la Figura 2 per la disposizione della camera dell'organo.</li>
	</ol></li>
	<li>Messa a punto del sistema di perfusione
	<ol><li>Attivare il programma grafico di laboratorio per il monitoraggio della pressione.</li>
		<li>Collegare il calibratore di pressione e il sensore di pressione a livello della camera dell'organo.</li>
		<li>Regolare il calibratore di pressione per leggere 0 mmHg e controllare il valore corrispondente sul software di controllo della pressione.</li>
		<li>Regolare il calibratore di pressione per leggere 20 mmHg e controllare nuovamente il valore corrispondente sul software di controllo della pressione.</li>
		<li>Accendere il bagnomaria e preriscaldare la camera dell'organo a 40 °C.</li>
		<li>Lavare l'intero sistema idraulico due volte con acqua deionizzata distillata per 30 minuti ciascuno, garantendo la completa rimozione della soluzione igienizzante.</li>
		<li>Avviare la circolazione della soluzione di disinfezione in tutto il sistema per una durata di 20 minuti per garantire una disinfezione completa.</li>
		<li>Accendere la miscela di gas (95% di ossigeno (O 2) e 5% di anidride carbonica (CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Riempimento in perfusato
	<ol><li>Integrare 250 mL di terreno E di Williams con 50 mL di siero bovino fetale, 3 mL di penicillina/streptomicina (1 mg/ml), 0,17 mL di insulina (100 IE/mL), 0,34 mL di eparina (5000 U/mL) e 0,07 mL di idrocortisone (100 mg/2 mL) per preparare il mezzo Williams' E completo.</li>
		<li>Aggiungere volumi uguali (150 ml) di perfulato al serbatoio e alla camera dell'organo per innescare il sistema. NOTA: È necessario prestare particolare attenzione al mantenimento della sterilità durante il processo di riempimento. Il perfufato viene costantemente pompato attraverso questi due componenti chiave della perfusione della macchina a ricircolo chiuso.</li>
		<li>Accendere la pompa peristaltica a velocità media (15 ml/min) per innescare il sistema di perfusione con il mezzo ossigenato.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Espianto di fegato
<ol><li>Preparazione pre-operatoria
	<ol><li>Pesare l'animale. Preparare l'analgesico buprenorfina (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg di peso corporeo).</li>
		<li>Collegare la camera di induzione con la presa a muro. Portare l'ossigeno a 0,5 L/min. Portare l'isoflurano al 3%.</li>
		<li>Posizionare l'animale nella camera fino a raggiungere l'anestesia profonda (riflesso di raddrizzamento positivo).</li>
		<li>Utilizzare una micro siringa per applicare la dose di analgesia adattata al peso corporeo per via sottocutanea.</li>
		<li>Utilizzare un rasoio elettrico per tagliare la pelliccia sulla pelle addominale.</li>
		<li>Trasferire il mouse sul tavolo operatorio e accendere il vaporizzatore isoflurano al 2,5% per mantenere l'anestesia. Confermare la profondità dell'anestesia testando il riflesso interdigitale della punta.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dell'addome del topo
	<ol><li>Posizionare il mouse in posizione supina.</li>
		<li>Testare il riflesso interdigitale per confermare due volte la profondità appropriata dell'anestesia. Fissare tutti e quattro gli arti con del nastro adesivo.</li>
		<li>Disinfettare entrambi i lati dell'addome fino alla linea ascellare centrale usando tre cicli consecutivi di iodio-alcool. Utilizzare garze sterilizzate non tessute per coprire l'area intorno al campo chirurgico.</li>
		<li>Effettuare un'incisione trasversale di 3 cm 1 cm sotto lo xifoide nella zona addominale del topo usando le forbici per bambini Metzenbaum e una pinza chirurgica.</li>
		<li>Estendere l'incisione cutanea bilateralmente alla linea medioascellare su entrambi i lati.</li>
		<li>Fare con attenzione un'incisione longitudinale di 2 cm lungo la linea alba usando le forbici a molla.</li>
		<li>Tagliare lo strato muscolare addominale con elettrocoagulazione e forbici a molla Vannas.</li>
		<li>Posizionare con cura un pezzo di garza bagnata per proteggere il fegato dall'elettrocoagulazione.</li>
		<li>Utilizzare una sutura di seta 6 - 0 con l'ago rotondo per ritrarre il processo xifoideo per una migliore esposizione del legamento coronarico.</li>
		<li>Utilizzare due divaricatori costali per esporre completamente la cavità addominale del topo.</li>
		<li>Spostare con attenzione l'intestino tenue fuori dalla cavità addominale con un batuffolo di cotone bagnato per esporre completamente l'ilo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del dotto biliare comune
	<ol><li>Transetto i legamenti falciformi, frenici e gastroepatici con forbici affilate.</li>
		<li>Liberare con cura il dotto biliare comune usando una pinza curva fine senza denti. NOTA: Il dotto biliare comune è molto facilmente danneggiato e si rompe. Una volta che si rompe, non può essere incannulato. A causa della direzione della posizione anatomica, è meglio usare una pinza curva.</li>
		<li>Posizionare due anelli di sutura di seta 6 - 0 sul dotto biliare comune in preparazione per il passaggio successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incannulamento del dotto biliare comune
	<ol><li>Forare accuratamente il dotto biliare con un ago da 30 G. Utilizzare una pinza curva appuntita per allargare il piccolo foro per adattarsi all'incannulamento del dotto biliare.</li>
		<li>Utilizzare una pinza per l'incannulamento dei vasi per afferrare la cannula del dotto biliare e spingerla nel dotto biliare.</li>
		<li>Fissare due volte la cannula con i passanti di sutura 6 - 0 preimpostati. NOTA: Durante l'incannulamento, si avverte resistenza alla bile. Se la forza non è ben controllata, la cannula verrà spinta fuori dalle vie biliari dalla pressione del deflusso biliare. Regolare con attenzione la profondità della cannula. Se è troppo profondo, può danneggiare il dotto biliare e, se non è abbastanza profondo, potrebbe scivolare fuori.</li>
		<li>Osservare il flusso biliare nella cannula dopo l'incannulamento riuscito.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della vena porta
	<ol><li>Bloccare la vena porta con una pinza piatta e liberare con cura il tessuto connettivo con una pinza curva. Non tirare forte per evitare di causare lacerazione della vena porta. Una volta che la vena porta è danneggiata, è difficile ri-cannulare la vena porta.</li>
		<li>Sezionare il PV appena superiore alla biforcazione e posizionare il primo anello di sutura usando la sutura di seta 6 - 0 sul PV vicino alla confluenza per un uso successivo.</li>
		<li>Posizionare il secondo anello di sutura per la successiva fissazione del PV il più vicino possibile all'ilo epatico.</li>
	</ol></li>
	<li>Incannulamento della vena porta
	<ol><li>Utilizzare una clip arteriosa per chiudere la vena porta distale.</li>
		<li>Con molta attenzione, forare la vena porta con una delle cannule della vena porta sopra. Il flusso sanguigno può essere chiaramente osservato all'interno della cannula dopo una puntura di successo.</li>
		<li>Fissare la cannula PV con l'anello di sutura 6 - 0 pre-posizionato.</li>
	</ol></li>
	<li>Vampate di calore del fegato
	<ol><li>Aumentare l'isoflurano al 5% e eutanasia il topo con un sovradosaggio di inalazione di isoflurano.</li>
		<li>Prendere la soluzione salina di eparina preriscaldata dall'incubatore. Rimuovere tutte le bolle d'aria formate all'interno della soluzione salina eparinizzata.</li>
		<li>Fissare la siringa con soluzione salina eparinizzata preriscaldata nella pompa della siringa.</li>
		<li>Collegare il tubo di prolunga della pompa della siringa alla cannula della vena porta, regolare la velocità a 2 ml / min e avviare il lavaggio del fegato.</li>
		<li>Osservare il colore del fegato alla fine della procedura di lavaggio. Eliminare il fegato una volta che il colore diventa giallo omogeneo.</li>
		<li>Transetto il diaframma, la vena cava inferiore sopraepatica, la vena cava infraepatica, l'arteria epatica, la vena porta distale e qualsiasi tessuto connettivo rimanente.</li>
		<li>Mettere il fegato nella capsula di Petri.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Connessione fegato e camera
<ol><li>Trasferimento del fegato
	<ol><li>Trasferire con cautela il fegato nella camera dell'organo usando una capsula di Petri.</li>
		<li>Mantenere una piccola quantità di soluzione salina nella capsula di Petri per evitare che il fegato si secchi. NOTA: La vena porta e il dotto biliare possono essere facilmente attorcigliati durante questa procedura, il che può influenzare la perfusione epatica e la raccolta della bile.</li>
	</ol></li>
	<li>Connessione cannula venosa porta
	<ol><li>Infondere lentamente la soluzione salina normale nella cannula della vena porta con una siringa per evacuare le bolle d'aria nella cannula.</li>
		<li>Collegare la cannula della vena porta nel tubo di deflusso del perfulato nella camera dell'organo.</li>
	</ol></li>
	<li>Connessione cannula del dotto biliare
	<ol><li>Guidare la cannula del dotto biliare del topo attraverso la valvola di un cappuccio di gomma collegato alla camera dell'organo.</li>
		<li>Inserire la cannula del dotto biliare in un microtubo da 0,5 ml pre-preparato con un piccolo foro nel coperchio.</li>
		<li>Posizionare il microtubo sull'argilla all'esterno della camera dell'organo.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Regolare la portata in base alla pressione fotovoltaica
<ol><li>Accendere la pompa peristaltica da 1 ml/min.</li>
	<li>Controllare la lettura della pressione della vena porta per regolare la portata.</li>
	<li>Mantenere la pressione della vena porta nell'intervallo fisiologico tra 7 - 10 mmHg regolando la portata. NOTA: La portata nominale può variare leggermente a seconda dell'utilizzo e del posizionamento dei tubi.</li>
</ol>5. Raccolta dei campioni
<ol><li>Ottenere campioni di perfusato in ingresso dal tubo di afflusso della vena porta e campioni di perfusato di uscita dalla camera dell'organo in intervalli di 3 ore.</li>
	<li>Raccogliere campioni da tutti i lobi del fegato per l'analisi istologica alla fine del periodo di perfusione di 12 ore.</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse finanziari da divulgare.

Passaggi critici nel protocollo I due passaggi cruciali nell'espianto di fegato sono l'incannulamento della vena porta (PV) e il successivo incannulamento del dotto biliare (BD). Questi passaggi sono di fondamentale importanza per garantire il successo del prelievo degli organi e delle successive procedure di perfusione o trapianto.
Sfide e soluzioni L'incannulamento fotovoltaico presenta tre sfide: lesione della parete del vaso, spostamento del catetere...

Il trapianto di fegato rappresenta il trattamento gold standard per gli individui con malattia epatica allo stadio terminale. Purtroppo, la domanda di organi da donatore supera l'offerta disponibile, portando a una carenza significativa. Nel 2021, circa 24.936 pazienti erano in lista d'attesa per un trapianto di fegato, mentre solo 9.234 trapianti sono stati eseguiti con successo1. La significativa disparità tra l'offerta e la domanda di innesti di fegato evidenzia la pressante necessità di studiare strategie alternative per ampliare il pool di donatori e migliorare l'accessibilità degli innesti di fegato. Un modo per espandere il pool di donatori consiste nell'utilizzare donatori marginali2. I donatori marginali includono quelli con età avanzata, steatosi moderata o grave. Sebbene il trapianto di organi marginali possa produrre risultati favorevoli, i risultati complessivi rimangono non ottimali. Di conseguenza, è attualmente in corso lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a migliorare la funzione dei donatori marginali 3,4.
Una delle strategie è quella di utilizzare la perfusione della macchina, in particolare la perfusione della macchina ossigenata normotermica, per migliorare la funzione di questi organi marginali5. Tuttavia, esiste ancora una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che sono alla base degli effetti benefici della perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I topi, con la loro abbondante disponibilità di ceppi geneticamente modificati, servono come modelli preziosi per studiare i percorsi molecolari. Ad esempio, l'importanza delle vie autofagiche nel mitigare il danno da ischemia-riperfusione epatica è stata sempre più riconosciuta 6,7. Un'importante via molecolare nel danno da ischemia-riperfusione epatica è la via 8 di miR-20b-5p/ATG7. Attualmente, sono disponibili un certo numero di ceppi di topi knockout ATG e knock-out condizionali, ma nessun ceppo di ratto corrispondente9.
Sulla base di questo background, l'obiettivo era quello di generare una piattaforma NEVLP miniaturizzata per innesti di fegato di topo. Questa piattaforma faciliterebbe l'esplorazione e la valutazione di potenziali strategie geneticamente modificate volte a migliorare la funzionalità del fegato del donatore. Inoltre, era essenziale che il sistema fosse adatto alla perfusione a lungo termine, consentendo il trattamento ex vivo del fegato, comunemente indicato come "riparazione d'organo".
Considerando la limitata disponibilità di dati in vitro rilevanti sulla perfusione epatica di topo, la revisione della letteratura si è concentrata su studi condotti sui ratti. Una ricerca sistematica della letteratura che va dal 2010 al 2022 è stata eseguita utilizzando parole chiave come "perfusione epatica normotermica", "ex vivo o in vitro" e "ratti". Questa ricerca mirava a identificare le condizioni ottimali nei roditori, permettendoci di determinare l'approccio più appropriato.
Il sistema di perfusione è costituito da un serbatoio tampone di vetro sigillato con camicia d'acqua, una pompa a rulli peristaltica, un ossigenatore, una trappola a bolle, uno scambiatore di calore, una camera d'organo e un sistema di tubi ciclici chiusi (Figura 1). Il sistema garantisce il mantenimento preciso di una temperatura di perfusione costante di 37 °C utilizzando una macchina termostatica dedicata. La pompa a rulli peristaltici guida il flusso del perfusato in tutto il circuito. Il circuito di perfusione inizia nel serbatoio isolato con camicia d'acqua. Successivamente, il perfusato viene diretto attraverso l'ossigenatore, che riceve una miscela di gas del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica da una bombola di gas dedicata. Dopo l'ossigenazione, il perfusato passa attraverso la trappola a bolle, in cui eventuali bolle intrappolate vengono reindirizzate al serbatoio dalla pompa peristaltica. Il perfusato rimanente scorre attraverso lo scambiatore di calore ed entra nella camera dell'organo, da dove ritorna al serbatoio.
Qui, riportiamo le nostre esperienze nella creazione di un NEVLP per fegati di topo e condividiamo i risultati promettenti di un esperimento pilota eseguito utilizzando il mezzo ossigenato senza vettori di ossigeno.

<table><tbody><tr><td>Micro tubo da 0,5 ml PP</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>Cannula in gomma da 1 Fr Cannula</td><td></td><td>per campioni</td><td>Vygon</td></tr><tr><td>10 & micro; L Micro Siringa</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 Fr Cannula in Gomma</td><td>Vygon</td><td>Cannula</td><td></td>Campione</tr><tr><td>24 G Cannula a Farfalla</td><td>Terumo</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26 G Cannula a Farfalla</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30 G Ago Ipodermico</td><td>Sterican</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Pompa a siringa</td><td>Braun</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>Clip Arteriosa</td><td>Braun</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>Camera Umida Autoclavabile</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>Grande Applicatore di Cotone&nbsp;</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>Bubble Trap</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0,3 mg / ml)</td><td>Elanco</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>CIDEX OPA solution (2 L)</td><td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>Unità elettrochirurgica per taglio monopolare VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (500 ml)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di gas (95 % di ossigeno e 5 % di anidride carbonica)</td><td>Forniture domestiche</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>Riscaldamento Bagni circolanti</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>Eparina 5000 (IE / 5 ml)</td><td>Braun</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone (100 mg / 2 ml)</td><td>Pfizer</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>insulina (100 IE / ml)</td><td>Forbici per iride Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (250 ml)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Ossigenatore a membrana</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per microchirurgia&nbsp;</td><td></td> Set di divaricatori per mouse Leica <td>M60</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualità Carfil</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td>Hamamatsu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Spugne non tessu&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina (1 mg / ml)&nbsp;</td><td>C.C.Pro</td><td>Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di prolunga per perfusione (30 cm)</td><td>Braun</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishc 100x15 mm</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td><td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>Simulatore di trasduttore di pressione</td><td>UTAH Medical Products</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttori di pressione sanguigna riutilizzabili AD</td><td>Instruments</td><td>MLT-0380/D</td><td></td></tr><tr><td>S & Pinze per incannulamento dei vasi a T</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di cotone piccolo</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Pinze diritte 10 cm&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per legare suture</td><td>Fine Science Instruments</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 50ml Original Perfusor</td><td>Braun</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 Cannula</td><td>Unique Medical, Japan</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina veterinaria (500 ml)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>Water Jacketed Reservoir&nbsp; 2 L</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 ML)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusione della macchina epatica normothermic ex vivo nel topo

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

Questo protocollo presenta un sistema NEVLP ottimizzato privo di eritrociti utilizzando fegati di topo. La conservazione ex vivo dei fegati di topo è stata ottenuta impiegando cannule modificate e tecniche adattate dalle tradizionali apparecchiature commerciali di perfusione ex vivo . Il sistema è stato utilizzato per valutare i risultati di conservazione dopo 12 ore di perfusione. I topi C57BL / 6J sono serviti come donatori di fegato e i fegati sono stati espiantati inannulando la vena porta (PV) e il dotto biliare (BD), e successivamente lavando l'organo con soluzione salina eparinizzata calda (37 ° C). Quindi, i fegati espiantati sono stati trasferiti nella camera di perfusione e sottoposti a perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I campioni di perfusato in ingresso e in uscita sono stati raccolti a intervalli di 3 ore per l'analisi del perfusato. Al termine della perfusione, sono stati ottenuti campioni di fegato per l'analisi istologica, con integrità morfologica valutata utilizzando Suzuki-Score modificato attraverso la colorazione dell'ematossilina-eosina (HE). Gli esperimenti di ottimizzazione hanno prodotto i seguenti risultati: (1) i topi di peso superiore a 30 g sono stati ritenuti più adatti per l'esperimento a causa delle maggiori dimensioni del loro dotto biliare (BD). (2) una cannula in poliuretano da 2 Fr (diametro esterno = 0,66 mm) era più adatta per l'incannulamento della vena porta (PV) rispetto a una cannula in polipropilene. Ciò è stato attribuito alla maggiore presa del materiale poliuretanico, con conseguente riduzione dello slittamento del catetere durante il trasferimento dal corpo alla camera dell'organo. (3) per l'incannulamento del dotto biliare (BD), una cannula in poliuretano da 1 Fr (diametro esterno = 0,33 mm) è risultata più efficace rispetto alla cannula in polipropilene UT - 03 (diametro esterno = 0,30 mm). Con questo protocollo ottimizzato, i fegati di topo sono stati conservati con successo per una durata di 12 ore senza un impatto significativo sulla struttura istologica. La colorazione dell'ematossilina-eosina (HE) ha rivelato un'architettura morfologica ben conservata del fegato, caratterizzata da epatociti prevalentemente vitali con nuclei chiaramente visibili e lieve dilatazione delle sinusoidi epatiche.

Istituzione della procedura chirurgica Un totale di 17 animali sono stati utilizzati per questo esperimento: 14 topi sono stati impiegati per ottimizzare il processo di approvvigionamento degli organi, compreso l'incannulamento della vena porta (PV) e del dotto biliare (BD), mentre 3 topi sono stati utilizzati per convalidare la procedura (Tabella 1). I risultati istologici (Figura 3) sono stati confrontati per facilitare l'identificazione della condizion...

È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l'esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Perfusione della macchina epatica ex-vivo normomica nel topo. La perfusione epatica ossigenata normadremica è una strategia promettente per salvare gli organi marginali ed è stata recentemente introdotta nella pratica clinica. Tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti non sono ben compresi.È necessario un modello murino per studiare ulteriormente i percorsi molecolari, sfruttando animali geneticamente modificati, come i topi transgenici, quindi in attesa di stabilire un sistema di perfusione normotermica ossigenata per fegati di topo. Ecco uno schema del nostro intero sistema. Innanzitutto, l'intero sistema è controllato a 37 gradi centigradi da un controller termostatico attraverso la circolazione dell'acqua.Il perfulato viene pompato dal serbatoio da una pompa peristaltica in un ossigenatore. C'è un flusso di gas ininterrotto del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica nell'ossigenatore. Il perfusato passa quindi attraverso una trappola a bolle.Il perfusato con bolle d'aria viene pompato nel serbatoio sotto pressione. Il perfusato rimanente scorre verso la camera dell'organo dove il tubo è collegato alla vena porta. Il perfusato viene drenato dal fegato attraverso il c

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Engineering

Ingegneria

Lo studio della fisiologia degli organi animali può essere ottenuto eseguendo un sistema sperimentale di perfusione ex vivo. L'aggiunta di un rene suino, come organo omeostatico, al nostro modello di perfusione epatica ex vivo precedentemente sviluppato, può essere un passo fondamentale per ottenere un ambiente fisiologico migliore.

Fasi per l'esperimento esperimento epatico-renale suino autologo ex vivo perfuso

Innesti marginali, come fegati grassi, innesti da donatori di età superiore o fegati prelevati dopo la morte cardiaca (DCD) tollerano stoccaggio statico convenzionale, freddo solo male. Abbiamo sviluppato un nuovo modello di subnormothermic ex vivo perfusione epatica per la conservazione, la valutazione, e la riparazione di fegati marginali prima del trapianto.

Tecnica di Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fegato perfusione per la Conservazione, valutazione e riparazione dei marginali fegato innesti

Qui vi presentiamo un protocollo che descrive ossigenato ex situ macchina di perfusione di fegati donatore. Questo articolo contiene un passo per passo protocollo di procurarsi e preparare il trapianto di fegato per la macchina di perfusione, preparare il liquido di perfusione, primo la macchina di perfusione ed eseguire ossigenato normotermica macchina perfusione del trapianto di fegato.

Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori

Descriviamo un metodo di ex vivo macchina perfusione di innesti di fegato umano a temperatura subnormothermic (21 ° C).

Umana Funzionale Fegato Conservazione e recupero mediante Subnormothermic macchina di perfusione

C'è una carenza significativa donatore di fegato, e i criteri per i donatori di fegato sono stati ampliati. Perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato sviluppato per valutare e modificare la funzione dell'organo. Questo studio dimostra un modello del ratto di NEVLP e verifica la capacità di pegylated-catalasi, per attenuare la lesione di conservazione del fegato.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

Il protocollo descrive un metodo semplice di resezione di un fegato di topo intatto per studi metabolici attraverso la perfusione della vena porta.

Ex Vivo Perfusione epatica attraverso la vena porta nel topo

Il modello suino di perfusione meccanica normotermica epatica (NMP), qui descritto, può essere utilizzato con successo per studiare l'NMP come strategia di conservazione, strumento per la valutazione della vitalità e piattaforma per la riparazione d'organo. Ha un alto valore traslazionale, tuttavia è tecnicamente impegnativo e laborioso.

Perfusione epatica isolata normotermica suina

Qui, presentiamo un protocollo per un sistema di perfusione normotermico ex vivo open source e modificabile, progettato per superare l'alto costo e la limitata flessibilità delle piattaforme esistenti, consentendo un uso più accessibile, economico e iterativo nella ricerca biomedica preclinica.

Un sistema di perfusione normotermica open-source progettato per i ricercatori

Questo video descrive i fondamenti delle tecniche di proiezione digitale a frange, che forniscono misurazioni 3D dense di superfici che cambiano dinamicamente. Dimostra anche la progettazione e il funzionamento di un sistema di sfocatura binaria ad alta velocità basato su queste tecniche.

Imaging video tridimensionale ad alta risoluzione e ad alta velocità con tecniche di proiezione digitale con frangia

Ponti liquidi electrohydrodynamic orizzontali e verticali sono strumenti semplici e potenti per esplorare l'interazione di alta intensità di campi elettrici e liquidi dielettrici polari. La costruzione di apparecchi di base ed esempi operativi, comprese le immagini termografiche, per tre liquidi (ad esempio, acqua, DMSO e glicerolo) è presentato.

La preparazione di Electrohydrodynamic Ponti da Polar dielettrici liquidi

Scopri la perfusione epatica normotermica ex vivo nel topo per studiare i meccanismi molecolari del rigeneramento d'organo. Questo sistema permette di identificare nuovi additivi per il perfusato e salvare organi marginali.

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

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