Name: Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre linfiammazione indotta da prioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri come le cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa riducono l'infiammazione gliale indotta da prioni attraverso la co-coltura con glia mista primaria. Questo metodo offre nuove prospettive per la terapia cellulare nelle malattie neurodegenerative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Lab Animal Resources per la loro zootecnia. Le nostre fonti di finanziamento per questo manoscritto includono il Boettcher Fund, il Murphy Turner Fund, il CSU College of Veterinary Medicine e il Biomedical Sciences College Research Council. La Figura 2A, la Figura 2C e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.

I topi sono stati allevati e mantenuti presso il Colorado State's Lab Animal Resources, accreditato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Lab Animal Care International, in conformità con il protocollo #1138, approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Colorado State University.
1. Isolare e infettare la glia mista corticale primaria con i prioni
<ol><li>Per isolare la glia mista primaria contenente sia astrociti che microglia, ottenere cuccioli di topo C57Bl/6 di età compresa tra zero e due giorni. NOTA: Questo protocollo è adattato dai precedenti protocolli 15,16.</li>
	<li>Eutanasia i cuccioli uno alla volta mediante decapitazione ed estrazione del loro cervello, separando e scartando il cervelletto e il tronco encefalico.<ol><li>Mettere il cervello in una capsula di Petri di 3 cm contenente MEM/EBSS fredda con 2x penicillina/streptomicina/neomicina (PSN). In un cannocchiale da dissezione, separare gli emisferi cerebrali e rimuovere e scartare il mesencefalo. Rimuovere e scartare l'ippocampo e le meningi dalla corteccia.</li>
		<li>Porre entrambi gli emisferi corticali in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di MEM/EBSS + 2x PSN e metterli su ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>In una cappa per coltura tissutale, rimuovere il terreno dalla provetta conica da 50 mL aspirando delicatamente con una pipetta, lasciando i pezzi di tessuto corticale sul fondo della provetta. Con una pipetta di vetro rivestita, aggiungere 10 mL di terreno di dissociazione preriscaldato e triturare il tessuto con la pipetta di vetro 10-20x.</li>
	<li>Trasferire la sospensione in un becher da 50 ml contenente una piccola ancoretta e posizionarla su una piastra di agitazione alla massima velocità, circa 30 giri/min, per 10 minuti. Rimuovere il becher dalla piastra di agitazione e impostarlo a un angolo di 30° per 3 minuti per consentire al fazzoletto di depositarsi sul fondo. Rimuovere la sospensione cellulare (surnatante) e trasferirla in una nuova provetta conica da 50 mL su ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere DNasi-I (4.000 U/mL) a 10 mL di terreno di dissociazione, risospendere il tessuto e agitare per altri 10 minuti. Ripetere aggiungendo nuovi mezzi di dissociazione (senza DNasi-I) altre 2-4 volte (una volta ogni due cuccioli di topo utilizzati) e trasferendo la sospensione cellulare nella provetta conica da 50 mL su ghiaccio, fino a quando rimane solo tessuto fibroso sul fondo del becher.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare nella provetta conica per 10 minuti a 1.000 × g a 4 °C. Aspirare il surnatante e sostituirlo con un terreno di coltura gliale. Contare le cellule con un emocitometro e piastrarle a una densità di 10 piastre trattate con colture cellularida 6 in 10 cm. Porre in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo 24 ore, rimuovere il terreno e sostituirlo con un terreno gliale nuovo. Lascia che le celle raggiungano il 100% di confluenza entro 2 settimane; Quindi, dividili e impiattali per sperimentarli.</li>
	<li>Per l'infezione da prioni in vitro , la glia su piastra a 100.000 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti e consentire di raggiungere l'80%-100% di confluenza. Esporre gli omogeneizzati cerebrali, sia prionici che normali, diluiti al 20% in PBS alla luce UV per 30 minuti prima di aggiungerli alla coltura cellulare. Aspirare il terreno dalla glia da infettare e, a ciascun pozzetto, aggiungere 1,5-2 ml di terreno di crescita gliale contenente un volume finale dello 0,1% di normale o omogeneizzato cerebrale prionico.</li>
	<li>Dopo 72 ore, aspirare il terreno e lavare le cellule con PBS per rimuovere l'eventuale omogeneizzato cerebrale residuo. Sostituire con terreni di crescita gliali freschi (non contenenti omogeneizzati cerebrali).</li>
	<li>Per isolare le cellule AdMSCs, utilizzare una pipetta sierologica e aspirare delicatamente il tessuto adiposo insieme a ~1 mL di soluzione di HBSS/tripsina. Trasferire in una piastra di Petri da 4 cm contenente 2 mL di terreno DMEM/F12 con 200 U/mL di DNasi-I e 400 U/mL di miscela di collagenasi/Dispasi. Con piccole forbici, tagliare i pezzi di tessuto adiposo in piccoli pezzi (di dimensioni inferiori a 5 mm) e incubare a 37 °C per 1,5 ore.</li>
	<li>Trasferire il contenuto della capsula di Petri in una provetta conica da 50 ml con una pipetta sierologica e triturare la miscela ~10x con la pipetta. Assicurati che il tessuto si rompa facilmente e formi una miscela relativamente omogenea. Centrifugare la miscela a 4 °C per 5 minuti a 1.000 × g per pellettare la frazione vascolare stromale, che apparirà rossa.</li>
	<li>Aspirare accuratamente il surnatante e lavare il pellet con 5 mL di PBS sterile preriscaldato e centrifugare a 4 °C a 1.000 × g per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno AdMSC (DMEM a basso contenuto di glucosio contenente L-glutammina e integrato con il 15% di siero fetale bovino inattivato termicamente (hiFBS), l'1% di aminoacidi, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di PSN).</li>
	<li>Posizionare un colino cellulare da 40 μm sopra una provetta conica sterile fresca da 50 ml e pipettare la sospensione cellulare attraverso il colino per rimuovere qualsiasi tessuto non dissociato. Aggiungere 9 mL di terreno AdMSC a una piastra da 10 cm trattata con coltura cellulare e pipettare la sospensione cellulare filtrata nella piastra. Porre in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Rimuoverlo e sostituirlo con nuovi supporti AdMSC il giorno successivo. Attendere che le celle diventino confluenti all'80-90% quando saranno pronte per essere fatte passare tra 72 h e 96 h.</li>
	<li>Isolare le AdMSC come descritto sopra e passarle due volte per ottenere una popolazione omogenea coerente 14. Lavare le cellule due volte con PBS sterile e pipettare 2 mL di tripsina preriscaldata (0,25%) su ciascuna piastra. Incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti o fino a quando non si sono completamente staccate dalla piastra. Aggiungere 8 mL di terreno AdMSC preriscaldato a ciascuna piastra, pipettare per miscelare la sospensione cellulare, trasferire nella provetta conica e centrifugare a 1.000 × g a 4 °C per pellettare.</li>
	<li>Risospendere le AdMSC in 3-10 mL di terreno (a seconda del numero di piastre utilizzate) e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Piastra 100.000 cellule/pozzetto in piastre a 6 pozzetti contenenti terreni AdMSC. Porre in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per una notte.</li>
	<li>Il giorno seguente, stimolare le cellule con citochine o omogenato cerebrale.<ol><li>Per le cellule stimolate da citochine, creare terreni AdMSC contenenti 10 ng/mL di TNFα o 200 ng/mL di IFNγ. Utilizzare terreni freschi per i pozzetti di controllo.</li>
		<li>Per i trattamenti con omogeneizzati cerebrali infetti da prioni, ottenere il 20% di omogeneizzato cerebrale (in PBS) da topi prionici infetti terminali (ceppi 22L o RML). Produrre AdMSC mediacon una concentrazione finale dello 0,1% di infetto da prioni o di omogenato cerebrale normale per i controlli.</li>
		<li>Aspirare i terreni dai pozzetti e pipettare 1,5 mL di terreni contenenti citochine o omogeneizzati cerebrali nei pozzetti corrispondenti. Eseguire in triplice copia. Rimettere le piastre nell'incubatrice.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere il terreno, lavare le cellule 2 volte con PBS preriscaldato, isolare l'RNA aggiungendo 350 ml di tampone di lisi contenente l'1% di βME a ciascun pozzetto e utilizzare un sollevatore cellulare per rimuovere i lisati cellulari. Eseguire l'isolamento dell'RNA seguendo il protocollo del produttore del mini kit, inclusa una fase di digestione della DNasi. Per la RT-qPCR, trascrivere inversamente 25 ng di RNA per campione e amplificare il cDNA con SYBR Green e primer per ciascun gene a 10 mM. Analizzare l'espressione dell'mRNA utilizzando il metodo 2-ΔΔCT e normalizzare l'espressione del gene di riferimento β-actina 17. NOTA: Tutta la RT-PCR è stata eseguita seguendo le linee guida MIQE.</li>
	<li>Piastra BV2 microglia a 50.000 cellule per pozzetto o glia mista primaria a 100.000 cellule per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Trattare le cellule BV2 il giorno successivo con terreni contenenti lo 0,1% di infetto da prioni o di normale omogeneizzato cerebrale. Per la glia mista, attendere che le cellule siano confluenti all'80-90% per infettare con l'omogenato cerebrale.</li>
	<li>Incubare le cellule in un terreno contenente l'omogenato cerebrale per 72 ore. Lavare le cellule 2 volte con PBS per rimuovere l'omogeneizzato cerebrale rimanente e aggiungere nuovi terreni e rimetterli nell'incubatore.</li>
	<li>Utilizzare le AdMSC al passaggio 3 per la co-cultura. Se si stimolano le AdMSC, utilizzare terreni contenenti 10 ng/mL di TNFα e trattare per 24 ore prima della co-coltura con BV2 o glia mista. Lavare le AdMSC stimolate 3 volte con PBS per rimuovere il TNFα residuo.</li>
	<li>Tripsinizzare le AdMSC come descritto nel passaggio 1.15 e risospendere nei supporti AdMSC.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione di AdMSC a 1.000 × g a 4 °C per 5 min. Durante questo periodo, sostituire il terreno sulle cellule BV2 o sulla glia mista con 2 mL per pozzetto di terreno AdMSC e posizionare gli inserti per piastre a 6 pozzetti con una dimensione dei pori di 0,4 micrometri in metà dei pozzetti. Aggiungere 2 mL di terreno AdMSC a ciascun inserto e altri 2 mL di terreno ai pozzetti che non ricevono inserti.</li>
	<li>Al termine della pellettatura delle AdMSC, risospendere la pallina in terreni AdMSC. Contare le AdMSC con un emocitometro e aggiungere 50.000-100.000 cellule a ciascun inserto.</li>
	<li>Per le cellule BV2, incubare le co-colture per 24 ore. Per la glia mista, incubare per un minimo di 24 ore e fino a 7 giorni.</li>
	<li>Dopo l'incubazione con AdMSC per il tempo desiderato, rimuovere gli inserti e scartarli, oppure metterli in una nuova piastra a 6 pozzetti, lavare gli inserti 2 volte con PBS, aggiungere il tampone fornito dal kit di isolamento dell'RNA alla glia mista o alle cellule BV2 e raschiare gli inserti per analizzare l'RNA di AdMSC.</li>
	<li>Trattare le AdMSC al passaggio 2 con terreni contenenti 10 ng/mL di TNFα. Il giorno seguente, lavare le cellule con PBS 3x sterile preriscaldato e incubare in terreno AdMSC privo di siero per 4 ore.</li>
	<li>Per eseguire il saggio delle cellule migratorie, aggiungere 25.000 AdMSC per inserto e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C. Durante questo periodo, le cellule migratorie si sposteranno dalla camera superiore dell'inserto e aderiranno alla parte inferiore dell'inserto. Aspirare con cura il contenuto sia del pozzetto che degli inserti e lavare 2 volte con PBS, lasciando 1 mL di PBS in ciascun pozzetto per assicurarsi che gli inserti rimangano umidi su ciascun lato.</li>
	<li>Uno alla volta, usando una pinza, rimuovere gli inserti e pulire delicatamente ma accuratamente la camera superiore con un batuffolo di cotone per rimuovere le cellule che non sono migrate. Aspirare il PBS rimanente e pipettare 500 μL di soluzione di cristallovioletto sia nel pozzetto che nella camera superiore dell'inserto, assicurandosi che la membrana dell'inserto sia completamente sommersa.</li>
	<li>Incubare gli inserti per 1 ora in soluzione di cristallovioletto a temperatura ambiente. Per mantenere al meglio il colore, eseguire rapidamente i passaggi successivi, con un solo inserto alla volta.<ol><li>Aspirare la soluzione di cristallovioletto dal pozzetto e dalla camera superiore dell'inserto e lavare 3 volte con PBS. Pulisci nuovamente la camera superiore con un batuffolo di cotone.</li>
		<li>Posizionare l'inserto in un pozzetto in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente 1 mL di PBS. Posizionare la piastra sopra un microscopio invertito con una fotocamera collegata. Utilizzando l'obiettivo 10x, scatta immagini di quattro aree casuali verso il centro dell'inserto, concentrandoti solo sul lato inferiore dell'inserto.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo aver eseguito questa operazione con ogni pozzetto, carica le immagini sul software di elaborazione delle immagini preferito e regola lo sfondo per migliorare il contrasto con le celle colorate di viola. Conta le celle manualmente con un contatore di celle.</li>
</ol>

Cocoltura di ADMSC e glia per ridurre l'infiammazione indotta da prioni

<ol><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).</li>
<li>Smith, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+unfolded+protein+response+induces+a+specific+reactivity+state+that+causes+non-cell-autonomous+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration.</a> Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Collinge, J., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+model+of+prion+strains+and+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A general model of prion strains and their pathogenicity.</a> Science. 318 (5852), 930-936 (2007).</li>
<li>Gajdusek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmissible+and+non-transmissible+amyloidoses%3A+autocatalytic+post-translational+conversion+of+host+precursor+proteins+to+beta-pleated+sheet+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations.</a> J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).</li>
<li>Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+amyloid+formation+in+the+prion+diseases%3A+importance+of+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).</li>
<li>Hartmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+3%28%2B%29-astrocytes+are+highly+abundant+in+prion+diseases%2C+but+their+abolishment+led+to+an+accelerated+disease+course+and+early+dysregulation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83(2019).</li>
<li>Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+critical+in+host+defense+against+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Microglia are critical in host defense against prion disease.</a> Journal of Virology. 92 (15), e00549(2018).</li>
<li>Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+deficiency+accelerates+prion+disease+but+does+not+enhance+prion+accumulation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain.</a> Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).</li>
<li>Li, M., Chen, H., Zhu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine+in+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114(2022).</li>
<li>Sanchez-Castillo, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+roles%3A+beneficial+effects+of+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells+on+microglia+and+their+implication+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases.</a> Biomolecules. 12 (2), 219(2022).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), 784(2019).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+increases+bone+marrow+mesenchymal+stem+cell+migration+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).</li>
<li>Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+decrease+prion-induced+glial+inflammation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro.</a> Scientific Reports. 12 (1), 22567(2022).</li>
<li>Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+amplify+inflammatory+activation+of+astrocytes+in+manganese+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99(2017).</li>
<li>Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-neuronal+signaling+mechanisms+underlying+the+neuroinflammatory+effects+of+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324(2018).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Hass, R., Otte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+all-round+supporters+in+a+normal+and+neoplastic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%3A+CCS%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26(2012).</li>
<li>Carroll, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+strain+differences+in+accumulation+of+PrPSc+on+neurons+and+glia+are+associated+with+similar+expression+profiles+of+neuroinflammatory+genes%3A+comparison+of+three+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551(2016).</li>
<li>Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+confers+partial+neuroprotection+during+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease.</a> PLoS One. 13 (12), e0208559(2018).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+low-dose+inflammatory+stimulus+synergistically+enhance+bone+marrow+mesenchymal+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration.</a> Cell Proliferation. 50 (1), e12309(2017).</li>
<li>Hay, A. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasally+delivered+mesenchymal+stromal+cells+decrease+glial+inflammation+early+in+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408(2023).</li>
<li>English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+and+TNF-alpha+differentially+regulate+immunomodulation+by+murine+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells.</a> Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).</li>
<li>Hemeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+differentially+affect+cytokine+expression+and+migration+properties+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Carta, M., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+foundations+of+prion+strain+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular foundations of prion strain diversity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+microglia+and+macrophages+in+brain+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair.</a> CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+activities+of+reactive+microglia+and+astrocytes+associated+with+prion+diseases+are+dysregulated+in+opposite+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions.</a> Cells. 10 (7), 1728(2021).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 115(2012).</li>
<li>Shan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effect+of+autologous+compact+bone-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).</li>
<li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cells+trafficking+fluorescent+prion+rods+hours+after+intraperitoneal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2349(2010).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-secreted+TGF-beta+regulates+lipopolysaccharide-stimulated+macrophage+M2-like+polarization+via+the+Akt%2FFoxO1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10, 345(2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Qui dimostriamo un protocollo affidabile e relativamente poco costoso per valutare gli effetti delle cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) nel ridurre l'infiammazione indotta da prioni in un modello di cellule gliali. Le AdMSC possono essere facilmente isolate ed espanse in coltura per l'uso in appena 1 settimana. Questo protocollo produce costantemente una popolazione eterologa di cellule che esprimono marcatori coerenti con quelli delle cellule stromali mesenchimali mediante immunofluorescenza e ...

L'infiammazione gliale svolge un ruolo chiave in una varietà di malattie neurodegenerative, tra cui il Parkinson, l'Alzheimer e la malattia da prioni. Sebbene l'aggregazione proteica anomala sia attribuita a gran parte della patogenesi della malattia e della neurodegenerazione, anche le cellule gliali svolgono un ruolo nell'esacerbare questo 1,2,3. Pertanto, mirare all'infiammazione indotta dalla glia è un approccio terapeutico promettente. Nella malattia da prioni, la proteina prionica cellulare (PrPC) si ripiega erroneamente nella proteina prionica associata alla malattia (PrPSc), che forma oligomeri e aggregati e interrompe l'omeostasi nel cervello 4,5,6.
Uno dei primi segni di malattia da prioni è una risposta infiammatoria da parte degli astrociti e della microglia. Gli studi che sopprimono questa risposta, sia attraverso la rimozione della microglia che la modifica degli astrociti, non hanno generalmente mostrato alcun miglioramento o peggioramento della patogenesi della malattia nei modelli animali 7,8,9. Modulare l'infiammazione gliale senza eliminarla è un'alternativa terapeutica intrigante.
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono diventate un trattamento per una varietà di malattie infiammatorie, grazie alla loro capacità di modulare l'infiammazione in modo paracrino 10,11. Hanno dimostrato la capacità di migrare verso i siti di infiammazione e rispondere alle molecole di segnalazione in questi ambienti secernendo molecole antinfiammatorie, fattori di crescita, microRNA e altro ancora 10,12,13. Abbiamo precedentemente dimostrato che le MSC derivate dal tessuto adiposo (denotate AdMSCs) sono in grado di migrare verso l'omogenato cerebrale infettato da prioni e rispondono a questo omogenato cerebrale sovraregolando l'espressione genica per citochine antinfiammatorie e fattori di crescita.
Inoltre, le AdMSCs possono ridurre l'espressione di geni associati al Nuclear Factor-kappa B (NF-κB), il dominio pirinico della famiglia dei recettori Nod-Like contenente 3 (NLRP3) e l'attivazione gliale, sia nella microglia BV2 che nella glia mista primaria 14. Qui, forniamo protocolli su come isolare sia le AdMSC che la glia mista primaria dai topi, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni modulatori, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia infetta da prioni. Speriamo che queste procedure possano fornire una base per ulteriori indagini sul ruolo delle MSC nella regolazione dell'infiammazione indotta dalla glia nelle malattie neurodegenerative e in altre malattie.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Cytiva</td><td>SH30042,01</td><td></td></tr><tr><td>pipette sierologiche da 5 mL</td><td>Celltreat</td><td>229005B</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari da 10 cm</td><td>Peak Serum</td><td>PS-4002</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td> <td>coniche da 15 mLCelltreat</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>Celltreat</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>BV2 linea cellulare per microglia</td><td>AcceGen Biotech</td><td>ABC-TC212S</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Biologix Research Company</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica cristallovioletto</td><td>Sciences</td><td>&nbsp; 12785</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermo Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Caisson Labs</td><td>DFL14-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi essenziali</td><td>Thermo Scientific</td><td>11130051</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (100%)</td><td>EMD Millipore</td><td>EX0276-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (calore inattivato)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB4</td><td>Può essere acquistato come inattivato a caldo o inattivato in laboratorio</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>EMD Millipore</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica in vetro da 10 ml</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 7077-10N</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Bilancia la soluzione salina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro/Neubauer</td><td>Camera Daigger</td><td>HU-3100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>a basso contenuto di glucosio DMEM contenente L-glutammina</td><td>Cytiva</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>MEM/EBSS</td><td>Cytiva</td><td>SH30024. </td><td></td>FS</tr><tr><td>aminoacidi non essenziali</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145-100M</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (16%)</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina/neomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Cytiva</td><td>&nbsp; SH30256.01</td><td></td></tr> R<tr>&<td>Proteina IFN-gamma ricombinante</td> di <td>topo D Systems</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante di TNF-alfa (aa 80-235) di topo, FC</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>Rivestire l'interno di pipette di vetro aspirando su e giù due volte in Sigmacote e lasciando asciugare completamente. Avvolgere in un foglio di alluminio e sterilizzare in autoclave le pipette 24 ore dopo.</td></tr><tr><td>Stemxyme</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004106</td><td>Miscela di collagenasi / dispasi</td></tr><tr><td>Sterile, tampone di cotone confezionato singolarmente</td><td>Puritan Medical</td><td> 25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture tissutali Thincert, 24 pozzetti, dimensione dei pori = 8 & micro; m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662638</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture tissutali Thincert, 6 pozzetti, dimensione dei pori = 0,4 & micro; m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657641</td><td></td></tr></tbody></table>

cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre l'infiammazione indotta da prioni

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono potenti regolatori dell'infiammazione attraverso la produzione di citochine antinfiammatorie, chemochine e fattori di crescita. Queste cellule mostrano la capacità di regolare la neuroinfiammazione nel contesto di malattie neurodegenerative come la malattia da prioni e altri disturbi del misfolding proteico. Le malattie da prioni possono essere sporadiche, acquisite o genetiche; Possono derivare dal ripiegamento errato e dall'aggregazione della proteina prionica nel cervello. Queste malattie sono invariabilmente fatali, senza trattamenti disponibili.
Uno dei primi segni di malattia è l'attivazione degli astrociti e della microglia e l'infiammazione associata, che si verifica prima dell'aggregazione prionica rilevabile e della perdita neuronale; pertanto, le proprietà antinfiammatorie e regolatorie delle MSC possono essere sfruttate per trattare l'astrogliosi nella malattia da prioni. Recentemente, abbiamo dimostrato che le MSC di derivazione adiposa (AdMSCs) co-coltivate con cellule BV2 o glia mista primaria riducono l'infiammazione indotta dai prioni attraverso la segnalazione paracrina. Questo articolo descrive un trattamento affidabile che utilizza AdMSC stimolate per ridurre l'infiammazione indotta dai prioni.
Una popolazione eterozigote di AdMSC può essere facilmente isolata dal tessuto adiposo murino ed espansa in coltura. La stimolazione di queste cellule con citochine infiammatorie migliora la loro capacità sia di migrare verso l'omogenato cerebrale infetto da prioni che di produrre modulatori antinfiammatori in risposta. Insieme, queste tecniche possono essere utilizzate per studiare il potenziale terapeutico delle MSC sull'infezione da prioni e possono essere adattate per altre malattie neuroinfiammatorie e di misfolding proteico.

La stimolazione delle AdMSC con TNFα o interferone-gamma (IFNγ) per 24 ore induce cambiamenti nell'espressione di molecole antinfiammatorie e fattori di crescita. Il trattamento delle AdMSC con TNFα o interferone-gamma (IFNγ) aumenta l'mRNA del gene 6 stimolato dal TNF (TSG-6), mentre il TNFα, ma non l'IFNγ, provoca un aumento dell'mRNA del fattore di crescita trasformante beta-1 (TGFβ-1). La stimolazione con TNFα o IFNγ induce un aumento dell'mRNA del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF)...

Le cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) hanno potenti proprietà immunomodulatorie utili per il trattamento delle malattie associate all'infiammazione. Dimostriamo come isolare e coltivare le AdMSC murine e la glia mista primaria, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni antinfiammatori e i fattori di crescita, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia primaria mista infettata da prioni.

Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre l'infiammazione indotta da prioni

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Il nostro lavoro si concentra sulle malattie da prioni, che sono malattie neurodegenerative fatali causate dal ripiegamento errato della proteina prionica nel cervello. Pochi studi si sono concentrati sull'impatto delle cellule gliali sulla morte neuronale. Vogliamo capire se fermare l'infiammazione causata dalle cellule gliali può essere un approccio terapeutico.C'è stata una recente scoperta nel campo delle cellule stromali mesenchimali, che ha rivelato che le proprietà protettive derivano dalle vescicole extracellulari che rilasciano. Il nostro obiettivo è quello di approfondire il contenuto di queste vescicole e capire come forniscono protezione contro l'infiammazione gliale indotta dai prioni. Attualmente nel campo della neurodegenerazione, ci sono alcune strade che hanno successo nell'arrestare la neuroinfiammazione.Questi includono piccole molecole e modulazione genetica utilizzando adeno o lentivirus. Tuttavia, nessuno è stato in grado di ridurre completamente l'infiammazione, in particolare in vaste aree del cervello. La scoperta più significativa che siamo stati in grado di stabilire è che attraverso la terapia cellulare, siamo in grado di rallentare la progressione della malattia da prioni attraverso l'inibizione dell'infiammazione gliale.L'uso di un modello primario di malattia a cellule gliali ci permetterà di continuare a interrogarci sulle vie di stress cellulare importanti nella neuroprotezione, in una materia più efficiente e diretta rispetto all'uso di modelli esclusivamente in vivo.

adipose-derived-mesenchymal-stromal-cells-co-cultured-with-primary

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Qui forniamo un protocollo per la coltura di neuroni corticali di ratto in presenza di uno strato alimentatore gliali. I neuroni coltivati ​​stabilire la polarità e di creare le sinapsi, e può essere separato dalla glia per l'utilizzo in diverse applicazioni, quali elettrofisiologia, imaging del calcio, saggi di sopravvivenza cellulare, immunocitochimica, e RNA / DNA / isolamento delle proteine.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per...

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Le cellule globoidi sono una caratteristica patologica distintiva della malattia di Krabbe, una leucodistrofia attualmente priva di una terapia efficace a lungo termine. Abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare per studiare la biologia innata e il potenziale patogenetico delle microglia attivate e la loro trasformazione in cellule globoidi.

Un In Vitro Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l'ambiente in vivo presso il sito di lesione.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Negli organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti suscitano risposte da diversi tipi di cellule come risultato della segnalazione paracrina. I sistemi di co-coltura in insert offrono un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

Qui, presentiamo un protocollo per la cultura 3D del ratto cellule di glia cervello-derivato, tra cui gli astrociti, microglia ed oligodendrociti. Dimostriamo che la cellula primaria cultura, sintesi di idrogel di acido ialuronico methacrylated (HAMA), incapsulamento delle cellule e HAMAphoto-polimerizzazione e campione di elaborazione per l'imaging al microscopio confocale e scansione elettrone.

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Scopri come le cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa riducono l'infiammazione gliale indotta da prioni attraverso la co-coltura con glia mista primaria. Questo metodo offre nuove prospettive per la terapia cellulare nelle malattie neurodegenerative.

Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre linfiammazione indotta da prioni (Video) | JoVE Journal

Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre l'infiammazione indotta da prioni

Esplora altri video