Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani
14 luglio 2023
Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.
Lo scopo di questo manoscritto era quello di valutare l'idoneità della quantificazione simultanea dei focolai di Gamma H2AX e 53BP1 per valutare il danno genomico indotto nei linfociti periferici umani dalla bleomicina. Diversi fattori possono causare rotture del doppio filamento. Le cellule sono quindi dotate di diversi meccanismi di riparazione, che coinvolgono sia Gamma H2AX che 53 Binding Protein 1, che possono co-localizzarsi vicino alla rottura del doppio filamento.
Dopo aver raccolto campioni di sangue intero, aggiungere 300 microlitri di campione a una provetta contenente 4,7 millilitri di terreno completo. Quindi aggiungere cinque microgrammi per millilitro di bleomicina solfato concentrazione finale. Per ogni campione, impostare un controllo negativo.
Metti il tubo in un termostato a 37 gradi Celsius per due ore. Centrifugare i campioni a 540 G per cinque minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione ipotonica al pellet.
Quindi aggiungere 400 microlitri di soluzione prefissativa per causare l'emolisi. Centrifugare i campioni a 540 G per cinque minuti, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di metanolo a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per fissare le cellule. Centrifugare i campioni a 540 G per cinque minuti, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di soluzione fissativa.
Ripeti questo passaggio ancora una volta. Centrifugare nuovamente a 540 g per cinque minuti, quindi aspirare il surnatante lasciando una soluzione sufficiente per risospendere il pellet. Far cadere il pellet cellulare risospeso sui vetrini.
Preparare le due soluzioni contenenti gli anticorpi primari anti-Gamma H2AX e anti-53BP1 disciolti in soluzione bloccante. Quindi lavare i vetrini due volte in PBS 1X. Quindi conservare i vetrini per 30 minuti nella soluzione di blocco.
Aggiungere ad ogni vetrino 10 microlitri di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi primari disciolti in soluzione bloccante. Coprire le diapositive con parafilm. Incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.
Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi in PBS 1X per cinque minuti. Preparare le due soluzioni contenenti gli anticorpi secondari DyLight 488 e Alexa Fluor 568 disciolti in soluzione bloccante. Quindi aggiungere a ciascun vetrino 10 microlitri di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi secondari disciolti in soluzione bloccante.
Coprire i vetrini con parafilm e incubare a temperatura ambiente per due ore. Dopo questa seconda incubazione, eseguire tre lavaggi in PBS 1X per cinque minuti. Aggiungere 2,5 microlitri di soluzione Antifade con DAPI sui vetrini di copertura prima del montaggio per contrastare la macchia dei nuclei.
Al fine di valutare la cinetica dei fuochi, la procedura è la stessa descritta ora. L'ultima fase è l'osservazione e la quantificazione dei focolai. I linfociti umani senza focolai di Gamma H2AX e 53BP1 sono mostrati in A, in B e in C, sono mostrati linfociti umani con diverse quantità di focolai di Gamma H2AX e 53BP1.
Si osserva un basso livello di co-localizzazione dei fuochi. Come previsto, si osserva una frequenza molto più elevata di focolai di Gamma H2AX e 53BP1 tra le cellule non trattate non trattate. Inoltre, si osserva una grande differenza nel numero di fuochi dei due marcatori.
Il decorso temporale dei fuochi di Gamma H2AX e 53BP1 nel tempo ha mostrato un comportamento diverso sebbene contribuiscano alla stessa funzione. L'analisi dei focolai di gamma H2AX e 53BP1 ha la capacità di valutare la risposta cellulare sia in contesti di esposizione che patologici. Tuttavia, la doppia immunofluorescenza Gamma H2AX e 53BP1 può portare a sottostimare la vera frequenza dell'evento.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA mediante la rilevazione simultanea dei fuochi di γH2AX e 53BP1 nei nuclei in interfase di linfociti periferici umani trattati con bleomicina.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genomica
Sfondo
- I tagli a doppio filamento possono essere indotti da diversi fattori.
- Le cellule possiedono diversi meccanismi di riparazione dei danni al DNA.
- γH2AX e 53BP1 sono proteine chiave coinvolte nella riparazione del DNA.
- La co-localizzazione di queste proteine avviene nelle vicinanze dei tagli a doppio filamento.
Scopo dello studio
- Valutare l'idoneità della quantificazione simultanea delle foci di γH2AX e 53BP1.
- Valutare i danni genomici nei linfociti periferici umani.
- Comprendere gli effetti della bleomicina sull'integrità del DNA.
Metodi Utilizzati
- Vengono prelevati campioni di sangue intero da soggetti umani.
- I campioni vengono trattati con solfato di bleomicina.
- Vengono preparati controlli negativi per il confronto.
- La rilevazione dei fuochi di γH2AX e 53BP1 viene eseguita nei nuclei in interfase.
Risultati principali
- È possibile la rilevazione simultanea dei foci γH2AX e 53BP1.
- Il trattamento con bleomicina provoca danni al DNA misurabili.
- La quantificazione dei foci si correla con l'entità del danno genomico.
- I risultati supportano l'utilizzo di questo metodo per valutare i meccanismi di riparazione del DNA.
Conclusioni
- Il protocollo valuta efficacemente la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA.
- La rilevazione simultanea di γH2AX e 53BP1 fornisce informazioni preziose.
- Questo metodo può essere applicato a vari studi sui danni al DNA e sulla sua riparazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Il rilevamento quantitativo dei marcatori di rottura a doppio filamento del DNA (DSB) γH2AX e 53BP1 nei linfociti umani consente una valutazione precisa del danno genomico e della cinetica di riparazione. Questo approccio di immunofluorescenza doppia aumenta la sicurezza predittiva nella schermatura precoce della genotossicità e nella riduzione del rischio meccanicistica per composti candidati. L'integrazione di questi parametri nella fase di scoperta supporta decisioni di portafoglio basate sulla valutazione del rischio e la continuità traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi diretta delle vie di risposta al danno del DNA nelle cellule umane.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando l'induzione di rotture a doppio filamento e la cinetica di riparazione.
- Facilita la validazione funzionale di bersagli coinvolti nella stabilità del genoma.
- Migliora l'affidabilità predittiva delle potenziali tossicità genotossiche nei composti principali.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema validato per la quantificazione di marcatori del danno al DNA in cellule umane primarie.
- Consente letture quantitative e riproducibili per DSB indotte da composti.
- Supporta la standardizzazione del saggio per lo screening ad alto contenuto di modulatori del danno al DNA.
- Facilita una valutazione affidabile dei profili di sicurezza dei composti nei primi screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la quantificazione dei marcatori del danno al DNA alle strategie dei biomarcatori traslazionali.
- Supporta la continuità dalla scoperta in vitro alla valutazione preclinica della sicurezza.
- Permette l'avanzamento mirato ai rischi di candidati con profili favorevoli di riparazione del DNA.
- Fornisce un'analisi meccanicistica delle risposte cellulari rilevanti per le malattie e le terapie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di immunofluorescenza doppia si colloca all'interno del continuum tra la fase iniziale di scoperta e quella preclinica, consentendo una valutazione basata su ipotesi del danno e della riparazione del DNA nei linfociti umani.
- Biologia della Scoperta: Quantifica i foci dei marcatori di DSB per chiarire il coinvolgimento delle vie di riparazione del DNA e la riduzione del rischio biologico.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per il profilo genotossico dei composti.
- Analisi: Offre misurazioni nel tempo dei foci di γH2AX e 53BP1 per analisi comparative.
- Ricerca Translazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a strategie precliniche di biomarcatori per la risposta al danno del DNA.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione del danno del DNA in diversi programmi di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella valutazione del danno al DNA.
- Valore operativo: Standardizza la quantificazione dei marcatori di DSB per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Fornisce informazioni per decisioni di avanzamento o interruzione e riduce il rischio biologico in fasi avanzate di genotossicità.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base ai profili di riparazione del DNA, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a immunofluorescenza e analisi quantitativa delle immagini.
- Necessita dell'accesso ad anticorpi validati e a infrastrutture per l'imaging a fluorescenza.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione dei campioni e di quantificazione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi cellulari o sistemi modello.
- Possibile sottostima della reale frequenza delle DSB a causa delle limitazioni nella co-localizzazione dei marcatori.
