Name: In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Scopri la differenziazione di cellule endoteliali da iPS umane e la loro stimolazione meccanica su chip fluidico. Questo metodo permette di studiare la meccanobiologia endoteliale in un ambiente controllato.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Research Advanced Grant 2021 della European Hematology Association, dal Global Research Award 2021 dell'American Society of Hematology e dall'Internal Strategy Support Fund ISSF3 finanziato dal Welcome Trust e dall'Università di Edimburgo. Ringraziamo Fiona Rossi della Flow Cytometry Facility per il supporto nell'analisi della citometria a flusso. Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questa presentazione.

Differenziazione e stimolazione meccanica di cellule endoteliali derivate da hiPSC

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+before+birth%3A+clues+from+gene+knockouts+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li>
<li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li>
<li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li>
<li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li>
<li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).</li>
<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
<li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li>
<li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157(2020).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+endothelial+differentiation%3A+Tissue-specific+ECs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li>
<li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).</li>
<li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li>
<li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il protocollo che qui descriviamo consente la generazione di cellule endoteliali meccanosensibili da cellule staminali pluripotenti umane e lo studio della loro risposta alla stimolazione meccanica mediata da stress di taglio controllato. Questo protocollo è interamente basato su citochine e pienamente compatibile con i reagenti GMP per la potenziale traduzione nella produzione di cellule per la terapia cellulare.
La derivazione delle hiPSC fornisce agli scienziati un modello strumentale per le prime fasi dello sviluppo embrionale che consente lo studio di processi altrimenti difficili da studiare in vivo24. Infatti, i tessuti embrionali umani disponibili per la ricerca vengono raccolti da embrioni privi di circolazione, e questo potrebbe avere un impatto significativo sulla firma molecolare controllata da segnali meccanici. L'approccio qui descritto consente l'imaging dal vivo e lo studio in tempo reale della risposta cellulare allo stress da taglio. La combinazione delle hiPSC con la fluidica fornisce un modello di studio che supera la limitata disponibilità e l'inaccessibilità dei tessuti fetali in via di sviluppo quando l'inizio della circolazione rimodella e controlla l'instaurazione del sistema cardiovascolare e sanguigno 3,9,10,25.
Una limitazione del protocollo è che le cellule endoteliali derivate da questo protocollo potrebbero non riflettere le varie identità delle diverse cellule endoteliali presenti nei tessuti in via di sviluppo. Per superare questa limitazione, potrebbe essere necessaria una specifica combinazione di citochine durante il processo di differenziazione che precede la stimolazione fluidica per ottenere l'identità desiderata o il fenotipotessuto-specifico 26. L'isolamento di sottogruppi endoteliali può essere ottenuto utilizzando un immunofenotipo più raffinato durante la fase di isolamento. Questo protocollo isola le cellule endoteliali basandosi solo sull'espressione di CD34, consentendo così l'isolamento della colonna invece del cell sorting attivato dalla fluorescenza (FACS); In questo modo si riduce la morte cellulare e il rischio di contaminazione. Inoltre, questo protocollo è specificamente progettato per studiare il ruolo dello sforzo di taglio mediato dal flusso laminare. Dovranno essere impiegati approcci fluidici alternativi per studiare l'effetto di altri segnali meccanici, come l'allungamento o la compressione, o altri tipi di flusso come il flusso perturbato o disturbato.
Abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule endoteliali derivate da iPSC imitano le identità cellulari arterovenoseeterogenee 27 in modo simile a quello osservato nell'aorta dorsale fetale28,29,30. Ciò è di particolare importanza nel contesto dello sviluppo dei vasi e della specificazione cellulare, nota per essere controllata dalla circolazione sanguigna. Studi su diversi modelli hanno dimostrato che la mancanza di circolazione provoca un'alterazione delle specifiche arterovenose11,14,31. I meccanismi che collegano i segnali meccanici con la specificazione cellulare sono ancora sconosciuti e la pipeline qui descritta consente studi funzionali raffinati che non possono essere testati in vivo.
Questa pipeline descrive la produzione e la stimolazione di cellule endoteliali derivate da hiPSC utilizzando canali fluidici disponibili in commercio, evitando la necessità di fondere i dispositivi come per i dispositivi in polidimetilsilossano (PDMS) ampiamente utilizzati12. Inoltre, l'utilizzo di chip PDMS rende particolarmente impegnativa la raccolta delle cellule stimolate, mentre con questo protocollo le cellule possono essere facilmente recuperate dal canale. Ciò migliora significativamente la potenza analitica consentendo analisi successive come analisi proteomiche e trascrittomiche, citometria a flusso e saggi funzionali, che potrebbero richiedere ulteriori colture o saggi in vivo .

Durante lo sviluppo embrionale, il cuore è il primo organo a stabilire la funzionalità1, con contrazioni rilevabili fin dalla prima fase di formazione del tubo endocardico2. La circolazione, insieme ai segnali meccanici mediati dal flusso di sangue all'interno del vaso, controlla molti aspetti cruciali dello sviluppo precoce. Prima dell'instaurazione della circolazione fetale, la vascolarizzazione è organizzata in un plesso capillare primario; Durante il funzionamento cardiaco, questo plesso si riorganizza in vascolarizzazione venosa e arteriosa3. Il ruolo dei segnali meccanici nella specificazione arterovenosa si riflette nell'espressione pan-endoteliale dei marcatori arteriosi e venosi prima dell'inizio del flusso sanguigno4.
Le forze emodinamiche non solo controllano lo sviluppo della vascolarizzazione stessa, ma svolgono anche un ruolo fondamentale nel controllo della formazione delle cellule del sangue. Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) emergono da cellule endoteliali specializzate chiamate endotelio emogenico 5,6,7,8, presenti in diverse regioni anatomiche degli embrioni esclusivamente nella fase iniziale dello sviluppo. Modelli con deficit cardiaci, insieme a modelli in vitro, hanno dimostrato che i segnali meccanici istruiscono e aumentano la produzione di HSPC dall'endotelio emogenico 9,10,11,12,13,14.
È stato dimostrato che diversi tipi di dinamiche di flusso controllano in modo differenziato il ciclo cellulare15, noto per essere importante sia nell'endotelio emogenico 16,17 che nella specificazione delle cellule arteriose18. Nel complesso, i segnali meccanici sono determinanti critici dell'identità e della funzione cellulare durante lo sviluppo. Nuovi dispositivi fluidici in vitro ci consentono di superare i limiti legati allo studio della meccanobiologia dello sviluppo durante lo sviluppo del sangue umano in vivo.
L'obiettivo generale del protocollo in questo manoscritto è quello di descrivere, passo dopo passo, la pipeline sperimentale per studiare l'effetto dello shear stress sulle cellule endoteliali umane derivate in vitro da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs). Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate sulla differenziazione delle hiPSC in cellule endoteliali e la loro successiva semina in chip fluidici per il protocollo di stimolazione. In questo modo, diverse cellule endoteliali derivate in vitro possono essere testate per la loro capacità di rilevare lo sforzo di taglio analizzando il loro orientamento in risposta al flusso. Ciò consentirà ad altri laboratori di affrontare domande sulla risposta allo stress da taglio e sulle sue conseguenze funzionali su diverse identità di cellule endoteliali.

<table><tbody><tr><td>Vetrino non rivestito 0,6 Luer</td><td>ibidi</td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Citato come reagente di dissociazione</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di aspirazione</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Citato come Integratore per colture cellulari neuronali (50x)</td></tr><tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>Versione 8.0.1</td><td>Citato come software di citometria a flusso</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Kit di microsfere</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar superficie repellente per cellule Piastre a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>Citato come piastra repellente per cellule</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp; crioconservazione cellulare</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>Citato come soluzione di crioconservazione</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>Citato come</td></tr><tr><td>DMSO DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Filtro EASY 40 &mu; m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>FcR Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>Versione 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Versione 10.7.1</td><td>Citato come citometria a flusso analisi oftware</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>Unità fluidica</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Citato come integratore di L-glutammina</td></tr><tr><td>Prosciutto F-12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Olo-transferrina</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano Albumina</td><td>Fujifilm UK LTD</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Sistema di pompaggio</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>Citato come sistema di pompaggio</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>Citato come microscopio in-incubatore in-incubatore</td></tr><tr><td>liofilizzato BSA&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separatore</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>Citato come Separatore magnetico</td></tr><tr><td>MS Colonne</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Citato come Colonna magnetica</td></tr><tr><td>MTG</td><td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Notebook per sistema di pompaggio</td><td>ibidi</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 37-41%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Set GIALLO/VERDE: 50 cm, ID 1,6 mm, serbatoi da 10 mL</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>Citato come Set di perfusione</td></tr><tr><td>Polistirene Tubi a fondo tondo Falcon</td><td></td><td>352008</td><td>Citato come Provette per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td></td><td>Verison 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>Software di controllo della pompa</td><td>ibidi</td><td>versione 1.6.1</td><td>Citato come Software della pompa</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Tcchoologies con cellule staminali</td><td>5872</td><td>Citato come Soluzione distaccante</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R& D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R& D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248</td><td>Citato come Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R& D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Connettore seriale per &micro;-Vetrini: Sterile, sterile</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>Supporti StemPro-CD34 SFM Life</td><td>Technologies</td><td>10639011</td><td>Citato come terreno privo di siero per cellule CD34+ (SFM-34)</td></tr><tr><td>Integratore nutritivo StemPro-CD34&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>Citato come integratore nutrizionale 34</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>Citato come Terreni di coltura&nbsp;</td></tr><tr><td>Integratore StemPro</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina (VTN-N) proteina umana ricombinante, troncata</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Citato come iRock</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

Il cuore è il primo organo ad essere funzionalmente stabilito durante lo sviluppo, avviando così la circolazione sanguigna molto presto nella gestazione. Oltre a trasportare ossigeno e sostanze nutritive per garantire la crescita fetale, la circolazione fetale controlla molti eventi cruciali dello sviluppo che si verificano all'interno dello strato endoteliale attraverso segnali meccanici. I segnali biomeccanici inducono cambiamenti strutturali dei vasi sanguigni, stabiliscono le specifiche arterovenose e controllano lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. L'inaccessibilità dei tessuti in via di sviluppo limita la comprensione del ruolo della circolazione nelle prime fasi dello sviluppo umano; Pertanto, i modelli in vitro sono strumenti fondamentali per lo studio della meccanobiologia dei vasi. Questo articolo descrive un protocollo per differenziare le cellule endoteliali dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane e la loro successiva semina in un dispositivo fluidico per studiare la loro risposta a segnali meccanici. Questo approccio consente la coltura a lungo termine di cellule endoteliali sotto stimolazione meccanica, seguita dal recupero delle cellule endoteliali per la caratterizzazione fenotipica e funzionale. Il modello in vitro qui stabilito sarà strumentale per chiarire i meccanismi molecolari intracellulari che trasducono la segnalazione mediata da segnali meccanici, che alla fine orchestrano lo sviluppo dei vasi durante la vita fetale umana.

Descriviamo qui un protocollo per il differenziamento e la meccanostimolazione di cellule endoteliali derivate da hiPSCs che permette di studiare la loro risposta a segnali meccanici (Figura 1). Questo protocollo si traduce nella produzione di cellule endoteliali funzionalmente meccanosensibili. Forniamo qui risultati rappresentativi e descriviamo il fenotipo atteso per valutare come le cellule rispondono alla stimolazione delle citochine durante il differenziamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo di differenziazione e stimolazione meccanica. Schema del protocollo di differenziamento che mostra la tempistica delle diverse miscele di citochine, l'isolamento cellulare CD34+ , la semina fluidica del chip e l'analisi finale delle cellule stimolate meccanicamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Cultura delle hiPSC È importante iniziare il protocollo dalle hiPSC che crescono correttamente in condizioni di auto-rinnovamento. Una buona indicazione della qualità della cultura è la velocità della loro crescita. Dopo lo scongelamento, le cellule potrebbero aver bisogno di 2-3 settimane per raggiungere la corretta fase di crescita che garantirà una buona differenziazione. Quando le cellule possono essere passate due volte alla settimana nel rapporto di 1:6 raggiungendo quasi la piena confluenza, questo è il momento in cui sono pronte per essere differenziate lo stesso giorno in cui devono essere attraversate.
Differenziamento delle hiPSC in cellule endoteliali La prima fase del differenziamento, che consiste nella formazione di corpi embrioidi (EB), è dipendente dalla linea cellulare e può richiedere alcune ottimizzazioni per la specifica linea cellulare in uso. La dissociazione descritta nei passaggi 1.3.2.2-1.3.2.4 del protocollo può essere modificata riducendo o prolungando l'incubazione con il reagente di dissociazione e la successiva dissociazione con la pipetta Pasteur. Inoltre, altri reagenti di dissociazione possono essere utilizzati per questa fase oltre alla dissociazione fisica delle colonie con uno strumento da taglio o un puntale per pipette P100. Gli EB di buona qualità mostrano un bordo definito entro il giorno 2 della differenziazione e appaiono chiari e luminosi se osservati al microscopio; Le aree più scure potrebbero indicare la morte cellulare all'interno degli EB (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> Figura 2: Morfologia dei corpi embrioidi. (A) Corpi embrioidi del giorno 2 che mostrano bordi esterni ben definiti e dimensioni consistenti. (B) Corpi embrioidi di scarsa qualità che mostrano un'estesa morte cellulare che porta alla disaggregazione della struttura. Barra della scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Al giorno 2, l'aggiunta di CHIR99021 agli EB inibisce la proteina GSK-3 con conseguente attivazione della via Wnt. Diverse linee cellulari hanno risposte diverse al trattamento con CHIR, e questo dovrebbe essere testato quantificando il numero di cellule CD34+ ottenute al giorno 8 utilizzando concentrazioni diverse (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> Figura 3: Differenziamento delle cellule endoteliali con diversi trattamenti CHIR. Impegno delle cellule endoteliali quantificato mediante citometria a flusso al giorno 8 di differenziamento mediante espressione di membrana CD34, dopo il trattamento CHIR al giorno 2 a (A) 3 μM, (B) 5 μM e (C) 7 μM. I dati della citometria a flusso sono stati ottenuti utilizzando citometri a cinque laser e un software dedicato (vedi Tabella dei materiali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Isolamento di cellule CD34+ È importante verificare che l'arricchimento di CD34+ utilizzando le biglie magnetiche fornisca almeno l'80% di CD34+ dopo l'eluizione della colonna. Per garantire una purezza sufficiente, un'aliquota di cellule ottenuta dall'isolamento magnetico può essere analizzata mediante citometria a flusso avendo cura di utilizzare un clone di anticorpo diverso da quello utilizzato per l'arricchimento magnetico. In questo caso, è stato utilizzato il clone 4H11 e la purezza di ~85% è stata raggiunta dopo l'arricchimento (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> Figura 4: Espressione di membrana di CD34 prima e dopo l'arricchimento mediante selezione magnetica. I corpi embrioidi dissociati del giorno 8 (grigio) e le cellule dopo l'arricchimento magnetico (verde) sono stati colorati per l'espressione di CD34 e analizzati mediante citometria a flusso, mostrando un arricchimento di successo dopo lo smistamento. I dati della citometria a flusso sono stati ottenuti utilizzando citometri a cinque laser e un software dedicato (vedi Tabella dei materiali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Semina delle cellule nel canale fluidico Quando si seminano le cellule nel canale fluidico, è fondamentale monitorare l'adesione e la proliferazione delle cellule endoteliali. Dopo la semina, le cellule impiegano ~5 ore per aderire completamente al canale (Figura 5A). In questa fase può essere testata anche una soluzione di rivestimento alternativa per migliorare l'adesione. Per confermare che le cellule testate sono meccanosensibili e quindi in grado di rispondere alla stimolazione meccanica, l'orientamento cellulare può essere testato nel tempo. Le cellule prima della stimolazione mostrano un orientamento casuale (Figura 5A e Figura 5C) e si riorientano parallelamente alla direzione del flusso (Figura 5B,C). Il protocollo qui descritto consente di prelevare le cellule dal canale per eseguire analisi a valle, ad esempio la citometria a flusso, per lo studio del loro immunofenotipo di membrana, fornendo l'identità endoteliale delle cellule stimolate (Figura 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> Figura 5: Meccanoresponsività delle cellule endoteliali derivate da hiPSCs . (A) Strato confluente di cellule CD34+ isolate 48 ore dopo la semina. (B) Strato riorientato di cellule endoteliali 3 giorni in coltura dinamica. (C) Analisi dell'orientamento delle cellule endoteliali dopo 5 giorni di coltura dinamica. (D) Profilo di espressione di CD34 di cellule coltivate sotto flusso per 5 giorni. (E) Percentuale di cellule CD34+ della popolazione cellulare recuperate dal canale fluidico. Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio invertito in incubatrice; I dati della citometria a flusso sono stati ottenuti utilizzando citometri a cinque laser e un software dedicato (vedi Tabella dei materiali). Barre di scala = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenti</td>
			<td>Concentrazione delle scorte</td>
			<td>Volume aggiunto</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Miscela nutritiva F-12 di prosciutto (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Supplemento N-2 (100x)</td>
			<td>100 x</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>Supplemento B-27 (50x)</td>
			<td>50 x</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>Acido ascorbico</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>1,25 ml</td>
			<td>25 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>α-Monotioglicerolo (MTG)</td>
			<td>11,5 mio.</td>
			<td>19,5 μL</td>
			<td>448,5 μM</td>
		</tr><tr><td>Albumina sierica umana</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>2,5 mL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td>Olo-transferrina</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>0,75 mL</td>
			<td>150 μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione e ricetta per 500 mL di terreno di differenziazione senza siero (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Giorni di differenziazione</td>
			<td>Miscela di citochine</td>
			<td>Citochine</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Giorno 0 - 2</td>
			<td>Miscela 1</td>
			<td>BMP4</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>Giorno 2</td>
			<td>Miscela 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr><tr><td>Dal giorno 3 in poi</td>
			<td rowspan="2">Mescolare 3 e 4</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>Dal giorno 6 in poi</td>
			<td rowspan="8">Miscela 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Olio di protezione europeo</td>
			<td>3 U/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Miscele di citochine utilizzate per la differenziazione delle cellule endoteliali, giorni in cui vengono aggiunte al terreno SFD e concentrazione finale.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sforzo di taglio (dyn/cm2)</td>
			<td>Tempo (h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Fino alla fine dell'esperimento</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Valori di sforzo di taglio per la coltura dinamica e la durata della loro applicazione.
Figura supplementare S1: Geometria e dimensioni del chip e del tubo utilizzati per questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Figura supplementare S2: Guida passo-passo per il software di controllo della pompa dell'aria con una descrizione di ogni fase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Figura supplementare S3: Guida per l'analisi dell'orientamento utilizzando FIJI che mostra il disegno della forma della cella, l'adattamento ellittico e la misura finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Tabella supplementare S1: Dimensioni dell'unità, volume di risospensione e concentrazioni di stock per le citochine utilizzate nel protocollo di differenziazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Di seguito è descritto un semplice flusso di lavoro per differenziare le cellule endoteliali dalle cellule staminali pluripotenti umane, seguito da un protocollo dettagliato per la loro stimolazione meccanica. Ciò consente lo studio della meccanobiologia dello sviluppo delle cellule endoteliali. Questo approccio è compatibile con i saggi a valle di cellule vive raccolte dal chip di coltura dopo la stimolazione meccanica.

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

La nostra ricerca esplora il modo in cui i segnali meccanici istruiscono il destino delle cellule endoteliali durante lo sviluppo, per il quale combiniamo la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotta dall'uomo con la stimolazione meccanica mediata dai fluidi. Le cellule endoteliali sono costantemente esposte al movimento del sangue, quindi i segnali importanti vengono persi nella coltura statica, il che rende questa la sfida principale nello studio della biologia delle cellule endoteliali utilizzando i sistemi di coltura tradizionali. I segnali meccanici, infatti, attivano molte vie di segnalazione cruciali che potrebbero essere trascurate nelle cellule coltivate in condizioni statiche.Il nostro protocollo fornisce una guida semplice e dettagliata su come differenziare e stimolare meccanicamente le cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte. Ciò aiuterà molti laboratori nell'adozione di una coltura termica per rispondere facilmente alle domande sul comportamento delle cellule endoteliali durante il flusso.

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