Imaging di mtHyPer7, un biosensore raziometrico per il perossido mitocondriale, in cellule di lievito viventi
2 giugno 2023
Il perossido di idrogeno (H 2 O2 ) è sia una fonte di danno ossidativo che una molecola di segnalazione. Questo protocollo descrive come misurare l'H 2 O2mitocondriale utilizzando HyPer7 mirato ai mitocondri (mtHyPer7), un biosensore raziometrico geneticamente codificato, nel lievito vivente. Descrive in dettaglio come ottimizzare le condizioni di imaging ed eseguire analisi quantitative cellulari e subcellulari utilizzando software disponibili gratuitamente.
I mitocondri sono organelli all'interno delle cellule che facilitano la mobilizzazione dell'energia, il metabolismo centrale, la produzione di macromolecole vitali, l'immagazzinamento del calcio e la trasduzione del segnale. Di conseguenza, svolgono un ruolo cruciale nella funzione cellulare, nella forma fisica e nel controllo della durata della vita. La nostra ricerca si concentra sullo studio dell'impatto dei mitocondri sull'invecchiamento utilizzando il lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae come organismo modello.
L'imaging di cellule vive è il nostro strumento migliore per osservare la variazione della funzione mitocondriale. Qui descriviamo un metodo che utilizza un biosensore di spostamento spettrale metrico del rapporto geneticamente codificato chiamato mitocondriale HyPer7. mtHyPer7 rileva il perossido di idrogeno, una specie reattiva dell'ossigeno, che può danneggiare i costituenti cellulari, ma funziona anche come molecola di segnalazione nei mitocondri delle cellule vive.
mtHyPer7 ha un'elevata affinità per il perossido di idrogeno e una bassa sensibilità al pH. È integrato nel genoma del lievito, il che si traduce in un'espressione stabile e coerente nelle popolazioni di cellule di lievito. Infine, è quantitativamente mirato ai mitocondri e non ha alcun effetto rilevabile sulla funzione cellulare o mitocondriale o sulla forma fisica.
I biosensori come mtHyPer7 sono fondamentali per studiare la funzione mitocondriale a risoluzione subcellulare, per trovare i meccanismi alla base del controllo di qualità mitocondriale e per esaminare come tale processo influisce sulla forma fisica cellulare, sull'alimentazione e sulla durata della vita. Il colorante mtHyPer7 fornisce un lavoro costante in contrasto con i coloranti organici utilizzati per il rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno. Rispetto ai sensori basati su FRET, mtHyPer7 è più compatto ed evita problemi come l'eccitazione incrociata e il bleed through, nonché il posizionamento preciso e i requisiti di orientamento per FRET.
Panoramica
Questo studio analizza la funzione mitocondriale nel lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae, concentrandosi sul ruolo del perossido di idrogeno (H2O2) sia come agente dannoso che come molecola di segnalazione. Utilizzando un biosensore genetamente codificato e rapportometrico, mtHyPer7, i ricercatori descrivono un metodo per misurare quantitativamente l'H2O2 mitocondriale in cellule vive.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito di Ricerca
- Funzione mitocondriale
- Stress ossidativo
- Invecchiamento nei lieviti
Sfondo
- Le mitocondri sono essenziali per la produzione di energia cellulare e per il segnale.
- L'H2O2 può causare danni ossidativi ma agisce anche nelle vie di segnalazione.
- La funzionalità mitocondriale è collegata alla durata e alla salute della cellula.
Metodi Utilizzati
- Imaging di cellule vive con il biosensore mtHyPer7
- Organismo modello: Saccharomyces cerevisiae
- Microscopia a fluorescenza per analisi quantitativa
Risultati principali
- Acquisizione riuscita dei livelli di H2O2 mitocondriale in cellule di lievito vive.
- Definizione delle condizioni ottimali per l'acquisizione delle immagini e l'analisi dell'immagine.
- Dimostrazione che mtHyPer7 non influisce sulla funzione cellulare o sul fitness.
Conclusioni
- Questo studio illustra un metodo affidabile per misurare l'H2O2 mitocondriale e le sue implicazioni per la salute cellulare.
- Contribuisce alla comprensione del controllo della qualità mitocondriale e dei suoi effetti sull'invecchiamento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging quantitativo del perossido di idrogeno mitocondriale in cellule di lievito vive consente un'analisi precisa dello stato redox mitocondriale, un determinante chiave nella salute cellulare e nella modellizzazione delle malattie. Il biosensore mtHyPer7 fornisce letture robuste e riproducibili dello stress ossidativo, supportando la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei percorsi di scoperta. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva negli studi sulla funzione mitocondriale rilevanti per l'invecchiamento, i disturbi metabolici e il controllo della qualità cellulare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette la misurazione diretta dell'H2O2 mitocondriale per chiarire i meccanismi guidati dallo stato redox.
- Supporta la validazione funzionale delle vie di controllo della qualità mitocondriale.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico distinguendo gli eventi ossidativi di segnalazione da quelli dannosi.
- Fornisce un'espressione stabile del biosensore integrato nel genoma per un'analisi biologica costante.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce output quantitativi e rapportati, adatti alla standardizzazione e riproducibilità dei saggi.
- Prepara modelli di lievito validati per lo screening di composti mirati alla modulazione redox mitocondriale.
- Consente flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto con stabilità del segnale robusta e interferenze di fondo minime.
- Supporta letture scalabili e pronte per piattaforma per la valutazione comparativa di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le misurazioni redox mitocondriali ai fenotipi rilevanti per la malattia nei sistemi modello.
- Consente una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di interventi mirati ai mitocondri.
- Fornisce endpoint quantitativi per decisioni di avanzamento corrette in base al rischio nei portafogli di ricerca mitocondriale.
- Semplifica lo sviluppo di biomarcatori per lo stress ossidativo e il disfunzionamento mitocondriale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro di imaging mtHyPer7 integra le fasi iniziali della scoperta fino allo sviluppo del saggio e alla ricerca preclinica, sostenendo studi basati su ipotesi e la continuità traslazionale.
- Biologia della scoperta: L'imaging quantitativo con biosensori consente la verifica di ipotesi sui meccanismi redox mitocondriali e la mappatura dei percorsi metabolici.
- Screening: Uscite raziometriche ed espressione stabile supportano lo sviluppo di saggi riproducibili e scalabili per lo screening di composti.
- Analisi: Permette confronti statistici robusti dei livelli mitocondriali di H2O2 in diverse condizioni e popolazioni cellulari.
- Ricerca traslazionale: Fornisce endpoint quantitativi rilevanti per le malattie, utili per la validazione di modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Linee cellulari con biosensori integrati nel genoma e script di analisi open source facilitano l'adozione trasversale a progetti e team.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi mitocondriali e negli studi meccanicistici.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di imaging e analisi per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione (go/no-go) e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei programmi di ricerca mitocondriale.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione degli obiettivi e degli interventi mitocondriali in base a un'adeguata valutazione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine di cellule vive e nell'analisi quantitativa della fluorescenza.
- Necessita dell'accesso a un microscopio confocale a disco rotante e a un software di analisi compatibile (ad esempio, Fiji/ImageJ).
- Richiede una standardizzazione intersettoriale dei parametri di acquisizione e degli script di analisi per garantire la riproducibilità.
- Adattabile ad altri biosensori e sistemi modello mediante ottimizzazione del protocollo.
- Dipende da un'integrazione genica e da un'espressione costanti per ottenere risultati affidabili.
