Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Questo protocollo presenta un approccio trans-sclerale guidato dalla visione transpupillare per fornire in modo sicuro e preciso innesti cellulari sottoretinici, con un basso tasso di complicanze chirurgiche, in riceventi murini con o senza degenerazione retinica.

L'obiettivo generale di questo studio è quello di sviluppare una piattaforma di trapianto trans-sclerale con guida transpupillare diretta per facilitare la consegna sottoretinica di cellule in riceventi murini. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la Guida del National Institute of Health. La nostra dichiarazione sull'uso degli animali è approvata dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Johns Hopkins University.

I topi che adottano l'età dei topi EGFP al giorno 3-6 postnatale sono stati utilizzati come donatori di sospensioni di cellule retiniche. I topi OPN1LW-EGFP/NRL, di età postnatale al 3° giorno postnatale, sono stati adottati come donatori di fogli retinici. Come riceventi sono stati utilizzati topi Rd1/NS adulti con degenerazione retinica con immunodeficienza.

Sopprimere i topi donatori con sovradosaggio di anidride carbonica. Per isolare i bulbi oculari dei topi, apri con cura le palpebre dei cuccioli usando una microforbice ed esponi il bulbo oculare. Avvolgi il nervo ottico ed estrai il bulbo oculare con una pinza liscia.

Una volta isolati i bulbi oculari, incidi un foro al centro della cornea utilizzando un ago calibro 25. Taglia la cornea a metà attraverso il foro. E allargare l'incisione alla sclera e all'RPE.

Quindi rimuovere la sclera e l'RPE. Successivamente, utilizzare una pinza microdentata per rimuovere delicatamente il cristallino e il vitreo per isolare la retina neurale. Per raccogliere la sospensione retinica del donatore, incubare la retina neurale in una soluzione di papaina a 37 gradi centigradi per 20-30 minuti fino a quando non sono rilevabili grumi di cellule.

Raccogliere le singole cellule seguendo le istruzioni del produttore del kit Papaina. Per preparare il foglio di retina, mettere la retina isolata in una capsula di Petri con PBS. Quindi tagliare delicatamente la retina neurale in più fogli retinici con una micro forbice.

Anestetizzare i topi riceventi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Assicurarsi che il piano di anestesia raggiunto sia il piano chirurgico in cui l'animale perde il battito delle palpebre e i riflessi del dolore, ma la respirazione e la respirazione rimangono regolari. Valutare la profondità dell'anestetico pizzicando la coda o i riflessi di ritiro del pedale.

Ricontrollare la profondità dell'anestetico durante la procedura operatoria. Tenere i topi sul tavolo operatorio preriscaldato per evitare l'ipotermia. Dilatare le pupille del ricevente con colliri a tropicamide cinque minuti prima dell'intervento.

Una pupilla ben dilatata può facilitare la visualizzazione transpupillare al microscopio operatorio. Metta una goccia di cloridrato di proparacaina sull'occhio dei topi per l'analgesia. Disinfettare l'occhio del topo operatorio e i tessuti oculari circostanti con iodio.

Quindi pulire l'occhio con PBS sterile. Penetrare nel tunnel periferico nella camera interna per ridurre la pressione intraoculare. Successivamente, metti una goccia di ialuronato di sodio e un vetrino coprioggetti sopra la cornea.

La visualizzazione transpupillare del fondo oculare del topo è ora disponibile nell'ambito chirurgico. Esporre il locus di iniezione spingendo la parete oculare verso il centro della visione transpupillare con una pinza dentata. Quindi penetrare parzialmente nella sclera con un ago per microiniezione, rivolto a 90 gradi rispetto alla parete oculare.

I vasi retinici superficiali possono fungere da riferimento anatomico per localizzare l'ago all'interno dello spazio sottoretinico. Quindi iniettare gli innesti di retina. Le piccole bolle precaricate nella siringa possono facilitare la convalida della posizione sottoretinica delle cellule del donatore.

Se la cornea diventa torbida, tenere l'ago nello spazio sottoretinico, fino a quando la cornea diventa trasparente per normalizzare la pressione intraoculare. Afferrare il bordo del foro di iniezione ed estrarre rapidamente l'ago. Il criterio per il successo della somministrazione della sospensione cellulare è un bleb costante nello spazio sottoretinico.

Una consegna di successo del foglio retinico, è convinta da un foglio bianco visibile. Tenere i topi trapiantati su una gabbia di recupero pulita preriscaldata e monitorarli attentamente per eventuali segni di pericolo. Se ciò accade, metta una goccia di cloridrato topico della proparacaina sull'occhio chirurgico per due, tre volte.

Rimuovi i topi nella gabbia di casa dopo che i topi sono completamente vigili e mobili. Metti un piccolo numero di pellet di cibo nella tazza di gel sul fondo della gabbia. Se i topi hanno difficoltà a raggiungere la tramoggia del cibo.

Due mesi dopo il trapianto, è stata eseguita un'oftalmoscopia laser a scansione confocale multimodale per verificare gli stati degli innesti retinici osservati in vivo. La tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale ha mostrato che gli innesti retinici sono sopravvissuti nello spazio sottoretinico e ricostituiscono lo strato nucleare esterno di tutti i topi riceventi. L'imaging a infrarossi non ha rilevato cataratta evidente in tutti i topi trapiantati.

Altre complicanze chirurgiche, tra cui l'emorragia, sono state mal rilevate nei topi trapiantati mediante imaging a riflettanza multicolore. La colorazione istologica ha mostrato abbondanti fotorecettori a cono che esprimono OPN1LW:EGFP e S-opsina nei fogli retinici trapiantati. Allo stesso modo, il trapianto di sospensioni di cellule retiniche ha mostrato un'ampia percentuale di fotorecettori positivi in recupero in vivo, tra cui numerosi bastoncelli EGFP positivi maturi.

I topi non trapiantati hanno mostrato una grave degenerazione dello strato nucleare esterno con scarsi fotorecettori residui dei coni che esprimevano il recupero. Tuttavia, nessun segnale EGP è stato rilevato nei topi non trapiantati. Questo studio fornisce una piattaforma chirurgica trans-sclerale con una guida diretta alla visione transpupillare per il trapianto sottoretinico in riceventi murini.

Questa piattaforma consente la somministrazione precisa di dosi note di cellule. È relativamente facile imparare e facilitare la somministrazione sottoretinica oltre alle iniezioni intraretiniche o intravitreali per diversi tipi di agenti terapeutici, inclusa la terapia genica.