Name: Screening farmacologico cellulare per gli inibitori della peptidasi 4B cisteina correlata allautofagia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri lo screening farmacologico cellulare per identificare inibitori della peptidasi ATG4B correlata all'autofagia. Questo metodo basato su luciferasi supporta la ricerca sul cancro e le malattie neurodegenerative.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento di base del Medical Research Council del Regno Unito per la sovvenzione dell'unità universitaria MRC-UCL Ref MC_U12266B, dalla sovvenzione della piattaforma MRC Dementia UK MR/M02492X/1, dal cancro al pancreas nel Regno Unito (riferimento della sovvenzione 2018RIF_15) e dal programma di supporto all'accelerazione terapeutica dell'UCL, supportato dal finanziamento di MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Il plasmide che codifica per l'ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) è stato ottenuto dal Dr. Robin Ketteler (Dipartimento di Medicina Umana, Facoltà di Medicina di Berlino).

Analisi di screening ad alto rendimento per l'inibitore dell'autofagia della peptidasi 4B cisteina

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo protocollo descrive un saggio basato su cellule reporter-gene per l'identificazione degli inibitori di ATG4B. L'identificazione dei riscontri primari si basa sull'attività della luciferasi durante il trattamento di cellule che esprimono il frame di lettura aperto a lunghezza intera di LC3B tra β-actina e dNGLUC. Alcuni vantaggi di questo test sono che è sensibile, altamente quantitativo e non invasivo, in quanto può rilevare dNGLUC senza lisare le cellule. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la ...

L'autofagia è un processo metabolico conservato che consente alle cellule di mantenere l'omeostasi intracellulare e rispondere allo stress degradando il contenuto cellulare invecchiato, difettoso o non necessario attraverso i lisosomi 1,2,3. In alcune condizioni fisiopatologiche, questo processo agisce come una risposta cellulare cruciale alla privazione di nutrienti e ossigeno, con conseguente riciclaggio di nutrienti e lipidi, consentendo alle cellule di adattarsi alle loro esigenze metaboliche 2,3,4. L'autofagia è stata anche identificata come una risposta cellulare allo stress correlata a diverse malattie, come disturbi neurodegenerativi, infezioni da agenti patogeni e vari tipi di cancro. La funzione dell'autofagia nel cancro è complessa e dipende dal tipo, dallo stadio e dallo stato del tumore. Può sopprimere la tumorigenesi attraverso la degradazione autofagica delle cellule danneggiate, ma può anche promuovere la sopravvivenza dei tumori avanzati migliorando la sopravvivenza cellulare durante condizioni di stress, come l'ipossia, la privazione di nutrienti e il danno citotossico 2,4,5,6.
Diversi studi hanno dimostrato che l'inibizione dell'autofagia fornisce un beneficio come strategia antitumorale. Pertanto, l'inibizione di passaggi critici, come la formazione di un autofagosoma o la sua fusione con il lisosoma, potrebbe essere un metodo efficace per il controllo del cancro 2,4,5,6. Prove crescenti hanno dimostrato che ATG4B è coinvolto in alcune condizioni patologiche e ha guadagnato attenzione come potenziale bersaglio antitumorale 2,3,4. Ad esempio, è stato osservato che le cellule tumorali del colon-retto e le cellule di carcinoma mammario positive al recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) avevano livelli di espressione di ATG4B significativamente più elevati rispetto alle cellule normali adiacenti 2,4. Nelle cellule di carcinoma prostatico, l'inibizione di ATG4B ha determinato una suscettibilità specifica della linea cellulare alla chemioterapia e alla radioterapia7. Recentemente, è emersa una forte evidenza che l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è particolarmente vulnerabile all'inibizione di ATG4B. Ad esempio, in un modello murino geneticamente modificato, è stato dimostrato che la perdita intermittente della funzione di ATG4B riduce la crescita del tumore PDAC e aumenta la sopravvivenza 3,4. Nel complesso, ATG4B è altamente sovraespresso in alcuni tipi di cancro, è correlato alla progressione del tumore ed è legato alla resistenza alla terapia antitumorale 2,4,8.
Le proteasi della cisteina ATG4 nei mammiferi hanno quattro membri della famiglia, ATG4A-ATG4D. Queste proteine mostrano una certa selettività verso la famiglia di proteineLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 e possono avere funzioni aggiuntive non legate alla loro attività proteasica 12,13. Inoltre, ATG4 ha la funzione di regolare un nuovo tipo di modificazione post-traduzionale, l'ATG8-ilazione delle proteine11,12. Mentre ATG4B e il suo substrato principale LC3B sono i più studiati, sta emergendo un quadro che suggerisce un ruolo complesso per ciascun membro della sottofamiglia nella regolazione dei processi autofagici e non autofagici. Ciò è ulteriormente corroborato da una complessa rete di modificazioni post-traduzionali che regolano l'attività di ATG4B attraverso la fosforilazione, l'acetilazione, la glicosilazione e la nitrosilazione 9,10,11,12,13.
Diversi inibitori noti di ATG4B sono stati pubblicati 2,4,14,15. Sebbene questi siano adatti come strumenti di ricerca, il loro profilo farmacodinamico, la loro selettività o la loro potenza hanno ancora precluso loro lo sviluppo come candidati preclinici 4,16. Nel complesso, c'è un urgente bisogno di identificare composti più potenti e selettivi. Spesso, i composti sono buoni inibitori biochimici della funzione proteica, ma la loro efficacia nei saggi basati su cellule è scarsa. Esistono diversi saggi per monitorare l'attività di ATG4B, inclusi metodi biochimici e saggi basati su cellule4. In precedenza abbiamo sviluppato un semplice saggio ad alto rendimento basato sulla luminescenza per il monitoraggio dell'attività di ATG4B nelle cellule 8,17. Questo test utilizza una proteina luciferasi di Gaussia princeps (GLUC) che è stabile e attiva nell'ambiente extracellulare e può essere rilasciata inducibilmente dalle cellule in risposta all'attività proteolitica di ATG4B18,19.
In questo costrutto reporter, dNGLUC è legato al citoscheletro di actina delle cellule. Un linker specifico per la proteasi può essere introdotto tra l'ancora β-actina e dNGLUC, trasformando la secrezione dipendente dalla scissione del linker. Abbiamo utilizzato il frame di lettura aperto a tutta lunghezza di LC3B tra β-actina e dNGLUC, per essere in grado di monitorare il clivaggioLC3B 17,18,19. Sebbene il meccanismo di secrezione di dNGLUC sia poco compreso, è specifico per il monitoraggio dell'attività di ATG4B, non dipende dall'autofagia complessiva come si verifica nelle cellule knockout ATG5 ed è mediato da meccanismi non convenzionali che non richiedono un peptide segnaleclassico 4,18,19. Abbiamo utilizzato con successo questo reporter per lo screening di piccole molecole e librerie di siRNA e abbiamo identificato nuovi regolatori dell'attività di ATG4B, come le chinasi proteiche Akt8. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l'uso di questo reporter luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.

<table><tbody><tr><td>50 &micro; L Puntali monouso - Non filtrati, puri, nidificati 8 pile (pila passiva)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>Rack monouso da 96 puntali</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>Dispenser di prodotti sfusi</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>Celenterazina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-205904</td><td>substrato</td></tr><tr><td>Columbus Software di analisi delle immagini</td><td>Perkin Elmer</td><td>versione 2.9.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra in polipropilene a 384 pozzetti qualificata Echo, trasparente, non sterile</td><td>Coltro Beckman</td><td>001-14555</td><td>Piastra 384PP</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Lettore di piastre a luminescenza</td></tr><tr><td>Libreria di prelievo rapido (96 pozzetti)-L3600-Z369949-100&micro; L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 piastre a 384 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>solido-nero Piastre a 384 pozzetti</td></tr><tr><td>Software di imaging Harmony Software</td> di <td>imaging</td><td>Perkin Elmer</td><td>versione 5.1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, tricloridrato, triidrato - 10 mg/mL soluzione in acqua</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo serie 550 con software Echo Cherry Pick</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td><td>distributore di liquidi acustici su scala nanometrica</td></tr><tr><td>Acqua Milli-Q</td><td></td><td></td><td>acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Opera Phenix Sistema di screening ad alto contenuto</td><td>Microscopio automatizzato</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384-well, nero, fondo piatto otticamente trasparente, trattato con coltura tissutale, coperchi</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Ottenuto dal Dr. Robin Ketteler (Dipartimento di Medicina Umana, Facoltà di Medicina di Berlino)</td></tr><tr><td>Reagente per infezione / trasfezione da polibrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Robot Puromicina</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200</td><td>Piattaforma robotica per manipolazione di liquidi</td><td>Tecan</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Reagente per trasfezione di DNA Roche</td><td>Merck</td><td>6366244001</td><td></td></tr></tbody></table>

screening farmacologico cellulare per gli inibitori della peptidasi 4b cisteina correlata all'autofagia

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

Prove crescenti hanno dimostrato che un elevato flusso autofagico è correlato alla progressione del tumore e alla resistenza alla terapia antitumorale. Il dosaggio delle singole proteine dell'autofagia è un prerequisito per le strategie terapeutiche mirate a questo percorso. È stato dimostrato che l'inibizione della proteasi autofagica ATG4B aumenta la sopravvivenza globale, suggerendo che ATG4B potrebbe essere un potenziale bersaglio farmacologico per la terapia del cancro. Il nostro laboratorio ha sviluppato un saggio selettivo basato sulla luciferasi per il monitoraggio dell'attività di ATG4B nelle cellule. Per questo saggio, il substrato di ATG4B, LC3B, è marcato all'estremità C con una luciferasi secretabile dal copepode marino Gaussia princeps (GLUC). Questo reporter è collegato al citoscheletro di actina, mantenendolo così nel citoplasma delle cellule quando non è disponibile. La scissione mediata da ATG4B provoca il rilascio di GLUC da parte di secrezioni non convenzionali, che possono quindi essere monitorate raccogliendo surnatanti da colture cellulari come correlato dell'attività cellulare di ATG4B. Questo articolo presenta l'adattamento di questo test basato sulla luciferasi allo screening automatizzato ad alto rendimento. Descriviamo il flusso di lavoro e l'ottimizzazione per un'analisi esemplare ad alto rendimento dell'attività cellulare ATG4B.

In una precedente pubblicazione8, abbiamo utilizzato con successo questo test per lo screening di piccole molecole e librerie di siRNA e abbiamo identificato nuovi regolatori di ATG4B. Qui, descriviamo il protocollo e i risultati rappresentativi di questo reporter luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato e ad alto rendimento. La Figura 8 mostra un esempio di analisi dei dati grezzi sia per i nuclei cellulari che per la luminescenza. Un risultato tipico...

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'uso di un saggio reporter basato sulla luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.

Screening farmacologico cellulare per gli inibitori della peptidasi 4B cisteina correlata all'autofagia

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

L'obiettivo principale della ricerca nel mio laboratorio è quello di comprendere la regolazione dell'autofagia e in particolare del proteiforme della cisteina ATG4 e utilizzare queste conoscenze per sviluppare inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio questa via in particolare per malattie come il cancro del pancreas. Utilizziamo tecnologie di screening ad alto contenuto e ad alto rendimento per identificare bersagli farmacologici e candidati farmaci e ci concentriamo sulla famiglia della cisteina proteasi ATG4 perché pensiamo che sia un ottimo bersaglio farmacologico per varie forme di cancro. Stiamo studiando i membri della famiglia ATG4 da un po' di tempo ormai.Abbiamo fatto scoperte significative sulla disfunzione di questa famiglia di proteine e delle cellule. Abbiamo anche identificato nuovi meccanismi post-traduzionali di regolazione dei membri della famiglia ATG4 e attualmente stiamo sviluppando inibitori di piccole molecole e anche attivatori delle famiglie ATG4 per malattie come il cancro e la neurodegenerazione. Non ci sono molti test per monitorare l'attività della proteasi ATG4 nelle cellule.Quindi siamo stati tra i primi a sviluppare un test basato sulla luciferasi per monitorare questa attività. E il nostro test è piuttosto insolito perché utilizza secrete, diciamo frase, quindi non abbiamo bisogno di concedere in licenza le cellule e possiamo adattare facilmente questo protocollo ai metodi di screening ad alto rendimento e all'automazione del laboratorio. Da un po' di tempo ci concentriamo sulla proteina proteasi ATG4 B.Abbiamo generato linee cellulari knockout dei membri della famiglia ATG4. Abbiamo identificato nuovi meccanismi di regolazione post-traduzionale di ATG4 e, infine, abbiamo anche identificato diversi nuovi composti di piccole molecole che potrebbero inibire e persino attivare la proteasi ATG4 B. In futuro, vorremmo continuare il nostro lavoro sui membri della famiglia ATG4.Pensiamo che ci siano molte cose che al momento sono sconosciute e che devono ancora essere scoperte. Ad esempio, il modo in cui queste proteine regolano l'autofagia nei neuroni è attualmente completamente incompreso. Vorremmo anche concentrare il nostro lavoro sulla convalida di questi composti di piccole molecole che abbiamo identificato e potenzialmente sull'uso di attivatori nelle malattie neurodegenerative.

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L'autofagia è un processo onnipresente che permette alle cellule di degradare e riciclare le proteine ​​e organelli. Applichiamo la microscopia a fluorescenza avanzata per visualizzare e quantificare il piccolo, ma, cambiamenti fisici essenziali connessi con l'induzione di autofagia, tra cui la formazione e la distribuzione di autophagosomes e lisosomi, e la loro fusione in autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Per contrastare la diffusione degli agenti patogeni, le cellule ospiti riorganizzano il loro citoscheletro a compartimenti stagni batteri e indurre l'autofagia. Utilizzando Shigella infezione di cellule di coltura di tessuti, di accoglienza e di determinanti patogeni alla base di tale processo sono identificati e caratterizzati. Utilizzando modelli di zebrafish di infezione Shigella, il ruolo di molecole e meccanismi scoperti sono indagato in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.<br...

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Mitophagy, il processo di schiarimento danneggiato i mitocondri, è necessario per la manutenzione di salute e omeostasi mitocondriale. Questo articolo presenta alcune delle mitophagy più recenti metodi di rilevazione in Caenorhabditis eleganse cellule umane in topi.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

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Questo documento utilizza un flusso cytometry-test per librerie di schermo di inibitori chimici per l'identificazione di inibitori e ai loro obiettivi che influenzano la segnalazione del ricevitore della T-cellula. I metodi descritti qui possono essere espanso per high throughput screening.

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Viene presentato un protocollo dettagliato per la generazione di microarray proteici umani auto-assemblati per lo screening degli inibitori della chinasi.

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In questo studio, presentiamo strategie basate su inibitori e siRNA per interferire con il flusso autofagico nel virus Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1) -infettato monocite-derivato cellule.

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L'obiettivo di questo protocollo è determinare i livelli autofagici nel cancro del pancreas e nelle cellule acinose pancreatiche attraverso l'immunofluorescenza LC3 e la quantificazione dei punti LC3.

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Scopri lo screening farmacologico cellulare per identificare inibitori della peptidasi ATG4B correlata all'autofagia. Questo metodo basato su luciferasi supporta la ricerca sul cancro e le malattie neurodegenerative.

Screening farmacologico cellulare per gli inibitori della peptidasi 4B cisteina correlata all'autofagia

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