Name: Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Scopri un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali tra membrana interna ed esterna. Questa tecnica aiuta a studiare il complesso MICOS e l'importazione di lipidi nelle cellule.

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M.E.H. ringrazia la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), progetto numero 413985647, per il sostegno finanziario. Gli autori ringraziano il Dr. Michael Kiebler, dell'Università Ludwig-Maximilians di Monaco di Baviera, per il suo generoso e ampio sostegno. Siamo grati a Walter Neupert per il suo contributo scientifico, le discussioni utili e la continua ispirazione. J.F. ringrazia la Graduate School Life Science Munich (LSM) per il supporto.

1. Tamponi e soluzioni madre
<ol><li>Preparare una soluzione di acido 1 M di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) in acqua deionizzata, pH 7,4. Conservare a 4 °C.</li>
	<li>Preparare 500 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in acqua deionizzata, pH 8,0. Conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il sorbitolo 2,4 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.</li>
	<li>Preparare il saccarosio 2,5 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.</li>
	<li>Preparare 200 mM di fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) in isopropanolo. Conservare a −20 °C. ATTENZIONE: Il PMSF è tossico se ingerito e provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Non respirare la polvere e indossare guanti e occhiali protettivi.</li>
	<li>Preparare l'acido tricloroacetico (TCA) al 72% in acqua deionizzata. Conservare a 4 °C. ATTENZIONE: Il TCA può causare irritazione respiratoria, gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Non respirare la polvere e indossare guanti e occhiali protettivi.</li>
	<li>Preparare il tampone SM: 20 mM MOPS e 0,6 M di sorbitolo, pH 7,4.</li>
	<li>Preparare il tampone di rigonfiamento: 20 mM di MOPS, 0,5 mM di EDTA, 1 mM di PMSF e cocktail di inibitori della proteasi, pH 7,4.</li>
	<li>Preparare i tamponi gradiente di saccarosio: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M e 1,3 M di saccarosio in 20 mM di MOPS e 0,5 mM di EDTA, pH 7,4. NOTA: Tutti i tamponi possono essere conservati a 4 °C; tuttavia, si consiglia di conservare i tamponi contenenti saccarosio a una temperatura di -20 °C per evitare la crescita di funghi. Gli inibitori della proteasi devono essere aggiunti appena prima dell'uso.</li>
</ol>2. Generazione di vescicole sottocondriali
<ol><li>Isolare i mitocondri del lievito grezzo fresco secondo i protocolli stabiliti34,35. NOTA: Per questo esperimento, i mitocondri sono stati isolati da Saccharomyces cerevisiae. Non è necessaria la generazione di mitocondri puri a gradiente privi di altri organelli.</li>
	<li>Risospendere 10 mg di mitocondri appena isolati in tampone SM da 1,6 mL (4 °C) mediante pipettaggio (Figura 2, fase 1).</li>
	<li>Trasferire la sospensione mitocondriale in un matraccio di Erlenmeyer preraffreddato da 100 mL.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 16 mL di tampone di rigonfiamento utilizzando una pipetta di vetro da 20 mL. Applicare una leggera agitazione costante sul ghiaccio durante l'aggiunta. Questo trattamento osmotico provoca l'assorbimento dell'acqua nello spazio della matrice. Il gonfiore della membrana interna mitocondriale interromperà la membrana esterna. Tuttavia, entrambe le membrane rimarranno in contatto nei siti di contatto9 (Figura 2, passaggio 2).</li>
	<li>Incubare i campioni con una leggera agitazione costante per 30 minuti su ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 5 mL di soluzione di saccarosio 2,5 M utilizzando una pipetta di vetro da 5 mL per aumentare la concentrazione di saccarosio nei campioni a circa 0,55 M. Questo trattamento osmotico provoca un efflusso d'acqua dalla matrice36. Il restringimento della membrana interna ha lo scopo di massimizzare la sua distanza dai frammenti residui della membrana esterna. Ciò riduce la probabilità di generare vescicole ibride artificiali delle membrane interne ed esterne attraverso la sonicazione (Figura 2, passaggio 3).</li>
	<li>Incubare i campioni sotto leggera agitazione per 15 minuti su ghiaccio.</li>
	<li>Sottoporre i mitocondri a sonicazione per generare vescicole di membrana sottocondriali (Figura 2, passaggio 4).<ol><li>Trasferire la sospensione mitocondriale in una cella a rosetta preraffreddata.</li>
		<li>Sonicare la sospensione mitocondriale con un'ampiezza del 10% per 30 s mentre si raffredda la cella a rosetta in un bagno di ghiaccio.</li>
		<li>Far riposare la sospensione per 30 secondi in un bagno di ghiaccio.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.8.2 e 2.8.3 altre tre volte. NOTA: Le condizioni di sonicazione variano a seconda del sonicatore utilizzato. L'ottimizzazione sarà necessaria per le singole macchine. Una sonicazione troppo dura porterà alla formazione artificiale di vescicole costituite da membrane mitocondriali interne ed esterne.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Separazione delle vescicole sottocondriali
<ol><li>Separare le vescicole generate dai mitocondri intatti rimanenti mediante centrifugazione a 20.000 x g per 20 minuti a 4 °C. I mitocondri intatti pelletteranno mentre le vescicole rimarranno nel surnatante.</li>
	<li>Concentrare la miscela di vescicole.<ol><li>Trasferire il surnatante in provette di ultracentrifugazione fresche.</li>
		<li>Caricare un cuscino di 0,3 mL di soluzione di saccarosio 2,5 M sul fondo della provetta utilizzando una siringa da 1 mL dotata di cannula da 0,8 mm x 120 mm.</li>
		<li>Centrifugare a 118.000 x g per 100 minuti a 4 °C. NOTA: In questo caso è stato utilizzato un rotore a benna oscillante con un raggio massimo di 153,1 mm. Le condizioni di centrifugazione dipendono fortemente dal rotore e dovranno essere adattate quando si utilizza un altro rotore.</li>
	</ol></li>
	<li>Le vescicole appariranno come un disco sulla parte superiore del cuscino di saccarosio dopo la centrifugazione. Scartare circa il 90% del surnatante. A questo punto, raccogliere le vescicole concentrate risospendendole nel tampone rimanente, compreso il saccarosio da 2,5 M, mediante pipettaggio su e giù. Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore Dounce ghiacciato.</li>
	<li>Omogeneizzare la sospensione con almeno 10 colpi utilizzando un vasaio in politetrafluoroetilene.</li>
	<li>Preparare il gradiente di saccarosio.<ol><li>Per un gradiente a gradini di 11 mL con cinque passaggi (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M di saccarosio in 20 mM di MOPS e 0,5 mM di EDTA, pH 7,4), ogni strato ha 2,2 mL di soluzione di saccarosio. NOTA: Si consiglia un rifrattometro per misurare e regolare le concentrazioni di saccarosio; Tuttavia, non è essenziale. Applicare 10 μL di tampone al rifrattometro e rilevare i rispettivi indici di rifrazione. Il calcolo della concentrazione di saccarosio è il seguente: <img alt="Equazione della concentrazione di saccarosio nella molarità; Diagramma per l'analisi della misurazione dell'indice di rifrazione." src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 1,3333 rappresenta l'indice di rifrazione dell'acqua. 0,048403 è un indice di conversione specifico del saccarosio ottenuto dalla scala lineare della rifrazione molare alla concentrazione di saccarosio in soluzioni acquose 37.</li>
		<li>Aggiungere la massima concentrazione di saccarosio alla provetta di centrifugazione e mettere la provetta a -20 °C. Attendere che lo strato sia completamente congelato prima di applicare quello successivo. Procedere di conseguenza fino all'aggiunta dell'ultimo strato e conservare i gradienti a −20 °C. NOTA: Ricordarsi di trasferire i gradienti congelati a 4 °C quando si inizia l'esperimento per consentire lo scongelamento dei gradienti. Ci vorranno circa 3 ore. Per la centrifugazione è stato utilizzato un rotore a secchiello oscillante con una capacità di 13,2 mL. Quando si utilizza un rotore diverso, i volumi del passo di gradiente devono essere adattati di conseguenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare la concentrazione di saccarosio dei campioni utilizzando un rifrattometro. Se non c'è accesso a un rifrattometro, si potrebbe in alternativa supporre che la concentrazione di saccarosio sia di 2 M. Questa presunta concentrazione di saccarosio sarà quindi la base per il passo successivo.</li>
	<li>Regolare la concentrazione di saccarosio a 0,6 M aggiungendo una quantità appropriata di 20 mM MOPS, 0,5 mM di EDTA, 1 mM di PMSF e cocktail di inibitori della proteasi, pH 7,4. Se la concentrazione di saccarosio è stimata a 2 M invece di essere misurata, si consiglia di verificare se la concentrazione è sufficientemente bassa dopo l'aggiustamento. Applicare una piccola aliquota del campione (ca. 50 μL) sopra 200 μL di saccarosio 0,8 M in una provetta. Il campione deve rimanere sopra il saccarosio 0,8 M.</li>
	<li>Caricare i campioni (circa 1 mL) sopra il gradiente di saccarosio (mantenere il 10% per riferimento futuro). Un pipettaggio accurato è importante per evitare il disturbo del gradiente (Figura 2, fase 5).</li>
	<li>Separare le vescicole mediante centrifugazione a 200.000 x g e 4 °C per 12 ore. Se possibile, impostare la centrifuga su un'accelerazione e una decelerazione lente per evitare il disturbo del gradiente (Figura 2, passaggio 6). NOTA: In questo caso è stato utilizzato un rotore a benna oscillante con un raggio massimo di 153,1 mm. Le condizioni di centrifugazione dipendono fortemente dal rotore e dovranno essere adattate quando si utilizza un altro rotore.</li>
	<li>Prelevare il gradiente dall'alto verso il basso in frazioni da 700 μL utilizzando una pipetta da 1 mL. Ciò si tradurrà in 17 frazioni, che consentono una risoluzione sufficiente.</li>
</ol>4. Analisi delle vescicole sottocondriali
<ol><li>Concentrare le proteine sottoponendo ciascuna frazione a due precipitazioni di TCA eseguite in sequenza38 per preparare i campioni SDS-PAGE.<ol><li>Aggiungere 200 μL di TCA al 72% alle singole frazioni e mescolare fino a ottenere una soluzione omogenea. Incubare le frazioni per 30 minuti su ghiaccio e pellettizzare le proteine precipitate mediante centrifugazione a 20.000 x g e 4 °C per 20 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 μL di soluzione di TCA al 28 %, mescolare bene e ripetere la fase di centrifugazione.</li>
		<li>Lavare i pellet con 1 mL di acetone (−20°C) e centrifugare per 10 minuti a 20.000 x g e 4 °C. Scartare il surnatante e lasciare asciugare i pellet all'aria. Risospendere i pellet in 60 μL di tampone SDS e incubare i campioni per 5 minuti a 95 °C. NOTA: Una grande quantità di saccarosio rimarrà, in particolare nelle frazioni ad alta densità, dopo la prima precipitazione TCA. Questo verrà rimosso attraverso l'ulteriore precipitazione TCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare 20 μL di ciascuna frazione mediante SDS-PAGE39 e immunoblotting40,41,42,43.</li>
</ol>

Isolamento dei siti di contatto mitocondriali

Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

Il frazionamento mitocondriale è un esperimento complicato con diverse fasi molto complesse. Pertanto, abbiamo mirato a migliorare ulteriormente e, in una certa misura, semplificare il nostro metodoconsolidato 32. In questo caso, le sfide erano la necessità di attrezzature complicate e altamente specializzate, che spesso sono costruzioni individuali, e l'enorme consumo di tempo ed energia. A tal fine, abbiamo cercato di rimuovere le pompe e le singole costruzioni utilizzate per la colata e la racc...

I mitocondri svolgono una varietà di funzioni diverse negli eucarioti, la più nota delle quali è la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Altre funzioni includono la produzione di cluster ferro-zolfo, la sintesi lipidica e, negli eucarioti superiori, la segnalazione di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi 1,2,3,4. Queste funzioni sono indissolubilmente legate alla loro complessa ultrastruttura.
L'ultrastruttura mitocondriale è stata descritta per la prima volta al microscopio elettronico5. È stato dimostrato che i mitocondri sono organelli piuttosto complessi costituiti da due membrane: la membrana esterna mitocondriale e la membrana interna mitocondriale. Pertanto, da queste membrane si formano due compartimenti acquosi: lo spazio intermembrana e la matrice. La membrana interna mitocondriale può essere ulteriormente suddivisa in diverse sezioni. La membrana perimetrale interna rimane in prossimità della membrana esterna e le cristae formano invaginazioni. Le cosiddette giunzioni crista collegano la membrana perimetrale interna e le cristae (Figura 1). Inoltre, le micrografie elettroniche dei mitocondri osmoticamente ridotti rivelano che esistono siti in cui le membrane mitocondriali sono strettamente collegate 6,7. Questi cosiddetti siti di contatto sono formati da complessi proteici che attraversano le due membrane (Figura 1). Si ritiene che questi siti di interazione siano essenziali per la vitalità cellulare a causa della loro importanza per la regolazione della dinamica mitocondriale e dell'ereditarietà, nonché per il trasferimento di metaboliti e segnali tra il citosol e la matrice8.
Il complesso MICOS nella membrana interna mitocondriale è probabilmente il complesso di formazione del sito di contatto meglio caratterizzato e più versatile. MICOS è stato descritto nel lievito nel 2011 ed è costituito da sei subunità 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 e Mic10. Questi formano un complesso di circa 1,5 MDa che si localizza alle giunzionicrista 9,10,11. La delezione di una delle due subunità principali, Mic10 o Mic60, porta all'assenza di questo complesso 9,11, il che significa che queste due subunità sono essenziali per la stabilità di MICOS. È interessante notare che MICOS forma non solo uno, ma più siti di contatto con varie proteine e complessi della membrana esterna mitocondriale: il complesso TOM 11,12, il complesso TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, il complesso Fzo1-Ugo19, Por1 10, OM45 10 e Miro 17. Ciò indica fortemente che il complesso MICOS è coinvolto in vari processi mitocondriali, come l'importazione di proteine, il metabolismo dei fosfolipidi e la generazione dell'ultrastruttura mitocondriale18. Quest'ultima funzione è probabilmente la funzione principale di MICOS, in quanto l'assenza del complesso MICOS indotta attraverso la delezione di MIC10 o MIC60 porta ad un'ultrastruttura mitocondriale anomala che manca praticamente completamente di cristae regolari. Invece, le vescicole della membrana interna senza connessione alla membrana di confine interna si accumulano19, 20. È importante sottolineare che MICOS è conservato nella forma e nella funzione dal lievito all'uomo21. L'associazione delle mutazioni nelle subunità MICOS con gravi malattie umane sottolinea anche la sua importanza per gli eucarioti superiori22,23. Sebbene MICOS sia altamente versatile, devono esistere ulteriori siti di contatto (sulla base delle nostre osservazioni non pubblicate). Infatti, sono stati identificati diversi altri siti di contatto, ad esempio i meccanismi di fusione mitocondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1, che è coinvolto nella biosintesi del fosfolipide mitocondriale specifico cardiolipina 27. Recentemente, abbiamo migliorato il metodo che ci ha portato all'identificazione di MICOS per identificare Cqd1 come parte di un nuovo sito di contatto formato con il complesso di membrana esterna Por1-Om1428. È interessante notare che questo sito di contatto sembra anche essere coinvolto in molteplici processi come l'omeostasi della membrana mitocondriale, il metabolismo dei fosfolipidi e la distribuzione del coenzima Q28,29.
Qui, abbiamo usato una variazione del frazionamento dei mitocondri 9,30,31,32,33 precedentemente descritto. Il trattamento osmotico dei mitocondri porta alla rottura della membrana esterna mitocondriale e ad un restringimento dello spazio della matrice, lasciando le due membrane solo in stretta vicinanza nei siti di contatto. Ciò consente la generazione di vescicole costituite esclusivamente da membrana esterna mitocondriale o membrana interna mitocondriale o in siti di contatto contenuti di entrambe le membrane attraverso una lieve sonicazione. A causa della membrana interna mitocondriale che possiede un rapporto proteine-lipidi molto più elevato, le vescicole della membrana interna mitocondriale presentano una densità maggiore rispetto alle vescicole della membrana esterna mitocondriale. La differenza di densità può essere utilizzata per separare le vescicole di membrana attraverso la centrifugazione a gradiente di densità galleggiante del saccarosio. Pertanto, le vescicole della membrana esterna mitocondriale si accumulano a basse concentrazioni di saccarosio, mentre le vescicole della membrana interna mitocondriale si arricchiscono ad alte concentrazioni di saccarosio. Le vescicole contenenti i siti di contatto si concentrano a concentrazioni intermedie di saccarosio (Figura 2). Il seguente protocollo descrive in dettaglio questo metodo migliorato, che richiede attrezzature, tempo ed energia meno specializzate rispetto al nostroprecedente 32, e fornisce uno strumento utile per l'identificazione di possibili proteine del sito di contatto.

<table><tbody><tr><td>13,2 mL, Provetta ultra-trasparente a parete sottile aperta, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Instruments, Germania</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 mL, Provetta aperta in policarbonato a parete spessa aperta, 29 x 104 mm</td><td>Beckman Instruments, Germania</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso A-25.50 - Alluminio, 8 x 50 mL, 25.000 giri/min, 75.600 x g</td><td>Beckman Instruments, Germania</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>Abbe rifrattometro</td><td>Zeiss, Germania</td><td></td><td>fuori produzione, qualsiasi rifrattometro Abbe può essere utilizzato</td></tr><tr><td>accu-jet pro Pipet Controller</td><td>Brandtech, USA</td><td>BR26320</td><td>fuori produzione, qualsiasi pipetta controller sarà sufficiente</td></tr><tr><td>Becher 1000 mL</td><td>DWK Life Science, Germany</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>Branson&nbsp; Sonificatore digitale W-250 D</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonic 3mm MICROTIP conico</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 200 e 400 Watt Sonificatori: Cella di raffreddamento a rosetta</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti JXN-26</td><td>Beckman Instruments, Germania</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Optima XPN-100 ultra</td><td>Beckman Instruments, Germania</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td><td>Roche, Svizzera</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Roth, Germania</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Acido etilendiammina-tetraacetico sale disodico diidrato)</td><td>Roth, Germania</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di Erlenmeyer, 100 mL</td><td>Roth, Germania</td>Pipetta graduata <td>X747.1</td><td></td></tr><tr><td>, Kl. B, 25:0, 0.1</td><td>Hirschmann, Germania</td><td>1180170</td><td></td></tr><tr><td>pipetta graduata, Kl. B, 5:0, 0.05</td><td>Hirschmann, Germania</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>bagno di ghiaccio</td><td>neoLab, Germania</td><td> S12651</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico RCT basic</td><td>IKA-Werke GmbH, Germania</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (acido 3-(N-Morpholino)propansolfonico)</td><td>Gerbu, Germania</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200</td><td>Gilson, USA</td><td></td><td></td>FP10005S</tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Germania</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF)</td><td>Serva, Germania</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>CANNULA STERICAN 21 Gx4 4/5 0,8x120 mm</td><td>Braun, Germania</td><td>4022495052414</td><td></td></tr><tr><td>barra di agitazione, 15 mm</td><td>VWR, USA</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck, Germania</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotore a secchiello oscillante</td><td>Beckman Instruments, Germania</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td><td>Eppendorf, Germania</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Macinatori di tessuti, tipo Potter-Elvehjem, recipiente di vetro da 2 mL</td><td>VWR, USA</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>Macinatori di tessuti, tipo Potter-Elvehjem, stantuffo da 2 mL con punta seghettata</td><td>VWR, USA</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico ( TCA)</td><td>Sigma Aldrich, Germania</td><td>33731</td><td>fuori produzione, qualsiasi TCA sarà sufficiente (CAS: 73-03-9)</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germania</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

I mitocondri sono presenti praticamente in tutte le cellule eucariotiche e svolgono funzioni essenziali che vanno ben oltre la produzione di energia, ad esempio la sintesi di cluster ferro-zolfo, lipidi o proteine, il tamponamento di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi. Allo stesso modo, la disfunzione mitocondriale provoca gravi malattie umane come il cancro, il diabete e la neurodegenerazione. Per svolgere queste funzioni, i mitocondri devono comunicare con il resto della cellula attraverso il loro involucro, che consiste di due membrane. Pertanto, queste due membrane devono interagire costantemente. I siti di contatto proteici tra la membrana mitocondriale interna ed esterna sono essenziali in questo senso. Finora sono stati identificati diversi siti di contatto. Nel metodo qui descritto, i mitocondri di Saccharomyces cerevisiae vengono utilizzati per isolare i siti di contatto e, quindi, identificare i candidati che si qualificano per le proteine del sito di contatto. Abbiamo usato questo metodo per identificare il complesso MICOS (Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System), uno dei principali complessi di formazione del sito di contatto nella membrana interna mitocondriale, che si conserva dal lievito all'uomo. Recentemente, abbiamo ulteriormente migliorato questo metodo per identificare un nuovo sito di contatto costituito da Cqd1 e dal complesso Por1-Om14.

È relativamente facile separare le membrane mitocondriali interne ed esterne. Tuttavia, la generazione e la separazione delle vescicole contenenti il sito di contatto sono molto più difficili. A nostro avviso, due passaggi sono critici ed essenziali: le condizioni di sonicazione e il gradiente utilizzato.
Di solito, si pensa che i gradienti lineari abbiano una risoluzione migliore rispetto ai gradienti a gradini. Tuttavia, la loro produzione riproducibile è noiosa e richiede attrezzature speci...

I siti di contatto mitocondriali sono complessi proteici che interagiscono con le proteine della membrana interna ed esterna mitocondriale. Questi siti sono essenziali per la comunicazione tra le membrane mitocondriali e, quindi, tra il citosol e la matrice mitocondriale. In questo articolo, descriviamo un metodo per identificare i candidati che si qualificano per questa specifica classe di proteine.

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Il nostro obiettivo è quello di comprendere la funzione molecolare dei siti di contatto mitocondriale, che permettono la comunicazione tra le due membrane mitocondriali. Questo in realtà è un prerequisito per comprendere la funzione della biogenesi mitocondriale e, quindi, la vitalità cellulare. Abbiamo scoperto un nuovo sito di contatto tra la membrana mitocondriale interna ed esterna creato da Cqd1 e Om14-Por1.I nostri dati suggeriscono che questo sito potrebbe aiutare nell'importazione di lipidi come l'acido fosfatidico. Sulla base dell'identificazione del complesso MICOS, abbiamo contribuito a comprendere più a fondo come viene generata l'architettura della membrana mitocondriale. Questo ci ha permesso di sviluppare un modello di lavoro che spiega come si formano le due forme di cristae mitocondriali, lamellare e tubulare.La nostra ricerca è stata fatta in passato sul lievito. Tuttavia, siamo convinti che la formazione di una corretta architettura mitocondriale sia importante anche per gli eucarioti superiori. Quindi il prossimo passo nella nostra ricerca è analizzare il ruolo degli elementi dell'architettura mitocondriale in modelli più complessi come i neuroni primari.

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Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è &lt;30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Qui descritto è un metodo per rilevare e quantificare proteine ​​di membrana mitocondriale esterna da immunomarcatura di mitocondri isolati da tessuto roditore e l'analisi mediante citometria a flusso. Questo metodo può essere esteso a valutare aspetti funzionali di sottopopolazioni mitocondriali.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Come i mitocondri sono solo una piccola percentuale della cellula vegetale, hanno bisogno di essere purificato per una serie di studi. I mitocondri possono essere isolati da una varietà di organi vegetali di omogeneizzazione, seguita da centrifugazione in gradiente di differenziale e densità per ottenere una frazione altamente purificata mitocondriale.

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Qui presentiamo un protocollo per estrarre, risolvere e identificare i supercomplessi mitocondriali che minimizzano l'esposizione ai detergenti e a Coomassie Blue. Questo protocollo offre un equilibrio ottimale tra la risoluzione e la conservazione delle attività enzimatiche, riducendo al minimo il rischio di perdere le interazioni proteina-proteina labile.

Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Presentiamo un protocollo in due fasi per l'isolamento dei mitocondri di alta qualità che è compatibile con la scoperta e la quantificazione delle proteine su scala proteoma. Il nostro protocollo non richiede ingegneria genetica ed è quindi adatto per studiare i mitocondri da qualsiasi cellula e tessuto primario.

Isolamento dei mitocondri senza tag in due fasi per migliorare la scoperta e la quantificazione delle proteine

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Studi bioenergetici e metabolomici sui mitocondri hanno rivelato il loro ruolo multiforme in molte malattie, ma i metodi di isolamento per questi organelli variano. Il metodo qui descritto è in grado di purificare mitocondri di alta qualità da più fonti di tessuto. La qualità è determinata dai rapporti di controllo respiratorio e da altre metriche valutate con la respirometria ad alta risoluzione.

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori 

Scopri un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali tra membrana interna ed esterna. Questa tecnica aiuta a studiare il complesso MICOS e l'importazione di lipidi nelle cellule.

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

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