Name: Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Scopri due metodi per il knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo utilizzando iniezioni ICV e vettori AAV2/5 nei modelli murini. Questa tecnica riduce l'infiltrazione di cellule immunitarie e i punteggi clinici nell'EAE, offrendo nuove prospettive terapeutiche per la sclerosi multipla.

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Riconosciamo con gratitudine il sostegno della National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31800903, assegnato a W. Zheng) e del Wenzhou Science and Technology Project (n. Y2020426, assegnato a Y. Y. Weng) per questo lavoro.

Tutte le procedure sugli animali descritte in questo studio sono state condotte in conformità con le linee guida delineate nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Wenzhou.
1. Animali
<ol><li>Acquista topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane e del peso di 20-22 g.</li>
	<li>Ottenere la linea murina transgenica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e topi maschi A2ARflox/flox .</li>
	<li>Assegnare in modo casuale i topi a due gruppi e alloggiarli in gabbie, con un massimo di cinque topi per gabbia, con un ciclo standard di 12 ore di luce/12 ore di buio per 1 settimana.</li>
	<li>Fornire ai topi cibo e acqua a sufficienza e mantenerli a una temperatura costante di 25 °C.</li>
</ol>2. Knockdown ChP-specifico di A 2ARs con AAV2/5-shRNA
<ol><li>Pesa ogni mouse e annota i valori.</li>
	<li>Anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico all'1% al dosaggio di 6-8 ml/kg equivalenti a 60-80 mg/kg di pentobarbital e posizionare il mouse su un termoforo per tenerlo al caldo. NOTA: È fondamentale somministrare il corretto dosaggio di pentobarbital sodico in base al peso del topo per garantire il successo dell'intervento. L'anestesia non deve essere troppo profonda, in quanto potrebbe causare mortalità, ma non deve essere troppo superficiale, poiché il topo potrebbe svegliarsi durante la procedura, compromettendo potenzialmente l'efficacia dell'iniezione del virus. Verificare la corretta dose di anestesia pizzicando le dita dei piedi e assicurandosi che i topi non rispondano.</li>
	<li>Usa un rasoio per topi specializzato per tagliare i peli superiori dei topi anestetizzati .</li>
	<li>Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per evitare che si secchino e fissare i topi su un apparato stereotassico per immobilizzare il cervello. Copri l'animale con un telo sterile.</li>
	<li>Sterilizzare accuratamente la pelle della testa e del collo dei topi con tre cicli di disinfettante iodoforo e alcol al 75% per ridurre l'infezione postoperatoria. Quindi applicare l'1% di lidocaina per via topica sul cuoio capelluto dei topi e praticare una piccola incisione per esporre completamente il cranio al microscopio. NOTA: Utilizzare strumenti sterili durante tutta la procedura.</li>
	<li>Preparare due siringhe da 10 μL: una con AAV2/5-A2AR-shRNA acquistata (titolo: 6,27 × 109 vg/μL) e l'altra con AAV2/5-Scramble acquistata (titolo: 6,21 × 109 vg/μL). NOTA: Quando si utilizza la siringa, l'estremità anteriore deve essere collegata a un capillare di vetro ed è possibile ottenere un intervallo di 10 μL controllando la lunghezza del capillare di vetro.</li>
	<li>Utilizzare il microscopio per individuare il bregma e il lambda e impostare il punto di coordinate (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2.20) sulla siringa da 10 μL (Figura 1). Il punto di coordinate si basa sull'atlante stereotassico15 del cervello del topo.</li>
	<li>Praticare un piccolo foro nel cranio nel punto di coordinate regolato. NOTA: Al microscopio, la perforazione viene eseguita utilizzando una microfresa sterile contro la superficie del cranio. Dopo la perforazione, rimuovendo le meningi che coprono il cervello ed esponendo il parenchima cerebrale sottostante, si prevengono lesioni ai vasi sanguigni. Questo passaggio impedisce che la punta del capillare di vetro venga spezzata dalle meningi. Il diametro del foro praticato deve essere sufficiente per consentire alla punta dell'ago di entrare nel tessuto cerebrale.</li>
	<li>Somministrare 2 μL di virus AAV2/5-A2AR-shRNA nel ventricolo cerebrale tramite iniezione laterale a una velocità costante di 100 nL/min. Tenere l'ago in posizione per 10 minuti prima di estrarlo. Si noti che il virus è stato somministrato con iniezione unilaterale.</li>
	<li>Sigillare prontamente la pelle lesa utilizzando colla medica di biofibrina per prevenire la perdita di virus, che può essere risciacquata con liquido cerebrospinale dopo aver rimosso l'ago se la colla non viene applicata rapidamente. Inoltre, non utilizzare cotton fioc per pulire il liquido cerebrospinale, poiché potrebbe anche causare la perdita di virus.</li>
	<li>Per facilitare il recupero, posizionare il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37,0 ± 0,5 °C e applicare l'1% di lidocaina per via topica sul cuoio capelluto del topo. Lasciare che i topi si riprendano per 2 settimane prima di indurre il modello EAE, poiché questo periodo è necessario per l'espressione del virus AAV2/5-A 2A R-shRNA e il successivo knockdown diA 2AR.</li>
</ol>3. Knockdown specifico per ChP di A 2AR con un sistema Cre/locus di X-overP1 (Cre/LoxP)
NOTA: Le seguenti procedure possono essere eseguite utilizzando il metodo descritto in precedenza. Fare riferimento ai passaggi 2.1-2.11 per i metodi di iniezione dettagliati.
<ol><li>Iniettare 2 μL di CRE-TAT ricombinasi in ciascun ventricolo laterale di un topo Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato come gruppo sperimentale e 2 μL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) come gruppo di controllo. Utilizzando lo stesso protocollo di cui sopra (paragrafo 2), iniettare 2 μL di CRE-TAT ricombinasi in ciascuno dei ventricoli laterali di topi flox A2AR flox/flox insieme a 2 μL di PBS sterile come gruppo di controllo.</li>
	<li>Preparare sezioni di tessuto congelate ed eseguire la colorazione nucleare 2 settimane dopo l'iniezione di ricombinasi CRE-TAT. Per ulteriori informazioni, vedere i passaggi 4.1-4.3.</li>
</ol>4. Perfusione transcardica nei topi
<ol><li>Somministrare 60-80 mg/kg di pentobarbital sodico per anestetizzare in profondità i topi. Confermare il piano dell'anestesia pizzicando un dito del piede ed eseguire la perfusione transcardica utilizzando 40 mL di soluzione sterile di PBS seguita da 20 mL di paraformaldeide (PFA) al 4%. NOTA: Il successo della perfusione è indicato da un colore bianco nel fegato, mentre la presenza di polmoni ingrossati o di deflusso di PBS dalla bocca durante la perfusione suggerisce un fallimento della procedura.</li>
	<li>Estrai rapidamente il cervello del topo, garantendo una degradazione minima delle proteine.</li>
	<li>Immergere il cervello del topo in PFA/PBS al 4% durante la notte per la post-fissazione, seguita dalla sostituzione con una soluzione di PB al 30% di saccarosio per 72 ore. NOTA: È fondamentale evitare un'eccessiva disidratazione del tessuto cerebrale, quindi il cervello non deve essere lasciato nella soluzione di saccarosio PB per troppo tempo.</li>
</ol>5. Sezionamento e colorazione dei tessuti congelati
<ol><li>Incorporare il cervello di topo precedentemente disidratato in colla a temperatura di taglio ottimale (OCT), congelare il cervello incorporato e utilizzare un microtomo scorrevole per tagliare sezioni coronali con uno spessore di 20 μm.</li>
	<li>Posiziona le sezioni cerebrali sul vetrino. Una volta che le sezioni cerebrali sono asciutte, conservarle in frigorifero a -20 °C per gli esperimenti successivi.</li>
	<li>Metti ogni vetrino in una custodia e immergi il telaio in un contenitore pieno di PBS per risciacquare accuratamente il vetrino. Sciacquare delicatamente i vetrini cerebrali con la soluzione PBS tre volte, per 10 minuti ogni volta. NOTA: Prestare attenzione per evitare che le sezioni cerebrali cadano dal vetrino.</li>
	<li>Colorare i vetrini cerebrali con una soluzione di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 minuti.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini cerebrali con soluzione PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Applicare una goccia di mezzo di montaggio antisbiadimento sulle sezioni cerebrali.</li>
	<li>Posiziona un vetrino coprioggetto sulle sezioni cerebrali, sigilla il vetrino coprioggetto con smalto per unghie e analizza le sezioni utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.</li>
</ol>6. Induzione EAE
NOTA: Eseguire l'induzione EAE dopo 2 settimane dall'iniezione di shRNA o CRE-TAT ricombinasi11.
<ol><li>Creare una soluzione acquosa mescolando 2,5 mg di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) con 2 mL di PBS. Preparare una soluzione completa di olio adiuvante di Freunds (CFA) mescolando M. tuberculosis (H37Ra) con adiuvante di Freunds (IFA) incompleto.</li>
	<li>Mescolare le soluzioni acquose e oleose in rapporto 1:1. Usa una pipa a T per montare la miscela in uno stato di olio in acqua. NOTA: Il tubo a T è anche chiamato tubo a tre vie. È un tubo di plastica in grado di controllare la direzione del flusso della soluzione per miscelare completamente il MOG35-55 e il CFA.</li>
	<li>Utilizzare un omogeneizzatore ad alta velocità per produrre l'emulsione dell'antigene MOG per il modello EAE in condizioni di bagno di ghiaccio.</li>
	<li>Anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico all'1% alla dose di 6-8 ml/kg equivalenti a 60-80 mg/kg di pentobarbital.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea l'emulsione dell'antigene MOG in quattro punti diversi (collo, schiena, fianchi sinistro e destro) a un volume di 10 ml/kg per un totale di quattro iniezioni ciascuna. NOTA: È importante selezionare attentamente il sito di iniezione, poiché siti diversi possono avere effetti diversi sulla morbilità e sulla mortalità dei topi. Inoltre, ripetute iniezioni di MOG possono portare alla tolleranza immunitaria, quindi il team di ricerca ha scelto un singolo metodo di iniezione per prevenire questo potenziale problema.</li>
	<li>Iniettare immediatamente 500 ng/mL di tossina della pertosse (PT) per via intraperitoneale alla dose di 5 mg/kg dopo l'iniezione di MOG. NOTA: Il PT aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB) e facilita l'infiltrazione delle cellule T nel cervello.</li>
	<li>Dopo 48 ore, iniettare per via intraperitoneale la soluzione di PT allo stesso volume.</li>
</ol>7. Punteggio di deficit neurologico
<ol><li>Valutare e classificare i topi giornalmente utilizzando una scala di valutazione 16 che va da 0 a15 per valutare l'incidenza e la gravità dell'EAE in base ai seguenti deficit neurologici: Coda: 0 indica l'assenza di segni, 1 rappresenta una coda semiparalizzata e 2 indica una coda completamente paralizzata. Arti: 0 indica l'assenza di segni, 1 rappresenta un'andatura debole o alterata, 2 indica la paresi e 3 rappresenta un arto completamente paralizzato.</li>
	<li>Assegna un punteggio di 12 a un animale tetraplegico con paralisi completa e assegna un punteggio di 15 alla mortalità.</li>
</ol>8. Colorazione con ematossilina-eosina (H&E)
<ol><li>Prendi il cervello di topo disidratato e incorporalo in paraffina fusa. Lasciare raffreddare e solidificare il blocco di paraffina per un uso successivo. NOTA: Il blocco di paraffina deve essere completamente asciutto e fresco per evitare danni ai tessuti.</li>
	<li>Tagliare il blocco di paraffina cerebrale di topo in vetrini spessi 5 μm. Disporre la sezione di cervello di topo di paraffina su un vetrino e asciugarla in forno a 60 °C per 3 ore.</li>
	<li>Immergere i vetrini in sequenza nella soluzione di xilene I per 10 min, nella soluzione di xilene II per 10 min, nell'alcol 100% I per 3 min, nell'alcol 100% II per 3 min, nell'alcol al 95% per 3 min, nell'alcol al 90% per 3 min, nell'alcool all'80% per 3 min, nell'alcool al 70% per 3 min e nell'acqua distillata per 1 min.</li>
</ol>9. Analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR)
<ol><li>Dopo aver perfuso i topi con PBS, rimuovere il ChP dai ventricoli ed estrarre l'RNA con Trizol. Sintetizzare il cDNA utilizzando il primo kit di sintesi del cDNA a filamento.</li>
	<li>Eseguire l'analisi qPCR utilizzando la premiscela Ex Taq SYBR-green e un sistema di PCR in tempo reale. Utilizzare i seguenti primer A2AR: avanti - GCCATCCCATTCGCCATCA; inverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Silenziamento genico selettivo nel plesso coroideo

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35(2020).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li>
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<li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52(2022).</li>
<li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167(2018).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altre divulgazioni da dichiarare.

La ricerca ha presentato due approcci distinti per il knockdown mirato dei geni ChP. Il primo approccio prevedeva l'iniezione ICV di CRE-TAT, che contiene Cre ricombinasi, in topi flox A2AR/flox. Il secondo approccio ha comportato l'iniezione ICV di AAV2/5 trasportatore di shRNA di A2AR. Utilizzando queste due strategie, il lavoro ha ottenuto il knockdown selettivo di A 2A R all'interno del ChP ed è stato in grado di dimostrare gli effetti protettivi dell'inibizione della segnalazione di ...

Si è spesso pensato che il plesso coroideo (ChP) aiutasse a mantenere l'omeostasi funzionale del cervello secernendo liquido cerebrospinale (CSF) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)1,2. L'aumento della ricerca negli ultimi tre decenni ha rivelato che il ChP rappresenta un percorso distinto per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC).
Le giunzioni strette (TJ) del ChP, composte da un epitelio ChP monostrato, mantengono l'omeostasi immunologica impedendo alle macromolecole e alle cellule immunitarie di entrare nel cervello3. Tuttavia, in determinate condizioni patologiche, il tessuto ChP rileva e risponde ai modelli molecolari associati al pericolo (DAMP) nel liquido cerebrospinale e nel sangue, portando a infiltrazioni immunitarie anomale e disfunzioni cerebrali 4,5. Nonostante il suo ruolo critico, le piccole dimensioni del ChP e la sua posizione unica nel cervello rendono difficile studiarne la funzione senza influenzare altre regioni cerebrali. Pertanto, manipolare l'espressione genica in modo specifico nel ChP è un approccio ideale per comprenderne la funzione.
Inizialmente, le linee transgeniche dell'enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre), che esprimono Cre sotto il controllo di promotori specifici per i geni espressi nel ChP, sono state comunemente utilizzate per eliminare i geni bersaglio mediante l'ibridazione con i geni candidatifloxed 6,7,8. Ad esempio, il fattore di trascrizione Forkhead box J1 (FoxJ1) è espresso esclusivamente nell'epitelio ChP del cervello prenatale del topo7. Pertanto, la linea FoxJ1-Cre è stata spesso utilizzata per eliminare i geni situati nel ChP 6,9. Tuttavia, il successo di questa strategia dipende fortemente dalla specificità del promotore. Si scoprì gradualmente che il modello di espressione di FoxJ1 non era abbastanza distintivo, poiché FoxJ1 era presente anche nelle cellule epiteliali ciliate in altre parti del cervello e del sistema periferico7. Per superare questa limitazione, è stata eseguita un'iniezione intra-cerebroventricolare (ICV) di Cre ricombinasi per veicolare la ricombinasi nei ventricoli delle linee transgeniche floxate. Questa strategia ha mostrato un'elevata specificità, come evidenziato dalla presenza di fluorescenza tdTomato esclusivamente nel tessuto ChP10,11. Tuttavia, questo metodo è ancora limitato dalla disponibilità di linee di topi transgenici floxati. Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno impiegato l'iniezione ICV di virus adeno-associato (AAV) per ottenere il knockdown specifico per ChP o la sovraespressione dei geni bersaglio12,13. Una valutazione completa di diversi sierotipi di AAV per l'infezione da ChP ha rivelato che AAV2/5 e AAV2/8 mostrano forti capacità di infezione nel ChP, pur non infettando altre regioni cerebrali. Tuttavia, è stato riscontrato che AAV2/8 infetta l'ependima che circonda i ventricoli, mentre il gruppo AAV2/5 non ha mostrato alcuna infezione14. Questo metodo ha il vantaggio di superare i limiti dell'acquisizione di animali transgenici floxati.
Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per il knockdown genico nel ChP utilizzando due metodi: ICV di AAV2/5 che trasporta shRNA del recettore dell'adenosina A 2A (A 2AR) e proteina ricombinasi Cre costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT) ricombinasi per ottenere il knockdown specifico per ChP di A2A R. I risultati dello studio suggeriscono che abbattere A2AR nella ChP può alleviare l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo dettagliato fornisce una guida utile per gli studi sulla funzione della ChP e per il knockdown specifico dei geni nella ChP.

<table><tbody><tr><td>Topi A2ARflox/flox</td><td>State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5-A2AR-ShRNA virus</td><td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td><td>pt-4828</td><td></td></tr><tr><td>mezzo di montaggio antisbiadimento</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>capillare in vetro borosilicato</td><td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>apparato stereotassico cerebrale</td><td>RWD, Shenzhen</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRE-TAT ricombinasi</td><td>Millipore</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Absin</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>affettatrice congelata</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson e compagnia</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton siringa</td><td>Hamilton, americana</td><td>P/N:&nbsp; 86259</td><td></td></tr><tr><td>Coadiuvante di Freunds incompleto</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55</td><td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>Colla OCT</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital sodico</td><td>Boyun Biotech</td><td>PC13003</td><td></td></tr><tr><td>Pistola per pipette</td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Takara</td><td>&nbsp; 6110A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>omogeneizzatore ad altissima velocità</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>soluzione</td> <td>di xileneChengdu Kelong Chemical Reagent Company</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

Il plesso coroideo (ChP) funge da porta d'accesso critica per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC) sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Recenti ricerche hanno dimostrato che la regolazione dell'attività di ChP può offrire protezione contro i disturbi del SNC. Tuttavia, studiare la funzione biologica del ChP senza influenzare altre regioni del cervello è impegnativo a causa della sua delicata struttura. Questo studio presenta un nuovo metodo per il knockdown genico nel tessuto ChP utilizzando virus adeno-associati (AAV) o proteina ricombinasi dell'enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre) costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT). I risultati dimostrano che dopo l'iniezione di AAV o CRE-TAT nel ventricolo laterale, la fluorescenza è stata concentrata esclusivamente nel ChP. Utilizzando questo approccio, lo studio ha abbattuto con successo il recettore dell'adenosina A2A (A 2AR) nel ChP utilizzando l'interferenza dell'RNA (RNAi) o Cre/locus dei sistemi X-overP1 (Cre/LoxP) e ha dimostrato che questo knockdown potrebbe alleviare la patologia dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questa tecnica può avere importanti implicazioni per la ricerca futura sul ruolo della ChP nei disturbi del SNC.

Knockdown di A2AR specifico per ChP mediante iniezione ICV di AAV2/5-shRNA o CRE-TAT Il ruolo di A2AR nel ChP come potente regolatore dell'informazione neurale nella patogenesi dell'EAE rimane poco chiaro. Abbattere l'espressione di A 2ARspecifica per ChP potrebbe far luce sugli effetti regolatori di A2AR sul sistema immunitario centrale nell'EAE e in altre infiammazioni del sistema nervoso. Questo studio ha utilizzato l'iniezione ICV di CRE-TAT per ridurre ...

Qui, descriviamo un metodo per alterare selettivamente le espressioni geniche nel plesso coroideo evitando qualsiasi impatto in altre aree cerebrali.

Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

L'obiettivo di questa ricerca è quello di studiare le tecniche per manipolare l'espressione genica nel plesso coroideo. Il nostro studio ha introdotto i due metodi che consentono di eseguire la tecnica esclusivamente nel plesso coroideo senza alcun impatto percepibile su altre regioni. I nostri risultati possono potenzialmente migliorare i futuri studi sulla funzione del plesso coroideo nelle neuroscienze.La nostra ricerca ha esaminato che l'inibizione dell'infiltrazione delle cellule T attraverso il plesso coroideo attraverso il blocco selettivo dell'adenosina a un recettore è sufficiente per proteggere i topi dalla patologia EAE. Questa scoperta supporta l'idea che il rilevamento dell'attività gateway nel plesso coroideo potrebbe presentare una nuova strategia promettente per il trattamento della sclerosi multipla. Questo studio presenta due metodi alternativi per la manipolazione dell'espressione genica nel plesso coroideo.Iniezione ICV di Cre ricombinasi in quei topi transgenici o iniezione ICV di AAV2/5, o è SHI mirato nei topi WT. Questi metodi superano i problemi legati alla promozione della specificità e all'allevamento transgenico dei topi.

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Un metodo per atterramento in modo condizionale espressione di una proteina bersaglio nella retina zebrafish adulto è descritto, che prevede l'iniezione di intravitreally Morpholinos antisenso e electroporating loro nella retina. La proteina risultante è abbattuto per diversi giorni, che consente di testare il ruolo della proteina nella rigenerante o retina intatta.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

In questo video, dimostriamo un metodo per eseguire la trasduzione di vettori lentivirali shRNA per ottenere linee cellulari knockdown stabili in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche immortalizzate (iHSPC).

Knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in iHSPC in vitro: un sistema di espressione shRNA basato su lentivirus Consegna in iHSPC per il knockdown dell'espressione genica specifica

Dimostriamo una tecnica minimamente invasiva denominata neonatale elettroporazione zona subventricolare. La tecnica consiste nell'iniettare DNA plasmidico nei ventricoli laterali di cuccioli neonati e l'applicazione di corrente elettrica per fornire e manipolare geneticamente le cellule staminali...

Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo per la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo zebrafish adulto utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino. Presentiamo questo metodo come protocollo efficiente e rapido che può essere utilizzato per studi funzionali nel cervello dei vertebrati adulto.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.

Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell'età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.

Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro su come combinare artificiale microRNA-mediata RNA interference con optogenetica per stimolare specificamente i boutons presinaptici con ridotta espressione dei geni selettivi all'interno di circuiti neuronali intatti.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

Nel presente studio, l'espressione viene abbattuta di due componenti di segnalazione a valle della via PERK, la calcineurina citoprotettiva e la CHOP pro-apoptotica, utilizzando specifici shRNA. In modi opposti, questi modulano la suscettibilità dei neuroni corticali primari all'atrofia dei neuriti dopo l'induzione dello stress del reticolo endoplasmatico.

Modulazione molecolare da parte di shRNA specifici forniti da lentivirus in neuroni stressati dal reticolo endoplasmatico

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l'introduzione e l'integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.

Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

L'elettroporazione degli organoidi cerebrali dei primati fornisce un approccio preciso ed efficiente per introdurre modificazioni genetiche transitorie in diversi tipi di progenitori e neuroni in un sistema modello vicino allo sviluppo della neocorteccia (pato)fisiologica dei primati. Ciò consente lo studio dei processi neuroevolutivi e di sviluppo e può essere applicato anche per la modellizzazione delle malattie.

Microiniezione mirata ed elettroporazione di organoidi cerebrali di primati per la modificazione genetica

Qui, presentiamo la manipolazione genetica acuta di organoidi corticali umani affettati mediante elettroporazione. Questi modelli di organoidi corticali sono particolarmente suscettibili di iniezione in quanto le strutture simili a ventricole possono essere facilmente identificate dopo lo slicing, consentendo l'indagine funzionale dello sviluppo corticale umano, dei disturbi dello sviluppo neurologico e dell'evoluzione corticale.

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Scopri due metodi per il knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo utilizzando iniezioni ICV e vettori AAV2/5 nei modelli murini. Questa tecnica riduce l'infiltrazione di cellule immunitarie e i punteggi clinici nell'EAE, offrendo nuove prospettive terapeutiche per la sclerosi multipla.

Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo

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