Name: Mappatura della distribuzione cellulare di una proteina optogenetica utilizzando una griglia di stimolazione luminosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Scopri la mappatura della distribuzione cellulare di bPAC-nanoluciferase per studiare la segnalazione del cAMP utilizzando una griglia di stimolazione luminosa. Questo metodo consente di attivare proteine optogenetiche in zone cellulari specifiche con precisione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH) concede R01 GM099775 e GM130612 a D.L.A.

1. Coltura cellulare HC-1 e preparazione per l'imaging
<ol>
	<li>Mantenere le cellule HC-1 in DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina (100 UI/L), streptomicina (100 mg/L) e L-glutammina in piastre da 10 cm e incubate a 37 °C, 5% CO2, in aria umidificata al 95%.</li>
	<li>Far passare le cellule ogni 2-4 giorni una volta che le cellule sono confluenti ~90% utilizzando diluizioni 1:5 o 1:10.</li>
	<li>Cellule seme per trasfezione su vetrini coprioggetti 2 giorni prima dell'esperimento.
	<ol>
		<li>Lavorando in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale con terreno preriscaldato e PBS, aspirare il terreno da una piastra di cellule quasi confluente e lavare delicatamente con 5 mL di PBS.</li>
		<li>Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tripsina. Incubare a 37 °C per 3-5 minuti fino a quando le cellule non si sono staccate.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 4 mL di terreno e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule e calcolare la densità cellulare.</li>
		<li>Diluire le cellule a una densità di 1,5 x 104 cellule/mL.</li>
		<li>Pipettare 2 mL della sospensione cellulare su vetrini coprioggetti da 25 mm con rivestimento in poli-D-lisina in un piatto a 6 pozzetti.</li>
		<li>Incubare le cellule per circa 24 ore in un incubatore fino alla confluenza del 70%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tranfettare le cellule utilizzando un kit di trasfezione seguendo le istruzioni del produttore utilizzando un rapporto di 0,25 μg di NLS-bPAC-nLuc DNA/0,75 μg di NLS-H208 DNA per 3 μL di reagente di trasfezione e 2 μL di reagente P3000 diluito in terreno Opti-MEM privo di rosso fenolo.</li>
	<li>Posizionare le cellule nell'incubatore per ~48 ore per consentire una sufficiente espressione di bPAC-nLuc, essenziale per produrre livelli rilevabili di cAMP. 
	NOTA: Il livello minimo richiesto di espressione di bPAC-nLuc varia a seconda della potenza del sistema di stimolazione e dei parametri della stimolazione.</li>
	<li>Preparare le cellule sui vetrini coprioggetti per l'imaging.
	<ol>
		<li>Aspirare il terreno da un pozzetto e lavare due volte con 2 ml di PBS.</li>
		<li>Sollevare con cautela il vetrino coprioggetti utilizzando un paio di pinze e posizionarlo nella camera di imaging.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di Opti-MEM privo di rosso fenolo alla camera di imaging. Le cellule possono anche essere visualizzate in HBSS o in qualsiasi altra soluzione compatibile con la fluorescenza fisiologica.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Simulazione della luce e imaging di cellule vive
<ol>
	<li>Eseguire colture cellulari e manipolazione di cellule che esprimono NLS-bPAC-nLuc in un ambiente buio. Per evitare l'esposizione a lunghezze d'onda <500 nm, utilizzare una lampada a luce di sicurezza rossa (Tabella dei materiali) con una lampadina a fluorescenza compatta ambra da 13 W (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Esegui esperimenti in un microscopio motorizzato a due piani (Tabella dei materiali) dotato di un motore di luce multi-LED a 6 linee (Tabella dei materiali), una ruota portafiltri di emissione (Tabella dei materiali), uno stadio XY (Tabella dei materiali), una fotocamera CMOS digitale ORCA-Fusion (Tabella dei materiali) e un obiettivo per olio 100x/1,4 NA (∞/0,17/FN26.5). Acquisizione di immagini utilizzando il software di microscopia digitale (Tabella dei materiali). Questa configurazione è in grado di stimolare le cellule ed eseguire simultaneamente misure FRET utilizzando un percorso luminoso indipendente dotato di un filtro dicroico ZT458rdc (Tabella dei materiali). 
	NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi configurazione di acquisizione se consente la stimolazione optogenetica simultanea e l'imaging FRET/intensiometrico con un sensore compatibile.</li>
	<li>Accendere l'UGA - 42 Geosystem. Accendere il microscopio e impostarlo con i parametri appropriati da acquisire con il sensore FRET H208. La configurazione di acquisizione dipenderà dai livelli di espressione del sensore FRET. I parametri tipici sono un tempo di simulazione di 40 ms per YFP/mScarletI, una potenza del LED del 15% e 0,5 Hz.</li>
	<li>Aprire il software SysCon e il software di imaging che controlla il microscopio.</li>
	<li>Nella finestra Fotocamera, selezionare la scheda Calibrazione e scegliere la lunghezza d'onda del laser compatibile con la proteina optogenetica. Per stimolare bPAC-nLuc, utilizzare una lunghezza d'onda di 445 nm.</li>
	<li>Calibrare il sistema prima di ogni utilizzo. Questo è importante perché piccole variazioni nella configurazione, o anche cambiamenti nella temperatura ambiente (RT), possono alterare la precisione della stimolazione.</li>
	<li>Nella finestra della fotocamera, selezionare la scheda Fotocamera e fare clic su <Avvia acquisizione> per avviare l'acquisizione dal software di immaginazione.</li>
	<li>Nella finestra Visualizzatore immagini, visualizzare un'acquisizione dal vivo o precedente della fluorescenza delle cellule prelevata dal software di imaging, che guiderà il posizionamento degli oggetti di stimolazione.</li>
	<li>Usa la modalità Click and Fire per valutare rapidamente la reattività di una singola cellula prima di iniziare l'esperimento.</li>
	<li>Utilizzando la finestra Gestione sequenze, selezionare <aggiungi> per creare una nuova sequenza. 
	NOTA: Per verificare la corretta calibrazione del sistema, disegnare varie forme e dimensioni nella finestra del Visualizzatore immagini. Questi dovrebbero corrispondere esattamente ai modelli di stimolazione proiettati sulle cellule, garantendo un allineamento accurato con il design previsto.</li>
	<li>Nella finestra Visualizzatore immagini , selezionare l'icona Rotondo nella barra degli strumenti a sinistra per disegnare oggetti di stimolazione circolare.</li>
	<li>Crea più piccoli cerchi identici e distribuiscili uniformemente per garantire la copertura omogenea dell'intero citoplasma delle cellule da stimolare.</li>
	<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuno di essi per verificare l'omogeneità degli oggetti di stimolazione circolare. Apparirà una finestra; Usalo per esaminare il loro raggio, posizione, ecc.</li>
	<li>Imposta il raggio tra 1 e 5, a seconda dell'obiettivo utilizzato e delle dimensioni della cella.</li>
	<li>Per facilitare la spaziatura uniforme e l'allineamento dei cerchi, utilizzare il pulsante <Aggancia alla griglia> nella sottofinestra Visualizza. Inoltre, impostare le proprietà della griglia utilizzando il pulsante <Imposta griglia>.</li>
	<li>Assicurarsi che la griglia o la matrice di oggetti di stimolazione circolare equidistanti copra completamente la cellula e che le sue dimensioni (ad esempio, 6 x 6 o 10 x 10) siano determinate dalle dimensioni della cellula. Come controllo per la stimolazione nulla che non dovrebbe innescare alcun evento cellulare, includere alcuni cerchi posizionati all'esterno della cellula.</li>
	<li>Ogni oggetto creato nella finestra del Visualizzatore immagini apparirà nella finestra Timeline.
	<ol>
		<li>Nella sottofinestra Temporizzazione Oggetto, configurare le proprietà temporali di ciascun oggetto di stimolazione (ora di inizio, durata, ritardo).</li>
		<li>Nella sottofinestra Sorgente luminosa, configurare la lunghezza d'onda e l'intensità di ciascun oggetto. Per questo protocollo, assicurati che ogni oggetto utilizzi la stessa lunghezza d'onda e sia identico in termini di durata e intensità. L'ora di inizio sarà diversa per ogni oggetto e il ritardo tra di loro può essere variato a seconda del risultato atteso per evitare di sovrapporre l'effetto di diverse stimolazioni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nella finestra Timeline, modificare la sequenza in cui ciascun oggetto di stimolazione verrà attivato, se necessario. Configurare le stimolazioni in uno schema regolare (ad esempio, da sinistra a destra, dall'alto verso il basso) o in uno schema casuale, a seconda dell'esperimento particolare.</li>
	<li>Caricare la sequenza nel sistema e configurare il numero di cicli di sequenza (esecuzioni) che il sistema eseguirà.</li>
	<li>Posiziona le regioni di interesse (ROI) nel software di imaging nelle posizioni desiderate.</li>
	<li>Inizia ad acquisire immagini a fluorescenza con il microscopio e premi <Play> nella finestra UGA-42.</li>
</ol>
3. Analisi dei dati
<ol>
	<li>Sebbene il software fornito dal sistema di stimolazione consenta di salvare le sequenze per un ulteriore utilizzo, non registra le informazioni effettive dell'esperimento. Pertanto, documenta meticolosamente tutti i dettagli relativi ai punti di stimolazione e alle sequenze impiegate durante l'esperimento, inclusi parametri come posizione, intensità, durata, numero di corse, ecc. Documentare qualsiasi altra condizione sperimentale pertinente, come agenti farmacologici o soluzioni specifiche.</li>
	<li>Durante l'esperimento, posizionare le ROI designate sul software di imaging per acquisire le variazioni di intensità della fluorescenza dall'intera cellula o da posizioni specifiche all'interno delle cellule.</li>
	<li>Prestare particolare attenzione al posizionamento delle ROI rispetto ai punti di stimolazione. Misurare le variazioni dell'intensità della fluorescenza all'interno o lontano dalle aree stimolate. Regolare le posizioni delle ROI post-esperimento, fornendo al software di imaging il modo di salvare le immagini acquisite durante l'esperimento e non solo i valori di intensità della ROI.</li>
</ol>

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

<ol><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li>
<li>Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+activation+of+cAMP+production+through+photostimulation+or+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).</li>
<li>Stierl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+modulation+of+cellular+cAMP+by+a+small+bacterial+photoactivated+adenylyl+cyclase%2C+bPAC%2C+of+the+soil+bacterium+Beggiatoa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endomembrane-based+signaling+by+GPCRs+and+G-proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins.</a> Cells. 11 (3), 528(2022).</li>
<li>Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGroschner%2C+K+%22Store-operated+ca%282%29%2B+entry+%28SOCE%29+pathways%22">Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways</a>. , Springer, Vienna. (2017).</li>
<li>Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hormone-sensitive+adenylate+cyclase+activity+with+resolved+components+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme.</a> The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).</li>
<li>Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+adrenergic+receptors+and+adenylate+cyclase%3A+products+of+separate+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes.</a> Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).</li>
<li>Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+cyclase-mediated+nuclear+cAMP+synthesis+is+sufficient+for+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).</li>
<li>Keravis, T., Lugnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide+phosphodiesterase+%28PDE%29+isozymes+as+targets+of+the+intracellular+signalling+network%3A+benefits+of+PDE+inhibitors+in+various+diseases+and+perspectives+for+future+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments.</a> British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse concorrente.

L'obiettivo di questo studio è stato quello di monitorare con precisione la distribuzione intracellulare di una proteina optogenetica e valutarne le prestazioni all'interno di un particolare compartimento citoplasmatico. Abbiamo anche mostrato le precise capacità di stimolazione di un sistema di scansione puntiforme su cellule che esprimono una proteina optogenetica. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo impiegato un bPAC-nLuc a bersaglio nucleare con alti livelli di espressione ma una distribuzione molto ristretta limitata al nucleo. I risultati hanno mostrato che i punti di stimolazione separati da solo ~1 μm possono innescare o meno la produzione di cAMP, a seconda della distribuzione cellulare della proteina optogenetica; solo le stimolazioni dirette al nucleo sono state in grado di aumentare i livelli di cAMP. In questo protocollo, l'obiettivo non era quello di generare aumenti localizzati di cAMP, ma piuttosto di dimostrare che brevi stimolazioni luminose possono essere sufficientemente accurate da attivare proteine optogenetiche in aree molto ristrette della cellula senza stimolare le proteine circostanti. Tuttavia, questo approccio costituisce un controllo necessario per lo studio di altre proteine optogenetiche con distribuzioni diffuse e/o la generazione di elevazioni localizzate di cAMP. Ciò può essere ottenuto variando i livelli di espressione della proteina optogenetica, l'intensità e la frequenza della stimolazione, ecc. Per misurare con precisione questi segnali localizzati, è fondamentale considerare attentamente i parametri di acquisizione e le caratteristiche del sensore. Ciò include la selezione delle posizioni e delle dimensioni ROI appropriate, la determinazione della frequenza di acquisizione e la scelta di sensori FRET/intensiometrici con affinità, intensità, gamma dinamica e costante di dissociazione ottimali.
In un articolo pubblicato di recente, abbiamo utilizzato una strategia simile per dimostrare funzionalmente la distribuzione di un bPAC-nLuc a bersaglio nucleare e la capacità di una fosfodiesterasi modificata (PDE; ΔRI-PDE8) di abolire l'aumento del cAMP inuna linea cellulare 9 derivata dalla tiroide. In questo articolo, abbiamo condotto la stimolazione cellulare lungo una linea retta invece che una griglia, e i punti di illuminazione sono stati posizionati rispetto ai punti di riferimento cellulari (ad esempio, centro nucleare, bordo nucleare, ecc.) piuttosto che in uno schema sistematico. Sorprendentemente, anche le stimolazioni dirette al bordo nucleare erano insufficienti per innescare una risposta cAMP rilevabile. Abbiamo ragionato che ciò era probabilmente dovuto alla stimolazione di una massa insufficiente di NLS-bPAC-nLuc9. Tuttavia, nel presente protocollo, alcune stimolazioni dirette in prossimità del bordo nucleare hanno suscitato un aumento rilevabile del cAMP. Questa discrepanza potrebbe essere attribuita a vari fattori, tra cui i livelli di espressione del bPAC-nLuc, le caratteristiche della stimolazione, la morfologia del nucleo, la presenza di PDE endogene, proteine tampone, ecc.
Mentre altre proteine optogenetiche mirate o non bersaglio possono mostrare distribuzioni più diffuse, questo approccio sistematico supporta il raggiungimento di conclusioni significative impostando attentamente gli esperimenti e analizzando i dati. Inoltre, questo approccio consente di mirare a strutture cellulari specializzate (ad esempio, lamellipodi, dendriti, ciglia primarie, ecc.), facilitando il confronto tra le risposte nelle regioni distali e prossimali di queste strutture e/o del corpo cellulare. 
Questa strategia può essere utilizzata anche per valutare l'attivazione di elementi a valle nella via del cAMP, come la proteina chinasi A (PKA) o la proteina di scambio attivata direttamente dal cAMP (EPAC1). Inoltre, poiché bPAC-nLuc non è influenzato dagli stessi modulatori degli AC endogeni, che possono essere influenzati da interazioni locali con proteine o altri fattori, si può assumere che generi costantemente la stessa quantità di cAMP a parità di livello di espressione. Esaminando la riduzione degli aumenti di cAMP o la diminuzione dei livelli di cAMP dopo un aumento temporaneo, questo approccio consente di valutare la degradazione, la diffusione o la funzionalità e la distribuzione di PDE endogene o trasfettate. Questa strategia si rivela particolarmente utile per valutare il comportamento di qualsiasi proteina optogenetica in diverse sedi cellulari, aiutando a evitare il bias di posizionare arbitrariamente punti di stimolazione all'interno del citoplasma.
È importante tenere conto del fatto che le dimensioni del punto di stimolazione e la sua energia dipenderanno in ultima analisi dalle caratteristiche particolari della configurazione utilizzata (percorsi luminosi, obiettivi, sistema di scansione, ecc.). Per garantire risultati accurati, l'espressione relativa della proteina optogenetica, la sensibilità delle cellule alla lunghezza d'onda utilizzata e qualsiasi altro parametro dovrebbero essere presi in considerazione quando si conduce ogni esperimento in ogni particolare sistema. È anche essenziale notare che non abbiamo studiato l'intera misura in cui il sistema può essere guidato nell'implementazione di spot di stimolazione più piccoli e/o griglie più dense (cioè spot di stimolazione meno distanziati) per valutare sistematicamente strutture cellulari più piccole con maggiore precisione. Inoltre, abbiamo testato questa strategia utilizzando solo il sistema di scansione UGA-42 Geo point. Questo approccio può essere possibile utilizzando diversi sistemi, a condizione che siano in grado di generare in modo riproducibile spot localizzati uniformemente distanziati. Ogni sistema deve essere ottimizzato per produrre risultati simili.
Infine, la potenziale stimolazione dei sensori FRET da parte del sistema di stimolazione deve essere valutata attentamente. Ad esempio, la proteina fluorescente ciano (CFP) sarà sicuramente stimolata o addirittura sbiancata dal laser a 445 nm utilizzato in questo protocollo. L'uso di potenze laser più elevate (o filtri a densità neutra (ND) con trasmittanza più elevata) aumenterà le possibilità di stimolare i sensori fluorescenti e di introdurre false informazioni nell'esperimento e/o generare problemi con l'analisi dei dati. Anche il normale fotosbiancamento dei sensori FRET/intensiometrici deve essere valutato attentamente. Infine, poiché il bPAC può essere sensibile alla luce ambientale e generare cAMP anche in condizioni di oscurità (l'attività al buio del bPAC è stata misurata come 33 ± 5 pmol/min/mg diproteina 3), le cellule devono essere attentamente manipolate dopo la trasfezione di bPAC-nLUC per evitare la contaminazione della luce (ad esempio, all'incubatore, prima e/o durante gli esperimenti, ecc.). Opzionalmente, le cellule possono essere incubate con un inibitore della PDE (ad esempio, 3-isobutil-1-metilxantina; IBMX10) per determinare l'attività di base di bPAC-nLuc e confermare che le condizioni di illuminazione utilizzate siano adeguatamente scure.

L'optogenetica, nata come strumento che ha rivoluzionato le neuroscienze, è ora un campo di ricerca in crescita e una tecnologia in ascesa utilizzata abitualmente da molti laboratori in tutto il mondo e in varie aree di ricerca in biologia. Abbiamo sviluppato bPAC-nLuc, una proteina optogenetica versatile, fondendo un'adenilil ciclasi (AC) sensibile alla luce da Beggiatoa sp. (adenilil ciclasi fotoattivabile batterica; bPAC) alla nanoluciferasi (nLuc)1,2,3. Quando stimolato con luce blu, il bPAC produce il secondo messaggero 3',5'-adenosina monofosfato ciclico (cAMP). nLuc è una piccola luciferasi di recente sviluppo che, in presenza di uno dei suoi substrati, può generare bioluminescenza e attivare la produzione di cAMP4. Pertanto, questa proteina optogenetica può essere attivata transitoriamente utilizzando brevi impulsi luminosi o costantemente con furimazina o altri substrati di luciferasi, permettendoci di imitare diversi modelli di segnalazione cAMP e valutare le risposte cellulari (attivazione di fattori di trascrizione, espressione genica, proliferazione cellulare, migrazione, ecc.). Recenti progressi nella segnalazione del secondomessaggero hanno enfatizzato l'importanza di eventi che si verificano in regioni citosoliche molto ristrette (ad esempio, la produzione endosomiale di cAMP per la fosforilazione della proteina legante l'elemento di risposta al cAMP (CREB) o i microdomini Ca2+ per la traslocazione del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) nel nucleo)5,6. Pertanto, è importante sviluppare strategie coerenti e sistematiche per valutare, imitare e bloccare la segnalazione da questi compartimenti nelle cellule vive. Per dimostrare la capacità di bPAC-nLuc di essere attivato in modo specifico in diversi compartimenti cellulari, abbiamo co-trasfettato una linea cellulare derivata dall'epatoma (HC-1) con il bPAC-nLuc a bersaglio nucleare e H208, un sensore di cAMP (FRET) (NLS-PAC-nLuc; NLS-H208). Le cellule HC-1 che derivano dalla linea HTC sono prive di attività AC analizzabile, il che si traduce in livelli basali di cAMP molto bassi, rendendole ideali per misurare la produzione di cAMP putativo sfruttando l'intera gamma dinamica dei sensori FRET7,8. Utilizzando un laser a stato solido (445 nm, LDI-7, 89 North) collegato a un sistema di scansione a punti (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), descriviamo un protocollo per stimolare sistematicamente aree circolari molto piccole o punti (~1 μm2) all'interno delle singole cellule. Il sistema di scansione puntiforme è stato collegato a una delle porte posteriori di un microscopio a due piani, che ci ha permesso di stimolare le cellule ed eseguire misure FRET contemporaneamente tramite un percorso luminoso indipendente. Presentiamo un metodo in questo protocollo in cui il software SysCon Geo, fornito con il sistema di stimolazione da Rapp OptoElectronic, viene utilizzato per eseguire una scansione completa del citoplasma delle cellule. L'approccio prevede la generazione di una mappa di risposta cAMP impostando una sequenza di illuminazioni che stimolano le cellule in un modello a griglia (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Lampadina a fluorescenza compatta ambra da 13 W - Luci blu basse</td><td>Sviluppi fotonici&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-isobutile-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>6-line multi-LED Lumencor Spectra X</td><td>Lumencor&nbsp;</td><td></td><td>Motore di illuminazione multi-LED a 6 linee&nbsp;</td></tr><tr><td>Corning - DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT10013CMEA</td><td></td></tr><tr><td>Corning - Siero fetale bovino regolare</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura: cerchi</td><td>Thermo Fischer</td><td>12545102P</td><td></td></tr><tr><td>GBX-2 filtro di sicurezza rosso scuro 5,5"&nbsp;</td><td>Lampada di sicurezza Kodak</td><td>1416827</td><td>rossa&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) 10x</td><td>Thermo Fischer</td><td>14185052</td><td>Diluito a 1x, pH regolato</td></tr><tr><td>LDI-7</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Thermo Fischer</td><td>BW17605E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000&nbsp;</td><td>Kit di trasfezione</td> <td>Thermo Fischer</td><td>L3000001</td></tr><tr><td>Olympus IX83 motorizzata&nbsp; a due piani&nbsp; microscopio&nbsp;</td><td>Microscopio motorizzato a due ponti</td> <td>Olympus</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Opti-MEM, senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fischer</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>fotocamera CMOS digitale a fusione ORCA&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C14440-20UP</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tamponata con fosfato (1x)</td><td>Lonza</td><td>17516F</td><td></td></tr><tr><td>Ruota portafiltri per emissioni precedenti e set di filtri</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>Ruota portafiltri emissione&nbsp;</td></tr><tr><td>Priore&nbsp; Proscan XY stage</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>Stadio XY&nbsp;</td></tr><tr><td>Slidebook 6</td><td>Innovazioni di imaging intelligente Software</td><td></td> di <td>microscopia digitale</td></tr><tr><td>Software SysCon</td><td>Software</td><td></td><td>Software fornito dal sistema di stimolazione&nbsp;</td></tr><tr><td>UGA-42&nbsp; Geo&nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPlanSApo 100x</td><td>Olympus</td><td></td><td>100x/1.4 NA obiettivo olio (&infin;/0.17/FN26.5)</td></tr><tr><td>ZT458rdc dicroico&nbsp;</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>BS, Lunghezza d'onda (CWL):&nbsp; 498 nm</td></tr></tbody></table>

mappatura della distribuzione cellulare di una proteina optogenetica utilizzando una griglia di stimolazione luminosa

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Il nostro obiettivo era tracciare accuratamente la distribuzione cellulare di una proteina optogenetica e valutarne la funzionalità all'interno di una specifica posizione citoplasmatica. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo co-trasfettato le cellule con sensori cAMP a bersaglio nucleare e la nostra proteina optogenetica sviluppata in laboratorio, l'adenilil ciclasi-nanoluciferasi fotoattivabile batterica (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, quando stimolato con luce a 445 nm o substrati di luciferasi, genera adenosina 3',5'-monofosfato ciclico (cAMP). Abbiamo impiegato un illuminatore laser a stato solido collegato a un sistema di scansione puntiforme che ci ha permesso di creare un modello griglia/matrice di piccoli punti illuminati (~1 μm2) in tutto il citoplasma delle cellule HC-1. In questo modo, siamo stati in grado di tracciare efficacemente la distribuzione di bPAC-nLuc a bersaglio nucleare e generare una mappa completa della risposta cAMP. Questa mappa rappresentava accuratamente la distribuzione cellulare di bPAC-nLuc e la sua risposta alla stimolazione luminosa variava in base alla quantità di proteine nel punto illuminato. Questo approccio innovativo contribuisce all'espansione del kit di tecniche disponibili per lo studio delle proteine optogenetiche cellulari. La capacità di mappare la sua distribuzione e la sua risposta con alta precisione ha un potenziale di vasta portata e potrebbe far progredire vari campi di ricerca.

I risultati presentati nella Figura 1 mostrano che solo le stimolazioni dirette al nucleo cellulare sono state in grado di generare aumenti misurabili di cAMP. Questo conferma che NLS-bPAC-nLuc è espresso esclusivamente nel compartimento nucleare delle cellule HC-1. È possibile stimolare con precisione una proteina optogenetica utilizzando questo schema a griglia/matrice per mapparne la distribuzione intracellulare. Inoltre, gli aumenti maggiori di cAMP verso il centro del nucleo riflettono la massa maggiore di bPAC-nLuc stimolata dai punti centrali rispetto a quelli posizionati alla periferia nucleare (Figura 1).
<img alt="Risultato microscopico di YFP H208, stimolazione luminosa a 445 nm, grafici di segnale transitorio, spettroscopia ottica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65471/65471fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Protocollo di stimolazione a griglia e mappa della risposta di cAMP. Stimolazioni sequenziali con luce blu (445 nm; intervallo di 30 s tra gli impulsi; treno di impulsi: 50 ms, durata totale di 500 ms, 10 Hz, potenza laser al 7%) su cellule HC-1 trasfettate con NLS-H208 (sensore di cAMP) e NLS-bPAC-nLuc. Il pannello sinistro mostra la fluorescenza della proteina fluorescente gialla (YFP) proveniente da H208, sovrapposta agli impulsi luminosi effettivi acquisiti dalla telecamera sCMOS, rappresentati in un'unica immagine. I tracciati a destra mostrano gli aumenti transitori di cAMP innescati dalla stimolazione di NLS-bPAC-nLuc in ciascun punto di stimolazione. La fluorescenza di NLS-H208, corretta per il fondo, è stata misurata utilizzando una singola ROI che copre l'intero nucleo, e sono stati calcolati i rapporti normalizzati (R/R0). Le risposte nelle aree periferiche (righe 1 e 7, colonne A e G) erano negative e non sono mostrate. Barra = 3 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65471/65471fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo protocollo prevede la trasfezione di sensori cAMP e bPAC-nLuc, una proteina optogenetica, per tracciare accuratamente la sua distribuzione cellulare e la risposta alla stimolazione luminosa. L'approccio innovativo di creare una mappa di risposta cAMP utilizzando un sistema di scansione puntuale ha il potenziale per far progredire la ricerca con le proteine optogenetiche in diversi campi.

Mappatura della distribuzione cellulare di una proteina optogenetica utilizzando una griglia di stimolazione luminosa

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic ...

mapping-cellular-distribution-an-optogenetic-protein-using-light

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo documento introduce un approccio di combinare fotostimolazione scansione laser con registrazioni cellula intera in topi transgenici che esprimono GFP in popolazioni limitate neuroni inibitori. La tecnica permette per la mappatura estesa e analisi quantitativa dei locali circuiti sinaptici di specifici neuroni inibitori corticali.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Adulti-nato neuroni che esprimono ChR2 può essere manipolata in preparati fetta elettrofisiologici al fine di esaminare il loro contributo verso la funzione olfattiva di circuiti neurali.

Utilizzando conveniente array LED per la foto-stimolazione dei neuroni

I neuroni adulti, nato del bulbo olfattivo può essere controllato tramite optogenetically Channelrhodopsin2 che esprimono iniezione lentivirali nel flusso migratorio rostrale e fotostimolazione cronica con una miniatura impiantato LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Questo articolo descrive la registrazione delle singole cellule da fluorescente tag popolazioni neuronali della retina topo intatto. Con l'eccitazione a due fotoni infrarossi cellule transgenetically etichettati sono stati mirati per patch-clamp per lo studio di registrazione le loro risposte luce, proprietà del campo recettivo, e la morfologia.

Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Abbiamo progettato una apparecchiatura per le colture in continuo per l'uso con i sistemi optogenetic per illuminare le culture di microbi e regolarmente celle di immagine negli effluenti con un microscopio invertito. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche a illuminazione possono essere misurati per diversi giorni.

Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

La bioluminescenza - la luce emessa da un enzima luciferasi che ossida un substrato di piccole molecole, una luciferina - può essere sfruttata per attivare le proteine fotosensoriali, aggiungendo così un'altra dimensione alla stimolazione della luce e consentendo la manipolazione di una moltitudine di funzioni mediate dalla luce nelle cellule attraverso scale temporali e spaziali.

Optogenetica bioluminescente 2.0: sfruttare la bioluminescenza per attivare proteine fotosensoriali in vitro e in vivo

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Scopri la mappatura della distribuzione cellulare di bPAC-nanoluciferase per studiare la segnalazione del cAMP utilizzando una griglia di stimolazione luminosa. Questo metodo consente di attivare proteine optogenetiche in zone cellulari specifiche con precisione.

Mappatura della distribuzione cellulare di una proteina optogenetica utilizzando una griglia di stimolazione luminosa

Esplora altri video