Un saggio di reazione a catena della polimerasi digitale a goccia validabile per la rilevazione di vettori virali adeno-associati negli studi di bioshedding delle lacrime

Il nostro protocollo quantifica i vettori virali adeno-associati in matrici complesse. Il rilevamento e la quantificazione accurati sono essenziali per valutare le loro prestazioni negli studi clinici. Questo protocollo cerca specificamente di colmare le attuali lacune normative nella progettazione di studi molecolari conformi alle buone pratiche di laboratorio.

Come parte dello sviluppo del vettore virale, le agenzie di regolamentazione richiedono la valutazione del bio-spargimento dei vettori. ddPCR è una tecnologia promettente per questa valutazione in quanto consente una quantificazione accurata senza l'uso di una curva standard e una sensibilità migliorata rispetto alla qPCR. Una quantificazione accurata nelle matrici complesse incontrate in contesti clinici, come le lacrime, può essere difficile da convalidare a causa dell'interferenza e dell'inibizione della PCR.

Quantità limitate di campioni clinici possono anche limitare la capacità di rilevare eventi rari se il test non è sufficientemente sensibile. Il nostro approccio sviluppa un framework ripetibile e adattabile basato su ddPCR per convalidare i saggi da utilizzare in studi regolamentati. Questo metodo evita una specifica fase di estrazione del DNA, consentendo una convalida più snella e fornisce criteri chiari rispetto ai quali valutare le prestazioni del test per garantire robustezza e ripetibilità.

Questo protocollo ha il potenziale per essere applicato a qualsiasi studio di spargimento del vettore virale, non solo alla rilevazione di AAV nelle lacrime, come presentato qui. Crea una struttura robusta e ripetibile su cui è possibile sviluppare più programmi regolati adatti allo scopo.