Utilizzo dell'imaging STED su cellule vive per visualizzare l'ultrastruttura della membrana interna mitocondriale in modelli di cellule neuronali
June 30th, 2023
Questo protocollo presenta un flusso di lavoro per la propagazione, la differenziazione e la colorazione di cellule SH-SY5Y in coltura e neuroni ippocampali primari di ratto per la visualizzazione e l'analisi dell'ultrastruttura mitocondriale utilizzando la microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED).
Il nostro programma di ricerca si concentra sugli aspetti strutturali e funzionali dei mitocondri, in particolare in relazione alle disfunzioni legate all'invecchiamento. A tal fine, utilizziamo una vasta gamma di tecniche biofisiche, biochimiche e strutturali per esplorare i meccanismi di base dell'invecchiamento mitocondriale e per sviluppare interventi terapeutici per preservare e ripristinare la salute mitocondriale. La funzione e la struttura mitocondriale sono indissolubilmente correlate.
Le tecniche standard di microscopia ottica sono adatte per misurare le caratteristiche mitocondriali su larga scala come la morfologia di base e le strutture di rete. L'analisi dell'ultrastruttura mitocondriale o delle caratteristiche che richiedono una risoluzione più elevata di quella offerta dalla microscopia ottica tradizionale viene in genere eseguita utilizzando la microscopia elettronica o la tomografia su campioni fissi. La microscopia a super risoluzione è una tecnica di imaging basata sulla fluorescenza che misura le caratteristiche oltre il limite di diffrazione.
Per i mitocondri, questo include misurazioni della distribuzione delle proteine su scala nanometrica e dell'architettura delle cristae. Il protocollo di imaging stead qui descritto consente ai ricercatori di misurare la struttura dettagliata della membrana interna nelle cellule viventi. L'imaging di cellule vive ci consente di osservare e analizzare quantitativamente le caratteristiche complesse delle cristae in condizioni fisiologicamente rilevanti senza la necessità di fissare il campione.
Ciò fornirà ai ricercatori nuove informazioni sui cambiamenti dinamici che si verificano nelle caratteristiche ultra strutturali e sulle loro risposte temporali ai fattori di stress e ai composti farmacologici.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la propagazione, differenziazione e colorazione di cellule SH-SY5Y e neuroni ippocampali primari di topo. L'obiettivo è visualizzare e analizzare l'ultrastruttura mitocondriale utilizzando la microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), fornendo informazioni sulla dinamica strutturale dei mitocondri nelle cellule vive.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Ricerca sui mitocondri
Contesto
- La struttura e la funzione dei mitocondri sono cruciali per la salute cellulare.
- La microscopia tradizionale è limitata nella risoluzione per l'analisi ultrastrutturale.
- La microscopia a super risoluzione permette un'immagine più dettagliata delle caratteristiche mitocondriali.
- Comprendere i cambiamenti mitocondriali può fornire informazioni sull'invecchiamento e la disfunzione.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per studiare l'ultrastruttura mitocondriale in cellule vive.
- Consentire ai ricercatori di analizzare i cambiamenti dinamici nella morfologia mitocondriale.
- Fornire una base per investigare le risposte mitocondriali a vari trattamenti.
Metodi utilizzati
- Coltura cellulare e differenziazione delle cellule neuroblastoma SH-SY5Y.
- Preparazione di neuroni ippocampali primari di topo.
- Utilizzo della microscopia STED per immagini ad alta risoluzione.
- Passaggi chiave includono lo scongelamento delle cellule, il rivestimento delle cover slip e la colorazione con PKMO.
- Acquisizione e analisi delle immagini attraverso software e plugin specifici.
Risultati principali
- Viabilizzazione con successo delle strutture mitocondriali a risoluzione nanometrica.
- Informazioni sull'architettura delle creste e sulla distribuzione delle proteine all'interno dei mitocondri.
- Analisi quantitativa dei cambiamenti nelle caratteristiche mitocondriali in condizioni fisiologiche.
- Risultati potenzialmente significativi riguardanti la risposta dei mitocondri a composti farmacologici.
Conclusioni
- Lo studio dimostra una tecnica valida per investigare la dinamica mitocondriale nelle cellule vive.
- Contribuisce alla comprensione del ruolo dei mitocondri nell'invecchiamento e nella salute cellulare.
- Implicazioni per interventi terapeutici volti a ripristinare la funzione mitocondriale.
