Name: Metodo basato sullapprendimento automatico di LipidUNet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando lepitelio pigmentato retinico derivato da iPSC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Scopri il metodo LipidUNet per caratterizzare e quantificare i depositi lipidici nell'epitelio pigmentato retinico derivato da iPSC. Questa pipeline semi-automatizzata facilita l'analisi delle goccioline lipidiche per studiare la degenerazione maculare legata all'età.

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Si ringrazia il nucleo istologico del National Eye Institute (NEI) per l'utilizzo del sistema confocale Zeiss. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi IRP NEI (numero di sovvenzione ZIA EY000533-04).

Modellazione e analisi della degenerazione retinica

<ol><li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899(2017).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li>
<li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch%27s+membrane+and+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li>
<li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li>
<li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360(2021).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293(2021).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+%28Y402H%29+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li>
<li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years%2C+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020%3A+the+Right+to+Sight%3A+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li>
</ol>

Nessuna divulgazione.

Questo protocollo fornisce un metodo per etichettare, visualizzare e quantificare in modo efficiente i depositi lipidici in modelli di malattia monogenica e poligenica in vitro per le malattie degenerative dell'occhio. Il software basato sull'intelligenza artificiale, LipidUNet, può essere applicato a tre marcatori lipidici comuni, APOE, Nile Red e BODIPY, e fornisce un metodo rapido e automatico per l'analisi che consente alla quantificazione di essere standard e imparziale.
La principale limitazione di LipidUNet è il fatto che il set di dati di addestramento per l'IA era limitato a immagini di ingrandimento 40x di cellule coltivate in una piastra a 96 pozzetti. Come risultato del set di immagini di addestramento, LipidUNet, nella sua forma attuale, è limitato all'analisi di immagini di ingrandimento 40x. Il software può essere utilizzato per analizzare immagini 40x di cellule coltivate su altre superfici di coltura oltre a una piastra da 96 pozzetti, ma è necessario prestare attenzione a esaminare le maschere di output generate per verificare la soglia accurata da parte del software. Saranno necessari più set di immagini (a diversi ingrandimenti) per espandere la portata di quali campioni / immagini può analizzare.
Il protocollo ha diversi passaggi critici. Nella fase del marcatore lipidico, l'utente deve confermare che il composto di etichettatura scelto (BODIPY, APOE, Nilo Red) ha etichettato il proprio campione in modo efficace. Le cellule RPE mature sono spesso fortemente pigmentate, il che può compromettere il segnale fluorescente dell'immunocolorazione anticorpale. Quando il segnale di fluorescenza è debole o quando c'è troppa colorazione di fondo, LipidUNet non è in grado di discernere con precisione le goccioline lipidiche. Per un motivo simile, è necessario utilizzare le impostazioni di acquisizione correttamente selezionate per la fase di imaging automatico del protocollo. Se le immagini acquisite sono di scarsa qualità, LipidUNet farà fatica a mascherare correttamente le immagini e, pertanto, la quantificazione sarà imprecisa (Figura 6A-L). Infine, la post-elaborazione delle immagini è un passo importante, in quanto LipidUNet ha requisiti specifici per il funzionamento del software.
Rispetto ai flussi di lavoro per l'analisi dei lipidi che utilizzano la soglia manuale o alle tecniche che comportano la soglia automatica in software come Fiji, LipidUNet offre una segmentazione imparziale e affidabile tra le immagini con deposizione lipidica variabile, come riflesso da un piccolo tasso di errore nell'identificazione delle particelle lipidiche (Figura 7). Il software consente all'utente di inserire ulteriori immagini di allenamento, consentendo l'analisi di set di immagini oltre a quelli che utilizzano un obiettivo di ingrandimento 40x o anche quelli che utilizzano un marcatore lipidico diverso, come indicato nel protocollo. In futuro, il software sarà addestrato ad analizzare immagini 3D in modo che sia possibile la quantificazione del volume dei depositi lipidici. Le malattie degenerative degli occhi che implicano la deposizione di lipidi come un importante contributo alla patologia sono prevalenti e si prevede che i casi aumenteranno man mano che la popolazione anziana si espande13. Modelli di malattia accurati e strumenti di analisi efficienti, come abbiamo delineato in questo protocollo, consentiranno lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici.

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule situato nella parte posteriore dell'occhio adiacente ai fotorecettori retinici. RPE svolge un ruolo vitale nel mantenimento di una corretta visione fornendo supporto metabolico e strutturale ai fotorecettori. Le cellule RPE sane sono caratterizzate da una morfologia esagonale distinta. Sono collegati da giunzioni strette, che consentono all'RPE di fungere da barriera tra il coriocapillare situato sul suo lato basale e i fotorecettori situati apicalmente. Per mantenere l'ecosistema retinico, RPE trasporta metaboliti chiave, ad esempio glucosio, ai fotorecettori in modo da ridurre al minimo il consumo di glucosio nell'RPE1. A causa di questa limitazione, RPE dipende da altri metaboliti per mantenere le loro esigenze metaboliche, compresi gli acidi grassi, che RPE converte in chetoni attraverso β-ossidazione2. Data la propensione dell'RPE a utilizzare acidi grassi, che sono probabilmente riciclati dalla digestione del segmento esterno dei fotorecettori (POS), come fonte di energia, cambiamenti dannosi nelle vie di elaborazione dei lipidi nell'RPE spesso portano a, o sono implicati in, malattie degenerative della retina sia monogeniche che poligeniche3.
La degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia degenerativa poligenica dell'occhio che causa la degenerazione RPE, è stata anche collegata all'autofagia aberrante e al metabolismo lipidico nel monostrato RPE. L'incapacità di un monostrato RPE disfunzionale di elaborare POS e svolgere altre funzioni critiche porta a depositi extracellulari (sub-RPE) chiamati depositi lineari basali (BLinD) situati tra l'RPE e la membrana di Bruch - un segno distintivo delle patologie AMD. I componenti principali di BLinD includono le lipoproteine, la più abbondante delle quali è l'apolipoproteina E (APOE)4. L'accumulo di strati sottili di BLinD può portare a drusen morbide, che è riconosciuto come un sintomo clinico di AMD 5,6.
Diversi gruppi hanno dimostrato che i modelli di malattia in vitro derivati da cellule staminali che causano disfunzione RPE presentano un accumulo lipidico sub-RPE 7,8,9. Hallam et al. (2017) hanno generato RPE derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iRPE) da pazienti ad alto rischio di AMD a causa di un polimorfismo del gene CFH. L'iRPE ha mostrato l'accumulo di drusen, come contrassegnato da APOE, e l'RPE ad alto rischio ha accumulato depositi più grandi rispetto all'iRPE generato da pazienti a basso rischio10.
Per creare un modello in vitro che ricapitola i segni distintivi cellulari dell'AMD, come le goccioline lipidiche e la deposizione di drusen, sono state stabilite linee iRPE generate da campioni di sangue dei pazienti utilizzando un protocollo11 guidato dallo sviluppo precedentemente pubblicato. Gli iRPE sono stati sottoposti a siero umano competente per il complemento (CC-HS), una soluzione contenente anafilautotossine che imitano una possibile causa di AMD: aumento della segnalazione del complemento alternativo8. La deposizione cellulare e subcellulare risultante di depositi lipidici è stata misurata utilizzando marcatori lipidici e lipoproteici comunemente usati, APOE, Nile Red e BODIPY. Attraverso questi marcatori, è stato dimostrato che la segnalazione attivata del complemento tramite CC-HS ha esacerbato l'accumulo di lipidi nelle cellule iRPE8.
Per sviluppare un modello di malattia per una malattia degenerativa retinica monogenica, sono state sviluppate linee iRPE da pazienti con malattia di Stargardt, una malattia causata da mutazioni del gene ABCA4 nella RPE. È stato precedentemente dimostrato che quando ABCA4 viene eliminato, la lipofuscina A2E, un deposito intracellulare noto per contenere alti livelli di fosfolipidi e prodotti di perossidazione lipidica dipendenti dalla luce, si accumula all'interno dell'RPE12. Le linee knockout ABCA4 sono state sviluppate insieme alle linee paziente ed entrambe sono state sottoposte ad alimentazione POS. L'iRPE Stargardt ha dimostrato una patologia indotta da fagocitosi POS, che mostra un aumento dell'accumulo lipidico quantificato dalla colorazione BODIPY. RPE derivato da ABCA4 KO iPSC sono stati sottoposti a trattamento CC-HS; la quantificazione del segnale BODIPY ha mostrato un difetto nella gestione dei lipidi anche nel modello di malattia di Stargardt9.
Data la prevalenza di queste malattie e la necessità di terapie efficaci, insieme ai modelli di malattia pertinenti sopra descritti, è necessario stabilire metodi solidi per quantificare l'efficacia dei potenziali trattamenti. Per quantificare i depositi lipidici in modo oggettivo, automatizzato e standardizzato, è stato creato un software basato sull'apprendimento automatico, LipidUNet, in modo che, se abbinato a strumenti di analisi della maschera, la deposizione lipidica possa essere identificata rapidamente ed efficacemente utilizzando i marcatori comuni Nile Red, BODIPY e APOE. Le statistiche riassuntive ottenute utilizzando questa pipeline di analisi possono quindi essere analizzate e visualizzate graficamente, consentendo un facile confronto delle condizioni di trattamento. Lo schema del protocollo è illustrato nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo: le cellule RPE vengono coltivate su una piastra a 96 pozzetti e sfidate con siero umano attivo o segmenti esterni bovini purificati per modellare diversi tipi di degenerazioni retiniche in vitro. Le cellule RPE sono fissate e colorate per i depositi di lipoproteine con Nilo Red, BODIPY e APOE. Un microscopio confocale viene utilizzato per acquisire Z-stack di particelle lipidiche marcate con fluorescenza, che vengono successivamente elaborate in proiezioni di massima intensità 2D. Un algoritmo di apprendimento automatico è stato addestrato per riconoscere e segmentare correttamente le particelle lipoproteiche. Vengono generate tabelle riassuntive contenenti il conteggio delle particelle e varie metriche di forma che possono essere utilizzate per la successiva rappresentazione grafica e analisi statistica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Sistema di filtraggio Steriflip</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-tironina</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina, Frazione V</td><td>MP Biomedical</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 coniglio anti-capra IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21431</td><td>APOE anticorpo secondario</td></tr><tr><td>APOE anticorpo primario</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB947</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Complementare il siero umano competente</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1-LITER</td><td></td></tr><tr><td>CTS N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Supporti di montaggio vetrini</td></tr><tr><td>Vetrini di copertura #1 1/2 22 mm x 22 mm</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72204-01</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio in vetro 25 mm x 75 mm - 1,2 mm di spessore</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71870-01</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha</td><td>Life Technologies</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali</td> Life <td>Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>72485-100MG</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 16%, Microscopia elettronica di grado EM</td><td>Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptococco</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato 10x</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Segmenti esterni dell'asta (OS)</td><td>InVision Bioresources</td><td>98740</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14701SA</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>R& Sistemi D</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo basato sull'apprendimento automatico di lipidunet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando l'epitelio pigmentato retinico derivato da ipsc

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule esagonali situato nella parte posteriore dell'occhio. Fornisce nutrimento e supporto ai fotorecettori e ai capillari coroideali, esegue la fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori (POS) e secerne citochine in modo polarizzato per mantenere l'omeostasi della retina esterna. L'RPE disfunzionale, causata da mutazioni, invecchiamento e fattori ambientali, provoca la degenerazione di altri strati retinici e causa la perdita della vista. Una caratteristica fenotipica della degenerazione dell'RPE sono i depositi ricchi di lipidi intra e subcellulari. Questi depositi sono un fenotipo comune in diverse malattie degenerative della retina. Per riprodurre il fenotipo del deposito lipidico delle degenerazioni retiniche monogeniche in vitro, è stata generata RPE derivata da cellule staminali pluripotenti (iRPE) indotta dai fibroblasti dei pazienti. Le linee cellulari generate da pazienti con malattia da degenerazione retinica di Stargardt e ad esordio tardivo (L-ORD) sono state alimentate con POS per 7 giorni per replicare la funzione fisiologica RPE, che ha causato la patologia indotta dalla fagocitosi POS in queste malattie. Per generare un modello per la degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia poligenica associata all'attivazione del complemento alternativo, l'iRPE è stato sfidato con anafilatossine del complemento alternative. I depositi lipidici intra e subcellulari sono stati caratterizzati utilizzando rosso del Nilo, boro-dipirrometene (BODIPY) e apolipoproteina E (APOE). Per quantificare la densità dei depositi lipidici, è stato sviluppato un software basato sull'apprendimento automatico, LipidUNet. Il software è stato addestrato su immagini di proiezione a massima intensità di iRPE su superfici di coltura. In futuro, sarà addestrato ad analizzare immagini tridimensionali (3D) e quantificare il volume delle goccioline lipidiche. Il software LipidUNet sarà una risorsa preziosa per scoprire farmaci che riducono l'accumulo di lipidi nei modelli di malattia.

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro per identificare i depositi lipidici colorati da Nilo Red, BODIPY e APOE. Il software sviluppato è in grado di identificare e quantificare automaticamente i depositi lipidici e funziona meglio quando il protocollo delineato è ottimizzato. Sono inclusi esempi di RPE differenziato con successo (Figura 3A) e RPE scarsamente differenziato (Figura 3B), poiché la qualità del modello cellulare influisce notevolmente sulla qualità della corretta segmentazione dell'immagine.
Due dei tre marcatori descritti nel protocollo, Nile Red e BODIPY, sono identificati come piccoli punti circolari che sono distintamente luminosi nelle immagini fluorescenti (Figura 5 e Figura 6). Un'immagine "positiva" del protocollo sarebbe un'identificazione appropriata di questi depositi distinti (Figura 5A-D e Figura 5E-H). Un risultato "negativo" mostrerebbe una segmentazione errata dell'immagine scambiando la fluorescenza di fondo come un deposito, a causa di una debole colorazione (Figura 6A-C e Figura 6D-F) o a causa dell'elevata intensità dello sfondo (Figura 6G-I).
I depositi di APOE hanno una varietà di dimensioni e forme, apparendo più ovali o irregolari piuttosto che i depositi circolari di Nilo Red e BODIPY. Questi depositi sono anche meno puntati e l'intensità del segnale può differire tra i depositi a causa delle variazioni nella permeabilizzazione del campione. Una corretta identificazione identificherà ogni deposito, compresi quelli meno saturi (Figura 5I-L), mentre una segmentazione errata non raccoglierà questi depositi (Figura 6J-L). Pertanto, è importante ottimizzare i metodi di colorazione e imaging per evitare variazioni drastiche. Un modo per farlo è prestare particolare attenzione alle fasi di permeabilizzazione del campione durante l'immunocolorazione. Per ottimizzare il segnale fluorescente, le cellule possono essere lisate prima della fissazione e dell'immunocolorazione per l'APOE, il che si traduce in una saturazione uniforme e una migliore segmentazione dei depositi di APOE.
Vengono fornite anche immagini segmentate di cellule maturate su una piattaforma di coltura diversa da una piastra a 96 pozzetti. Il software LipidUNet è stato eseguito su immagini di cellule coltivate su un transwell, e mentre i depositi lipidici sono sogliati, lo sono anche i pori nella membrana transwell (Figura 6M-O). A causa della somiglianza nella forma e nelle dimensioni, il software LipidUNet nella sua forma attuale maschererà indiscriminatamente sia i depositi lipidici che i pori transwell.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Figura 5: Risultati rappresentativi. (A,E,I) Gli RPE placcati a 96 pozzetti sono colorati con colorazione nucleare di Hoechst (blu) e rosso Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (arancione) e sono le proiezioni di massima intensità di una pila Z. (B,F,J) Le immagini di input in scala di grigi per il software LipidUNet dopo l'elaborazione delle immagini. (C,G,K) Maschere generate da LipidUNet, dove tutti i depositi sono identificati correttamente. (D,H,L) I contorni di ogni particella mascherata sono numerati. Queste etichette consentono di collegare ogni particella nell'immagine a una voce nello spreadheet con i dati grezzi. (A-D) mostra la colorazione rosso del Nilo e il software è in grado di riconoscere accuratamente i depositi sullo sfondo nonostante un segnale più debole. (E-H) mostra un forte contrasto tra il segnale BODIPY e lo sfondo, che è l'ideale. LipidUNet identifica correttamente ogni deposito nell'immagine. (I-L) mostra un forte segnale APOE e rappresenta la variabilità della saturazione del segnale che si vede spesso con questa macchia. Tuttavia, la segmentazione delle immagini è in grado di identificare i confini di ciascun deposito APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Figura 6: Risultati non ottimali. (A,D,G,J,M) Gli RPE ben placcati a 96 sono colorati con colorazione nucleare Hoechst (blu) e rosso Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (arancione) e sono le proiezioni di massima intensità di uno Z-stack. (B,E,H,K,N) Le immagini di input in scala di grigi per il software LipidUNet dopo l'elaborazione delle immagini. (C,F,I,L,O) Le maschere errate generate da LipidUNet. I cerchi rossi indicano dove il software ha identificato erroneamente un deposito lipidico. (A-C) L'elaborazione del rosso Nilo non è corretta perché il software ha identificato la colorazione dello sfondo come un deposito. Questo può accadere più spesso quando c'è uno sfondo alto ma pochi depositi lipidici nell'immagine. Vengono mostrati due esempi di colorazione BODIPY: un'immagine di scarsa qualità dovuta alla debole colorazione BODIPY (D-F) e (G - I) un forte segnale BODIPY con sfondo elevato. In entrambi i casi, il software non è in grado di distinguere piccoli depositi lipidici circolari dall'anello circolare di fondo che circonda il nucleo. Mentre la colorazione e l'imaging dovrebbero essere ottimizzati per evitare questi errori, la versione più recente di LipidUNet è ampiamente migliorata per queste immagini. (J-L) Segmentazione APOE errata. Poiché i depositi sono più variabili per dimensioni e saturazione del segnale, il software ha difficoltà a riconoscere alcuni depositi. (M-O) RPE seminato su un transwell e colorato di rosso Nilo. Una fetta dello Z-stack è mostrata qui con entrambi i depositi lipidici rosso Nilo e pori transwell. Il software non è in grado di distinguere tra i due, come mostrato dal cerchio rosso contenente i pori transwell e dalla freccia verde che punta ai depositi rosso del Nilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Figura 7: Confronto tra gli strumenti maschera. (A,B,C) Gli RPE placcati a 96 pozzetti con quantità variabili di deposizione lipidica sono identificati con il rosso del Nilo (rosso). Le immagini sono mascherate utilizzando tre diversi metodi di mascheramento comuni, Find Maxima, Max Entropy e Renyi Entropy, e confrontate con la maschera generata da LipidUNet. L'immagine originale è accompagnata da un conteggio manuale dei depositi lipidici, mentre le maschere mostrano i conteggi previsti da ciascun metodo di segmentazione. Il tasso di errore medio è stato calcolato per ciascun metodo di segmentazione utilizzando la seguente formula: media[(|Conteggio previsto - Conteggio manuale|/Conteggio manuale) x 100]. La maschera generata da LipidUNet identifica più accuratamente i depositi lipidici attraverso le immagini con deposizione variabile rispetto ad altri metodi di mascheramento (tassi di errore medi: 23% LipidUnet, 1164% Trova massimi, 851% Entropia massima, 203% entropia Renyi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Numero di gatto</td>
			<td>Stock Conc.</td>
			<td>Conc. finale</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>MEM alfa</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>Supplemento N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>NA</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FBS inattivato dal calore</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>NA</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10mM</td>
			<td>0,01 mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Piruvato di sodio</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/mL</td>
			<td>100U/mL</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Taurina</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50mg/mL</td>
			<td>250ug/mL</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Idrocortisone</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18,1 mg / L</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0,013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Volume totale, mL</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione del reagente RPE-MM. Un elenco di reagenti e concentrazioni ottimali per RPE-MM.

Le malattie degenerative dell'occhio che colpiscono lo strato di epitelio pigmentato retinico dell'occhio hanno origini monogeniche e poligeniche. Diversi modelli di malattia e un'applicazione software, LipidUNet, sono stati sviluppati per studiare i meccanismi della malattia, nonché potenziali interventi terapeutici.

Metodo basato sull'apprendimento automatico di LipidUNet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando l'epitelio pigmentato retinico derivato da iPSC

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

In questo studio, miriamo a comprendere la patogenesi della macro degenerazione legata all'età e trovare il potenziale trattamento per essa. Questa pipeline semiautomatica per l'analisi delle goccioline lipidiche fornisce un sistema robusto per studiare il metabolismo e le malattie dell'invecchiamento. Il nostro laboratorio si concentra sulla ricerca di bersagli farmacologici per il trattamento dell'AMD utilizzando screening genetici o di piccole molecole che mirano a ridurre l'accumulo di depositi lipidici.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

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I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) supporta la retina sensoriale attraverso il riciclaggio dei sottoprodotti del ciclo visivo, che si accumulano sotto forma di lipofuscina. Questi prodotti sono autofluorescenti e possono essere visualizzati qualitativamente in vivo. Qui, descriviamo un metodo per visualizzare quantitativamente la lipofuscina RPE utilizzando l'oftalmoscopia laser a scansione confocale.

Quantitative Fundus autofluorescenza per la valutazione delle patologie retiniche

Descriviamo un metodo per separare in modo efficiente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) dalla retina negli occhi umani e generare interi supporti piatti RPE / coroidi per analisi istologiche e morfometriche dell'RPE.

Generazione efficiente e coerente di epitelio/coroide pigmentato retinico Flatmounts da occhi umani per analisi istologiche

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Questo protocollo descrive un modello di accumulo di lipofuscina in colture epiteliali di pigmenti retinici (RPE) umane altamente differenziate e polarizzate e un test di fagocitosi del segmento esterno (OS) migliorato per rilevare il consumo totale di OS / capacità di degradazione dell'RPE. Questi metodi superano i limiti dei precedenti modelli di lipofuscina e dei classici saggi di fagocitosi del segmento esterno a inseguimento del polso.

Miglioramento dei modelli di lipofuscina e quantificazione della capacità di fagocitosi del segmento esterno in colture epiteliali di pigmenti retinici umani altamente polarizzate

Il presente studio descrive metodologie basate sulla decellularizzazione per la visualizzazione e la quantificazione della deposizione di tessuto adiposo intramuscolare (IMAT) attraverso il volume muscolare intatto, nonché la quantificazione delle metriche dei singoli adipociti che compongono l'IMAT.

Quantificazione basata sulla decellularizzazione dell'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un multi-funzionale dell'epitelio dell'occhio. Qui presentiamo un protocollo standard per stabilire colture cellulari primarie derivate da RPE murino.

Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse

Nilo rosso macchiatura di fisso Caenorhabditis elegans è un metodo per la misurazione quantitativa dei depositi di lipidi neutri, mentre olio rosso O colorazione facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi fra i tessuti.

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

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La formazione di una corretta rete di sarcomi è importante per la maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC. Presentiamo un approccio basato sulla super risoluzione che consente la valutazione quantitativa della maturazione strutturale dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali, per migliorare le condizioni di coltura che promuovono lo sviluppo cardiaco.

Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola

Scopri il metodo LipidUNet per caratterizzare e quantificare i depositi lipidici nell'epitelio pigmentato retinico derivato da iPSC. Questa pipeline semi-automatizzata facilita l'analisi delle goccioline lipidiche per studiare la degenerazione maculare legata all'età.

Metodo basato sullapprendimento automatico di LipidUNet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando lepitelio pigmentato retinico derivato da iPSC (Video) | JoVE Journal

Metodo basato sull'apprendimento automatico di LipidUNet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando l'epitelio pigmentato retinico derivato da iPSC

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