Name: Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Impara a incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel di agarosio utilizzando lisati di E. coli. Questo metodo consente lo sviluppo di dispositivi diagnostici innovativi con funzionalità di biosensing.

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Gli autori riconoscono il sostegno dei premi BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), e del premio EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). I dati a supporto di questa pubblicazione sono disponibili all'indirizzo: 10.25405/data.ncl.22232452. Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore.

1. Tampone di lisato cellulare e preparazione dei terreni
<ol><li>Preparazione di 2x YT+P agar e terreno<ol><li>Preparare 2x YT+P agar misurando 16 g/L di triptone, 10 g/L di estratto di lievito, 5 g/L di NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 e 15 g/L di agar. Per il brodo 2x YT+P, seguire la composizione precedente ma omettere l'agar.</li>
		<li>Sterilizzare in autoclave il 2x YT+P.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del tampone S30A<ol><li>Preparare il tampone S30A con 5,88 g/L di Mg-glutammato, 12,195 g/L di K-glutammato e 25 mL/L 2 M Tris, regolato a pH 7,7 con acido acetico.</li>
		<li>Conservare il tampone S30A a 4 °C per un massimo di 1 settimana.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del tampone S30B<ol><li>Preparare il tampone S30B con 5,88 g/L di Mg-glutammato e 12,195 g/L di K-glutammato, regolato a pH 8,2 con 2 M Tris.</li>
		<li>Conservare il tampone S30B a 4 °C per un massimo di 1 settimana.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione del lisato cellulare (protocollo di 4 giorni)
<ol><li>Giorno 1<ol><li>Versare i 2x YT+P in piastre di agar integrate con 100 μg/mL di ampicillina.</li>
		<li>Striare E. coli da un ceppo di glicerolo a -80 °C e incubare per una notte a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 2<ol><li>Inoculare una singola colonia dalla piastra 2x YT+P in 400 mL di brodo 2x YT+P (integrato con ampicillina) in un pallone deflettore da 1 L.</li>
		<li>Incubare per 24 ore a 37 °C agitando a 220 giri/min.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 3<ol><li>Misurare e registrare l'OD600 delle colture 24 h; la crescita è sufficiente ad un OD600 di 3-4. NOTA: Prelevare un'aliquota di 1 mL di coltura batterica ed eseguire una diluizione seriale con terreno (brodo 2x YT+P) prima di misurare l'OD600 nm. Tenere conto dell'effetto di diluizione nel calcolo dell'OD600.</li>
		<li>Trasferire la coltura in modo uniforme tra flaconi da centrifuga da 500 ml prerefrigerati.</li>
		<li>Centrifugare a 4.500 x g per 15 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante.</li>
		<li>Durante la centrifugazione, completare la preparazione del tampone S30A aggiungendo 2 mL/L di 1 M DTT al tampone S30A precedentemente preparato, mescolando e mantenendo il tampone su ghiaccio.</li>
		<li>Risospendere i pellet cellulari in 200 mL di tampone S30A.</li>
		<li>Agitare energicamente le bottiglie fino a quando l'intero pellet non è completamente solubilizzato, mantenendo le cellule il più possibile ghiacciate.</li>
		<li>Centrifugare a 4.500 x g per 15 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.3.5-2.3.7 (inclusi).</li>
		<li>Aggiungere 40 mL di tampone S30A a ciascun flacone da centrifuga, risospendere i pellet e trasferirli in provette da centrifuga da 50 mL prepesate.</li>
		<li>Centrifugare a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante per decantazione e rimuovere il surnatante residuo con una pipetta, tenendolo il più possibile in ghiaccio.</li>
		<li>Pesare nuovamente le provette da centrifuga, registrare la nuova massa e calcolare la massa dei pellet.</li>
		<li>Congelare i pellet in azoto liquido e conservarli a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 4<ol><li>Scongelare i pellet sul ghiaccio.</li>
		<li>Per 1 g di pellet, aggiungere quanto segue: 1,2 mL di tampone S30A (DTT aggiunto prima dell'uso), 275 μL di inibitore della proteasi (stock da 8 mM) e 25 μL di lisozima (stock da 10 mg/mL).</li>
		<li>Vorticare energicamente fino a quando i pellet non sono completamente solubilizzati senza lasciare grumi, mantenendoli il più possibile in ghiaccio.</li>
		<li>In provette da centrifuga da 50 mL, sonicare le sospensioni cellulari a 120 W, 20 kHz, ampiezza del 30% e impulsi on/off di 20 s/40 s per 5 minuti di sonicazione.</li>
		<li>Centrifugare a 4.000 x g per 1 ora a 4 °C per pellettare i detriti cellulari.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in provette da centrifuga fresche da 50 ml.</li>
		<li>Incubare le provette a 37 °C a 220 rpm per 80 min.</li>
		<li>Preparare i materiali per dialisi aggiungendo 1 mL/L di 1 M DTT al tampone S30B. Mescolare e aggiungere 900 ml in un becher sterile da 1 L. Aggiungere un agitatore magnetico e mantenerlo a 4 °C.</li>
		<li>Dopo la reazione di deflusso, trasferire l'estratto cellulare del passaggio 2.4.7 in provette da microcentrifuga da 2 mL e centrifugare a 20.000 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Consolidare il surnatante senza pellet su ghiaccio in una provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
		<li>Determinare il volume totale di estratto cellulare prodotto e idratare il numero necessario di cassette per dialisi MWCO da 10K immergendole in S30B per 2 minuti.</li>
		<li>Caricare le cassette tramite una siringa con un massimo di 3 ml di estratto. Dializzare fino a tre cassette per becher da 1 L, agitando a 4 °C per 3 ore.</li>
		<li>Al termine della dialisi, che chiarifica l'estratto, trasferire l'estratto in provette da microcentrifuga da 2 ml. Centrifugare a 20.000 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Consolidare l'estratto chiarificato in una provetta da centrifuga fresca su ghiaccio e agitare brevemente per mescolare.</li>
		<li>Determinare la concentrazione proteica dell'estratto utilizzando un fluorimetro.</li>
		<li>Diluire l'estratto a una concentrazione di 44,5 mg/mL utilizzando ddH2O pre-raffreddato.</li>
		<li>Aliquote in aliquote da 200 μL, surgelazione in azoto liquido e conservazione a −80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione di idrogel liofilizzati (Metodo A)
<ol><li>Pesare 0,75 g di agarosio, aggiungere ddH2O a un volume di 100 mL e cuocere nel microonde a raffica di 30 s ad alte temperature per creare un brodo di agarosio fuso.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, trasferire 50 μL di agarosio fuso in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e lasciare polimerizzare il gel per 20-30 minuti (la polimerizzazione avviene più velocemente se i gel vengono trasferiti in frigorifero).</li>
	<li>Congelare le provette della microcentrifuga, contenenti i gel polimerizzati, in azoto liquido.</li>
	<li>Rimuovere il coperchio delle provette da centrifuga, coprire le aperture delle provette da centrifuga con una pellicola di cera e forare la pellicola più volte con la punta di un ago o di una pipetta.</li>
	<li>Trasferire le provette della microcentrifuga contenenti i gel polimerizzati a una temperatura di conservazione a -80 °C per 1-2 ore.</li>
	<li>Recuperare le provette da centrifuga dalla conservazione a -80 °C e metterle in un liofilizzatore, assicurandosi che le provette siano completamente asciutte.</li>
	<li>Attivare il liofilizzatore con le seguenti impostazioni: temperatura: −20 °C, pressione: 0,1 mbar.</li>
	<li>Lasciare asciugare il gel per una notte.</li>
	<li>Recuperare i gel dal liofilizzatore e riporli in una temperatura di conservazione a −80 °C fino al momento del bisogno. NOTA: I gel possono essere conservati liofilizzati per un massimo di 1 anno.</li>
</ol>4. Preparazione dello stock di soluzioni energetiche 14x
<ol><li>Combinare tutti i componenti della reazione (Tabella 1) in una provetta da centrifuga da 15 mL su ghiaccio per produrre una soluzione energetica 14x.</li>
	<li>Aliquotare la soluzione energetica 14x in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -80 °C (è possibile utilizzare aliquote di volume inferiore). NOTA: La soluzione energetica 14x può essere conservata per diversi mesi a -80 °C se si evita il congelamento ripetuto dei tubi.</li>
</ol>5. Preparazione del brodo di aminoacidi 4x
<ol><li>Scongelare, sul ghiaccio, tutti i 20 componenti aminoacidici di un kit RTS Amino Acid Sampler. Agitare gli amminoacidi per assicurarsi che siano completamente disciolti.</li>
	<li>In una provetta da centrifuga da 50 mL, unire tutti i 20 amminoacidi e aggiungere 12 mL di ddH2O. Vortex sterile fino a quando la soluzione diventa limpida, con solo una leggera foschia di colorazione bianca.</li>
	<li>Aliquotare i 4 amminoacidi in provette da microcentrifuga da 1,5 mL (aliquote da 500 μL).</li>
	<li>Congelare le aliquote di 4 soluzioni di amminoacidi in azoto liquido e portare le aliquote a una temperatura di conservazione a -80 °C.</li>
</ol>6. Calibrazione del tampone senza cellule
NOTA: Il tampone CFPS utilizzato per le reazioni di idrogel è stato calibrato per concentrazioni ottimali di DTT, Mg-glutammato e K-glutammato seguendo il protocollo di Banks et al.34 modificato da Sun et al.35. Le composizioni delle reazioni di calibrazione sono state selezionate utilizzando il metodo di progettazione degli esperimenti (DOE), con sette livelli di fattori selezionati per K-glutammato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutammato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) e DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). JMP Pro 15 è stato utilizzato per generare un progetto DOE personalizzato (Tabella 2) e condurre l'analisi per determinare le concentrazioni ottimali dei fattori.
<ol><li>Recuperare l'estratto privo di cellule dalla conservazione a −80 °C e scongelare su ghiaccio.</li>
	<li>Scongelare i 4 amminoacidi, la soluzione energetica 14x, il 40% di PEG-8000, il DNA plasmidico, il K-glutammato 3 M, il glutammato Mg 100 mM e il DTT 100 mM sul ghiaccio.</li>
	<li>Creare una miscela master di calibrazione combinando 12,5 μL dei 4 amminoacidi, 3,57 μL della soluzione energetica 14x, 2,5 μL di PEG-8000 al 40%, 3 μg di DNA plasmidico e 10 μL di estratto privo di cellule (44,5 mg/mL) e ottenere fino a 35 μL per reazione con ddH2O.</li>
	<li>Distribuire i 35 μL di master mix nei pozzetti di una piastra nera per microtitolazione da 384 pozzetti.</li>
	<li>Seguendo il progetto DOE, aggiungere il volume appropriato di Mg-glutammato, K-glutammato e DTT a ciascuna reazione, insieme a ddH2O per rendere ogni reazione fino a 50 μL.</li>
	<li>Trasferire la piastra per microtitolazione a un lettore di piastre per il rilevamento e l'analisi della fluorescenza utilizzando le impostazioni del lettore di piastre descritte (per mCherry): eccitazione: 587 nm, emissione: 610 nm, larghezza di banda della lunghezza d'onda: 12 nm, ottica: superiore, temperatura: 37 °C, con letture della fluorescenza raccolte ogni 5 minuti per 4 ore di tempo di lettura totale. Incubare le piastre agitando a 60 giri/min.</li>
	<li>Caricare i risultati nel progetto JMP DOE e generare un profilo di previsione per determinare i livelli di concentrazione ottimali per K-glutammato, Mg-glutammato e DTT in base alle variabili di risposta desiderate; In questo caso, la fluorescenza massima e la velocità di reazione erano le variabili di risposta.</li>
	<li>Combinare i reagenti come mostrato nella Tabella 3 per creare il tampone CFPS 2X</li>
	<li>Aliquote e conservare a −80 °C</li>
</ol>7. CFPS in idrogel liofilizzati reidratati (Metodo A)
NOTA: I plasmidi utilizzati nelle reazioni CFPS sono stati creati utilizzando componenti del toolkit modulare EcoFlex per E. coli36 e descritti in Whitfield et al.11 L'mCherry e l'eGFP erano sotto il controllo del promotore costitutivo JM23100. Questi componenti sono disponibili presso Addgene.
<ol><li>Recuperare l'estratto privo di cellule dalla conservazione a -80 °C e scongelare su ghiaccio per circa 20 minuti.</li>
	<li>Raccogli il tampone CFPS 2x e il DNA plasmidico e scongela sul ghiaccio.</li>
	<li>Raccogliere gli idrogel liofilizzati e lasciarli raggiungere la temperatura ambiente per 15 minuti lasciando riposare i gel sul banco.</li>
	<li>Trasferire i gel in provette per microcentrifuga da 1,5 mL, tagliando i gel con un bisturi se necessario per farli entrare nei pozzetti.</li>
	<li>In una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, combinare 10 μL di estratto privo di cellule con 25 μL di tampone CFPS 2x e 4 μg di DNA plasmidico; fino a un volume totale di 50 μL con ddH2O per creare la soluzione CFPS.</li>
	<li>Pipettare la soluzione di CFPS sugli idrogel liofilizzati.</li>
	<li>Lasciare in ammollo i gel nel sistema CFPS per 5-10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire i gel su una piastra nera per microtitolazione a 384 pozzetti utilizzando una spatola.</li>
	<li>Trasferire la piastra per microtitolazione su un lettore di piastre per il rilevamento e l'analisi della fluorescenza utilizzando le impostazioni del lettore di piastre descritte al punto 6.6. I risultati rappresentativi sono disponibili in studi precedenti31,33.</li>
</ol>8. Sintesi proteica cellulo-free in idrogel distribuibili (Metodo B)
<ol><li>Recuperare l'estratto privo di cellule dalla conservazione a -80 °C e scongelare su ghiaccio per circa 20 minuti.</li>
	<li>Raccogli il DNA plasmidico e scongelalo sul ghiaccio.</li>
	<li>In una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio, combinare 10 μL di estratto privo di cellule con 3 μg di DNA plasmidico e 25 μL di tampone CFPS 2x, per un volume totale di 37,5 μL.</li>
	<li>Misurare 3 g di agarosio e aggiungerli a 100 mL di tampone ddH2O per creare il 3% di agarosio.</li>
	<li>Microonde l'agarosio al 3% in 30 s esplode ad alta potenza.</li>
	<li>Pipettare 12,5 μL di agarosio fuso in provette per microcentrifuga da 1,5 mL contenenti miscela CFPS per un volume totale di 50 μL.</li>
	<li>Lasciare raffreddare l'agarosio fuso, ma non polimerizzare, lasciando l'agarosio in un blocco termico impostato a 50 °C.</li>
	<li>Combinare l'agarosio fuso con la soluzione CFPS; miscelare tramite pipettaggio e agitazione con la punta e assicurarsi di muoversi rapidamente per evitare la polimerizzazione del gel prima che la soluzione CFPS possa essere miscelata.</li>
	<li>Lasciare raffreddare i gel a temperatura ambiente e polimerizzare per circa 2 minuti.</li>
	<li>Trasferire l'agarosio polimerizzato in provette da microcentrifuga da 1,5 mL con una spatola e congelare in azoto liquido.</li>
	<li>Mettere gli idrogel surgelati in un luogo di conservazione a −80 °C per 1 ora.</li>
	<li>Recuperare i gel dallo stoccaggio; Rimuovere i coperchi delle provette della microcentrifuga, coprire le provette con una pellicola di cera e forare la pellicola per consentire l'asciugatura dell'umidità.</li>
	<li>Attivare il liofilizzatore con le seguenti impostazioni: temperatura: −20 °C, pressione: 0,1 mbar, liofilizzazione per 18 ore (notte).</li>
	<li>Conservare i dispositivi CFPS liofilizzati in un luogo di conservazione a −80 °C fino all'uso.</li>
	<li>I dispositivi CFPS liofilizzati, con un volume umido approssimativo di 50 μL, possono essere reidratati con 50 μL di ddH2O senza liquidi in eccesso. La reidratazione dura circa 30 minuti.</li>
	<li>Trasferire i gel su una piastra nera per microtitolazione a 384 pozzetti utilizzando una spatola.</li>
	<li>Trasferire la piastra per microtitolazione su un lettore di piastre per il rilevamento e l'analisi della fluorescenza utilizzando le impostazioni del lettore di piastre descritte al punto 6.6. I risultati rappresentativi sono disponibili in pubblicazioni precedenti31,33.</li>
</ol>

Incorporamento di reazioni CFPS in una varietà di matrici di idrogel

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</ol>

Di seguito sono delineati due protocolli per l'incorporazione di reazioni CFPS a base di lisato di cellule di E. coli in idrogel di agarosio. Questi metodi consentono l'espressione genica simultanea in tutto il materiale. Il protocollo può essere adattato ad altri sistemi CFPS ed è stato condotto con successo con i kit CFPS disponibili in commercio, oltre ai lisati cellulari preparati in laboratorio descritti qui. È importante sottolineare che il protocollo consente l'espressione genica in assenza di una fase li...

La biologia sintetica integra diverse discipline ingegneristiche per progettare e ingegnerizzare parti, dispositivi e sistemi a base biologica in grado di svolgere funzioni che non si trovano in natura. La maggior parte degli approcci di biologia sintetica sono ancora legati a cellule viventi. Al contrario, i sistemi di biologia sintetica senza cellule facilitano livelli senza precedenti di controllo e libertà nella progettazione, consentendo una maggiore flessibilità e un tempo ridotto per l'ingegnerizzazione dei sistemi biologici, eliminando al contempo molti dei vincoli dei tradizionali metodi di espressione genica basati sulle cellule 1,2,3. La CFPS viene utilizzata in un numero crescente di applicazioni in numerose discipline, tra cui la costruzione di cellule artificiali, la prototipazione di circuiti genetici, lo sviluppo di biosensori e la produzione di metaboliti 4,5,6. La CFPS è stata anche particolarmente utile per la produzione di proteine ricombinanti che non possono essere prontamente espresse nelle cellule viventi, come le proteine inclini all'aggregazione, le proteine transmembrana e le proteine tossiche 6,7,8.
La CFPS viene tipicamente eseguita in reazioni liquide. Questo, tuttavia, può limitarne l'impiego in alcune situazioni, poiché qualsiasi dispositivo privo di cellule liquide deve essere contenuto all'interno di un recipiente di reazione. La logica per lo sviluppo dei metodi qui presentati era quella di fornire protocolli robusti per incorporare dispositivi di biologia sintetica privi di cellule in idrogel, non come piattaforma di produzione di proteine di per sé ma, invece, per consentire l'uso di idrogel come telaio fisico per l'implementazione di dispositivi privi di cellule al di fuori del laboratorio. L'uso di idrogel come telaio CFPS presenta diversi vantaggi. Gli idrogel sono materiali polimerici che, nonostante un elevato contenuto di acqua (a volte superiore al 98%), possiedono proprietà solide 9,10,11. Hanno usi come paste, lubrificanti e adesivi e sono presenti in prodotti diversi come lenti a contatto, medicazioni per ferite, nastri adesivi marini, ammendanti e pannolini per bambini 9,11,12,13,14. Anche gli idrogel sono oggetto di studio attivo come veicoli di somministrazionedi farmaci 9,15,16,17. Gli idrogel possono anche essere biocompatibili, biodegradabili e possedere alcune risposte agli stimoliproprie 9,18,19,20. Pertanto, l'obiettivo è quello di creare una sinergia tra la funzionalità derivata dalla biologia molecolare e la scienza dei materiali. A tal fine, sono stati compiuti sforzi per integrare la biologia sintetica priva di cellule con una serie di materiali, tra cui collagene, laponite, poliacrilammide, fibrina, peptide PEG e agarosio 11,21,22, nonché per rivestire superfici di vetro, carta e stoffa11,23,24 con dispositivi CFPS. I protocolli qui presentati dimostrano due metodi per incorporare reazioni CFPS in matrici di idrogel su macroscala (cioè >1 mm), utilizzando l'agarosio come materiale esemplare. L'agarosio è stato scelto per la sua elevata capacità di assorbimento d'acqua, le proprietà autogelificanti controllate e le proprietà meccaniche regolabili 11,24,25,26. L'agarosio supporta anche la CFPS funzionale, è più economico di molte altre alternative all'idrogel ed è biodegradabile, il che lo rende una scelta interessante come sistema modello sperimentale. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati in precedenza appropriati per incorporare la CFPS in una gamma di idrogel alternativi11. Considerando l'ampia gamma di applicazioni degli idrogel e la funzionalità della CFPS, i metodi qui dimostrati possono fornire una base da cui i ricercatori sono in grado di sviluppare materiali idrogel biologicamente migliorati adatti ai propri scopi.
In studi precedenti, sono stati utilizzati sistemi microgel con una gamma di dimensioni da 1 μm a 400 μm per eseguire CFPS in idrogel immersi nel tampone di reazione 23,27,28,29,30,31. L'obbligo di immergere gli idrogel all'interno dei tamponi di reazione CFPS, tuttavia, limita le opportunità per il loro impiego come materiali a sé stanti. I protocolli qui presentati consentono alle reazioni CFPS di avvenire all'interno degli idrogel senza la necessità di immergere i gel nei tamponi di reazione. In secondo luogo, l'uso di gel su macroscala (di dimensioni comprese tra 2 mm e 10 mm) consente lo studio dell'interazione fisica tra idrogel ed espressione genica cell-free. Ad esempio, con questa tecnica, è possibile studiare come la matrice di idrogel influenzi le reazioni di CFPS11 e come le reazioni di CFPS possano influenzare la matrice di idrogel31. Le dimensioni maggiori degli idrogel consentono inoltre lo sviluppo di nuovi materiali bioprogrammabili32. Infine, incorporando le reazioni CFPS negli idrogel, c'è anche una potenziale riduzione della necessità di recipienti di reazione in plastica. Per l'impiego di sensori privi di celle, questo presenta chiari vantaggi rispetto ai dispositivi che dipendono dalla plastica. Nel complesso, l'incorporazione di reazioni CFPS in idrogel offre diversi vantaggi per l'implementazione di dispositivi privi di cellule al di fuori del laboratorio.
L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di consentire il funzionamento di reazioni CFPS all'interno di matrici di idrogel. Sono stati dimostrati due diversi metodi per incorporare reazioni di produzione di proteine prive di cellule in materiali idrogel su macroscala (Figura 1). Nel metodo A, i componenti della CFPS vengono introdotti in idrogel di agarosio liofilizzati per formare un sistema attivo. Nel metodo B, l'agarosio fuso viene miscelato con i componenti della reazione CFPS per formare un sistema completo di idrogel CFPS, che viene quindi liofilizzato e conservato fino al momento del bisogno. Questi sistemi possono essere reidratati con un volume di acqua o tampone e analita per iniziare la reazione.
Questo studio utilizza sistemi basati su lisato cellulare di Escherichia coli. Questi sono alcuni dei sistemi CFPS sperimentali più popolari, poiché la preparazione del lisato cellulare di E. coli è semplice, poco costosa e raggiunge elevate rese proteiche. Il lisato cellulare è integrato con i componenti macromolecolari necessari per eseguire la trascrizione e la traduzione, inclusi ribosomi, tRNA, aminoacil-tRNA sintetasi e fattori di inizio, allungamento e terminazione. In particolare, questo articolo dimostra la produzione di eGFP e mCherry in idrogel di agarosio utilizzando lisati cellulari di E. coli e monitora l'aspetto della fluorescenza utilizzando un lettore di piastre e microscopia confocale. I risultati rappresentativi per il lettore di piastre per microtitolazione possono essere visti in Whitfield et al.31 e i dati sottostanti sono disponibili al pubblico 33. Inoltre, l'espressione di proteine fluorescenti in tutti i gel è confermata utilizzando la microscopia confocale. I due protocolli dimostrati in questo documento consentono l'assemblaggio e la conservazione di dispositivi genetici basati su CFPS in materia con l'obiettivo finale di creare un ambiente fisico adatto per la distribuzione di circuiti genici privi di cellule in modo da supportare la distribuzione sul campo.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214793B</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10752.22</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Severn Biotech</td><td>30-15-50</td><td></td></tr><tr><td>Kit campionatore di aminoacidi</td><td>VWR</td><td></td><td></td>BTRABR1401801</tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937-1G</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Coenzima A (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282-100MG</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J14121.MC</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Acido folinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Carbosynth</td><td>NG01208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td></td></tr><tr><td>K-glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>757551-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD037-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Kit di concentrazione proteica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50668</td><td></td></tr><tr><td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71397-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558-1G</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J23160.MC</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL provette per microcentrifuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS4323-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per dialisi MWCO 10K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi da centrifuga da 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi da centrifuga da 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120-9500</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 1-2 LD Plus Liofilizzatore</td><td>Christ</td><td>codice 101521, 101522, 101527</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-X3R</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per microtitolazione a 384 pozzetti</td><td>Fischer Scientific</td><td>66</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222S</td><td></td></tr><tr><td>Elga Purelab Chorus</td><td>Elga</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuga 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>EP00532</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34183</td><td></td></tr><tr><td>Licenza JMP</td><td>SAS Institute</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Fischer Scientific</td><td>15353518</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-966</td><td></td></tr><tr><td>Fotospettrometro (biofotometro)</td><td>Eppendorf</td><td>16713</td><td></td></tr><tr><td>Pipette e puntali</td><td>Gilson</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia di precisione</td><td>Sartorius</td><td>16384738</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator (Sonicator)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12893543</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore statico</td><td>Sanyo</td><td>MIR-162</td><td></td></tr><tr><td>Siringa e aghi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66490</td><td></td></tr><tr><td>Thermo max Q8000 (incubatore a scuotimento)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Lux platereader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00GD1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Cole-parmer</td><td>OU-04724-05</td><td></td></tr><tr><td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&deg; c contatore</td><td>VWR</td><td>662-1657</td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Le reti di geni sintetici forniscono una piattaforma per scienziati e ingegneri per progettare e costruire nuovi sistemi con funzionalità codificate a livello genetico. Mentre il paradigma dominante per l'implementazione di reti geniche è all'interno di un telaio cellulare, le reti genetiche sintetiche possono anche essere implementate in ambienti privi di cellule. Le applicazioni promettenti delle reti di geni privi di cellule includono i biosensori, poiché questi dispositivi sono stati dimostrati contro bersagli biotici (virus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abiotici (metalli pesanti, solfuri, pesticidi e altri contaminanti organici). I sistemi privi di cellule sono tipicamente distribuiti in forma liquida all'interno di un recipiente di reazione. Essere in grado di incorporare tali reazioni in una matrice fisica, tuttavia, può facilitare la loro più ampia applicazione in un insieme più ampio di ambienti. A tal fine, sono stati sviluppati metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica libera da cellule (CFPS) in una varietà di matrici di idrogel. Una delle proprietà chiave degli idrogel che favoriscono questo lavoro è l'elevata capacità di ricostituzione dell'acqua dei materiali idrogel. Inoltre, gli idrogel possiedono caratteristiche fisiche e chimiche funzionalmente vantaggiose. Gli idrogel possono essere liofilizzati per la conservazione e reidratati per un uso successivo. Vengono presentati due protocolli passo-passo per l'inclusione e il dosaggio delle reazioni CFPS negli idrogel. In primo luogo, un sistema CFPS può essere incorporato in un idrogel tramite reidratazione con un lisato cellulare. Il sistema all'interno dell'idrogel può quindi essere indotto o espresso costitutivamente per la completa espressione proteica attraverso l'idrogel. In secondo luogo, il lisato cellulare può essere introdotto in un idrogel nel punto di polimerizzazione e l'intero sistema può essere liofilizzato e reidratato in un secondo momento con una soluzione acquosa contenente l'induttore per il sistema di espressione codificato all'interno dell'idrogel. Questi metodi hanno il potenziale per consentire reti geniche prive di cellule che conferiscono capacità sensoriali ai materiali idrogel, con il potenziale per la distribuzione al di fuori del laboratorio.

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi per incorporare le reazioni CFPS in matrici di idrogel, con la Figura 1 che presenta una panoramica schematica dei due approcci. Entrambi i metodi sono suscettibili di liofilizzazione e conservazione a lungo termine. Il metodo A è il metodo più utilizzato per due motivi. In primo luogo, è stato dimostrato che è il metodo più applicabile per lavorare con una gamma di materiali idrogel11. In secondo luogo, il metodo A c...

Qui, presentiamo due protocolli per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in matrici di idrogel su macroscala senza la necessità di una fase liquida esterna.

Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Sappiamo che i sistemi viventi integrano continuamente informazioni provenienti da molte fonti diverse e che questi segnali innescano risposte complesse e sottili. Gran parte di questa elaborazione delle informazioni avviene a livello molecolare. Siamo interessati a far funzionare questi processi all'interno dei materiali, ma senza cellule.Lo scopo è quello di dare ai materiali nuove funzionalità. Le sfide in questo lavoro sono principalmente associate alla reazione di sintesi proteica priva di cellule, piuttosto che lavorare con l'idrogel. La reazione cellulare richiede lisato cellulare di alta qualità e DNA di alta qualità e purezza per funzionare bene.Questo protocollo consente ai ricercatori di incorporare reazioni di biologia molecolare in un materiale fisico biodegradabile che può essere prelevato al di fuori del laboratorio. Inoltre, poiché l'output di reazione interagisce direttamente con il telaio del materiale, esiste il potenziale per lo sviluppo di materiali con nuove capacità di rilevamento e risposta. A breve termine, riteniamo che questi metodi forniscano un nuovo percorso per l'implementazione di dispositivi diagnostici privi di cellule.Questo protocollo consente di

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Biologia

Vi presentiamo i protocolli per le 3 dimensioni (3D) incapsulamento delle celle all'interno di idrogel sintetico. La procedura di incapsulamento viene delineato per due metodi comunemente usati di reticolazione (michael-tipo di addizione e di luce iniziata meccanismi di radicali liberi), come pure una serie di tecniche per la valutazione del comportamento delle cellule incapsulate.

Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l&#39;ingegneria tissutale

In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e come questa tecnologia di base può essere modificato per condurre high-throughput di coltura cellulare meccanicamente dinamica sia la cultura bidimensionale e tridimensionale paradigmi.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Questo video illustrerà un metodo rapido e efficiente per metacrilato poli (glicole etilenico), consentendo polimerizzazioni a catena e sintesi idrogel. Si dimostrerà come introdurre in modo simile funzionalità metacrilammide in peptidi, dettaglio metodi analitici comuni per valutare l'efficienza funzionalizzazione, fornire suggerimenti per la risoluzione dei problemi e le modifiche avanzate, e dimostrare le tecniche tipiche di caratterizzazione idrogel.

Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l&#39;uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

Presentiamo la sintesi di un idrogel split-mediata da inteina proteina. Le componenti di questo idrogel sono due copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Miscelazione dei due copolimeri proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide che autoassembla in un idrogel. Questo idrogel è altamente pH e temperatura stabile, compatibile con solventi organici, e...

Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

Descriviamo un processo sequenziale per la formazione mediata dalla luce e il successivo patterning biochimico di matrici sintetiche di idrogel per applicazioni di coltura cellulare tridimensionale. Viene dimostrata la costruzione e la modifica di idrogel con la chimica fotoclick citocompatibile. Inoltre, vengono presentate tecniche semplici per quantificare e osservare i modelli e determinare la vitalità cellulare all'interno di questi idrogel.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Diversi metodi per manipolare architettura tridimensionale in idrogel a base di proteine vengono valutate qui rispetto alla proprietà del materiale. Le reti di macroporosa sono funzionalizzate con un peptide di cella-adesivo, e loro fattibilità in coltura cellulare viene valutata utilizzando due linee cellulari di modello diverso.

Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .

Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

Idrogeli di ingegneria della proteina ricombinanti sono vantaggiosi per la coltura cellulare 3D poiché consentono completa accordabilità della catena polimerica e di conseguenza, il microambiente delle cellule. Qui, descriviamo il processo di purificazione della proteina ricombinante elastino-simili e la sua applicazione in incapsulamento cella 3D idrogel.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Qui, un protocollo è presentato per l'incapsulamento e la coltura delle cellule in poly(ethylene glycol) (PEG) idrogeli funzionalizzati con un fluorogenic metalloproteinasi (MMP)-peptide degradabile. MMP cellulare e dell'attività metabolica sono misurati direttamente dalle culture idrogel utilizzando un lettore di micropiastre standard.

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

Questo articolo descrive i protocolli per la fabbricazione di microgel di gelatina metacriloile ad alta produttività utilizzando dispositivi microfluidici, la conversione di microgel in polvere risostenibile (micro-aerogel), l'assemblaggio chimico di microgel per formare scaffold di idrogel granulare e lo sviluppo di bioink granulari di idrogel con microporosità conservata per il bioprinting 3D.

Scaffold di idrogel granulare di gelatina metacrilico: fabbricazione di microgel ad alta produttività, liofilizzazione, assemblaggio chimico e bioprinting 3D

Impara a incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel di agarosio utilizzando lisati di E. coli. Questo metodo consente lo sviluppo di dispositivi diagnostici innovativi con funzionalità di biosensing.

Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala

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