Name: Produzione e ottimizzazione di LTE, un sistema di espressione proteica libera derivato da Leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:10:00.000+00:00
Duration: 3 min 59 s
Description: Scopri il sistema di espressione proteica libera LTE derivato da Leishmania tarentolae per la produzione di proteine ricombinanti. Questo metodo liofilizzato stabile a temperatura ambiente semplifica il trasporto e le applicazioni sul campo.

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Questo protocollo include ricette dettagliate e passaggi dei terreni che coinvolgono la coltura, la centrifugazione, la misurazione della fluorescenza GFP utilizzando un lettore di piastre multimodale, la misurazione della coltura OD600 nm e la valutazione del lisato Abs280 nm. Copre anche la configurazione e l'imaging dei gel proteici SDS-PAGE. I materiali richiesti o suggeriti per questo protocollo sono elencati nel foglio di calcolo dei materiali. È importante notare che le tipiche risorse di laboratorio come componenti di terreni, centrifughe, provette, spettrofotometri e configurazioni di elettroforesi su gel possono probabilmente essere utilizzate in modo intercambiabile, se non diversamente specificato. La Figura 1 fornisce un riepilogo del processo di produzione LTE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del protocollo di produzione LTE. Questo cartone animato fornisce un breve riassunto del protocollo di produzione LTE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Crescita delle colture di Leishmania tarentolae
<ol><li>Preparare almeno 3 L di terreno di coltura TBGG (Bactotriptone 12 g/L, Estratto di lievito 24 g/L, Glicerolo 8 mL/L, Glucosio 1 g/L, KH2PO4 2,3 g/L, K2HPO4 2,5 g/L, vedere la Tabella dei materiali). Sterilizzare il terreno utilizzando un filtro da 0,22 μm sotto vuoto o una configurazione simile.</li>
	<li>Conservare il terreno a temperatura ambiente (RT), con le aggiunte finali (Hemin, antibiotici) aggiunte appena prima dell'inoculazione con L. tarentolae. L'emina (0,25% v/v in 50% trietanolammina) viene aggiunta allo 0,2% v/v, la penicillina (10.000 unità/mL) più la streptomicina (10.000 μg/mL) si mescolano allo 0,5% v/v. NOTA: Il punto di partenza di questo protocollo è una coltura mantenuta di 2 x 10 mL di L. tarentolae wild type. Le colture di mantenimento vengono coltivate a 27 °C in fiasche standard da 50 mL per colture tissutali con bassa agitazione (75 giri/min). Tali colture da 10 mL possono essere mantenute indefinitamente con ~1/20 diluizioni in sterili (TBGG + emina, penicillina, streptomicina) ogni 2-3 giorni. Si consiglia una cabina di biosicurezza standard in un laboratorio PC2; tuttavia, le contaminazioni batteriche tendono ad essere prevenute dagli antibiotici aggiunti, mentre le contaminazioni fungine sono generalmente superate da L. tarentolae.</li>
	<li>Nell'arco di due giorni, espandere le colture di mantenimento di L. tarentolae a 200 ml (giorno 1) e poi a 2 litri (giorno 2) tramite diluizioni 1:10 con un volume crescente di TBGG + emina/antibiotici ogni giorno. Eseguire entrambe le diluizioni in palloni di vetro deflettori da 5 L sterilizzati in autoclave (riempiti fino a un massimo di 1 L). La seconda diluizione deve avvenire nel pomeriggio tra le 15 e le 18, con l'intenzione di iniziare la produzione di lisato il giorno successivo tra le 8 e le 11. NOTA: questo protocollo utilizza il volume iniziale minimo per la produzione di LTE (2 colture da 1 L). È anche possibile espandere la coltura fino a 10 L per la produzione di LTE incorporando un'ulteriore fase di espansione (ad esempio, Giorno 1: 100 mL; Giorno 2: 1 L; Giorno 3: 10 L). Sebbene questo protocollo utilizzi palloni deflettori (vedi Tabella dei materiali) per coltivare L. tarentolae, opzionalmente, possono essere utilizzati bioreattori convenzionali progettati per la crescita batterica con giranti Rushton, a condizione che la velocità di agitazione sia mantenuta al di sotto di 100 giri/min. Il miglioramento dell'aerazione e del controllo del pH nei bioreattori generalmente prolunga la crescita in fase logaritmica delle colture di L. tarentolae , consentendo di utilizzare un raccolto più elevato di600 nm di 10 da utilizzare nella fase 1.4.</li>
	<li>Registrare l'OD600nm della coltura in triplicato tramite una diluizione 1:10 in TBGG direttamente nella cuvetta dello spettrofotometro. Un intervallo di partenza adatto per la produzione di lisato è OD600nm = 4.0-8.0.</li>
	<li>Fornire un tempo di incubazione aggiuntivo se OD600nm &lt; 4.0. Una coltura con OD600nm &gt; 8 è utilizzabile e si tradurrà in un volume maggiore di lisato di espressione cell-free, ma con una qualità inferiore a causa dell'inizio della fase di crescita tardiva. Posizionare i fiasche di coltura sul ghiaccio, in attesa dei passaggi successivi. NOTA: La misurazione accurata della coltura finale OD600nm è fondamentale, in quanto viene utilizzata per calcolare il volume finale delle cellule concentrate prima dell'interruzione. Questo calcolo sostituisce un metodo di pesatura dei pellet utilizzato nelle versioni precedenti della produzione LTE per calibrare la concentrazione delle celle prima dell'interruzione34, al fine di semplificare il protocollo. Assicurarsi di diluire in TBGG per la misurazione OD600nm , altrimenti lo shock osmotico modifica la forma della cella, causando errori di misurazione. Pipettare la diluizione 1:10 per la misurazione OD600nm (direttamente nella cuvetta) pochi secondi prima di eseguire la lettura spettrofotometrica, poiché le cellule di L. tarentolae si depositano rapidamente con un caratteristico aspetto torbido. Se il volume finale della coltura di espressione è considerato approssimativo, si raccomanda anche di pesare i palloni al momento del raccolto (con tara vuota adeguata) per ottenere un volume stimato migliore (a 1 g = 1 mL). Il diametro esterno massimodi 600 nm possibile dalla crescita di L. tarentolae in fiasche deflette è 15-20, sebbene ciò non sia appropriato per la produzione di lisato a causa del raggiungimento della fase stazionaria.</li>
</ol>2. Concentrazione delle colture di L. tarentolae 
<ol><li>Le cellule della Leishmania devono essere lavate e concentrate circa 60 volte prima della disgregazione. Calcolare il volume target per la concentrazione cellulare in base a OD600nm = 300 per il concentrato finale. L'equazione è V = volume del raccolto (mL) x (raccolto OD600nm/300). Ad esempio, utilizzando una coltura da 2 L con un raccolto OD600 = 5, il volume target è 33 mL. NOTA: L'obiettivo OD600nm di 300 può essere modificato; la precedente produzione di LTE ha utilizzato valori compresi tra 150 e 350. Concentrazioni più elevate di cellule che vanno in disgregazione tenderanno a produrre reazioni finali di espressione libera da cellule con rese proteiche più elevate, ma con una maggiore tendenza delle proteine vulnerabili ad aggregarsi. OD600nm = 300 rappresenta un obiettivo predefinito adatto per la produzione LTE.</li>
	<li>Trasferire i fermenti raccolti in apposite bottiglie da centrifuga e centrifugarli a 2500 x g per 10 minuti a 4 °C. Decantare con cura il surnatante nei rifiuti di coltura. NOTA: È importante ridurre al minimo la perdita di cellule nel surnatante scartato, poiché influisce sul calcolo del carico di interruzione. Nei precedenti protocolli di produzione LTE, la concentrazione di cellule di L. tarentolae per l'interruzione è stata calibrata facendo girare il concentrato di cellule in una provetta per microcentrifuga di prova e misurando il peso del pellet rispetto al peso totale34. Questo protocollo semplificato utilizza invece un target teorico di OD600 nm per il concentrato, basato sul OD misurato del raccolto di600 nm, e presuppone una bassa perdita cellulare durante la concentrazione e il lavaggio delle cellule.</li>
	<li>Lavare il pellet cellulare in tampone SEB (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM di saccarosio, 100 mM di KOAc, 3 mM di Mg(OAc)2, tenuto in ghiaccio) tre volte, centrifugando ogni volta a 2500 x g per 10 minuti a 4 °C. Per il primo lavaggio, risospendere ogni 1 litro di coltura pellettata in 100 ml di tampone SEB, quindi combinarli in un unico pallone da centrifuga. Per il secondo lavaggio, utilizzare anche 100 ml di SEB per ogni 1 litro di coltura originale. NOTA: Per la risospensione finale del pellet, aggiungere il tampone SEB al 50% del volume di risospensione target finale (passaggio 2.1). Ciò consente di rabboccare con cura il concentrato raggruppato fino al volume target finale nella fase 2.4. Ogni risospensione deve essere il più delicata possibile per evitare la lisi prematura di L. tarentolae, ad esempio, facendo roteare delicatamente il SEB aggiunto attorno al pellet decantato o pipettando il SEB sul pellet che aderisce alla parete della provetta della centrifuga. Potrebbe essere più conveniente trasferire i surnatanti in provette da centrifuga più piccole per la fase finale.</li>
	<li>Versare il concentrato risospeso in un cilindro volumetrico di vetro lavato adatto, quindi rabboccare il volume fino al volume target (passaggio 2.1) utilizzando un ulteriore SEB freddo e mescolare delicatamente.</li>
</ol>3. Lisi del concentrato di L. tarentolae
<ol><li>Trasferire il concentrato di cellule nel dispositivo di cavitazione dell'azoto (vedi Tabella dei materiali) preraffreddato a 4 °C, pressurizzarlo a 70 bar di azoto e incubare per 45 minuti su ghiaccio. NOTA: Sebbene gli interferenti per cavitazione da azoto non siano comuni articoli di laboratorio, sono consigliati per la produzione di LTE. Sono stati provati metodi alternativi come il congelamento-scongelamento cellulare e gli interferenti di tipo French-press; Tuttavia, l'attività di espressione proteica era del &lt;50% rispetto all'utilizzo del metodo di cavitazione dell'azoto. Il dispositivo di cavitazione dell'azoto deve essere pulito accuratamente prima dell'uso e tra una corsa e l'altra, in modo simile a tutti i recipienti riutilizzati che entrano in contatto con il lisato cellulare da questa fase in poi (come il pallone ricevente). Un regime di pulizia adeguato prevede il lavaggio con detergenti da laboratorio seguito da un accurato risciacquo con acqua deionizzata.</li>
	<li>Aprire lo sfiato del dispositivo di cavitazione dell'azoto ed espellere il lisato risultante in un contenitore adeguatamente robusto, come un pallone ricevitore a vuoto su ghiaccio. Inclinare il pallone del ricevitore per assicurarsi che tutto il lisato risultante si depositi e possa essere pipettato in una nuova provetta da centrifuga o in un recipiente simile. ATTENZIONE: Gli interferenti per cavitazione con azoto si basano sulla brusca transizione del concentrato di celle da 70 bar di azoto alla pressione ambiente, ottenuta attraverso un forte flusso di prima liquido e poi di azoto attraverso la valvola di uscita del dispositivo. Lo sfiato deve essere effettuato con adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) in una cappa di sicurezza chimica. C'è il rischio di rompere il recipiente di destinazione e di perdere il lisato, motivo per cui utilizziamo un robusto ricevitore del vuoto invece di un pallone generico. Se la valvola di uscita del dispositivo è un tubo, evitare di posizionare il tubo direttamente all'interno del ricevitore per evitare un eccessivo accumulo di pressione nel punto di sfiato.</li>
</ol>4. Centrifugazione del lisato cellulare
<ol><li>Trasferire il lisato in provette da centrifuga con forza g adeguate e centrifugare a 10.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante in provette da centrifuga fresche e simili.</li>
	<li>Centrifugare il lisato a 30.000 x g per 15 minuti a 4 °C, quindi rimuovere il surnatante finale in una nuova provetta da centrifuga o in un contenitore simile posto su ghiaccio. Stimare il volume totale.</li>
</ol>5. Filtrazione su gel del lisato cellulare
NOTA: La filtrazione su gel viene utilizzata per rimuovere il saccarosio incluso nel tampone SEB. Mentre il saccarosio aiuta a stabilizzare il macchinario cellulare durante la disgregazione cellulare, diminuisce la resa se trattenuto nelle reazioni di espressione proteica.
<ol><li>Installare un numero sufficiente di colonne di filtrazione su gel alimentate a gravità PD-10 (vedere la Tabella dei materiali) in un formato rack che consenta loro di gocciolare in un vassoio di raccolta o in un contenitore simile sottostante, assicurando che possano filtrare l'intero volume del lisato a 2,5 ml per colonna. Pre-equilibrare le colonne facendo passare in anticipo 10 mL di tampone EB a 4 °C (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)2). NOTA: Tutte le fasi da questo punto in poi traggono vantaggio dall'essere condotte in una cella frigorifera a 4 °C. Tuttavia, è adatto anche per conservare tutti i lisati e i reagenti su una vaschetta del ghiaccio da banco. Un'eccezione è la fase di filtrazione su gel, in cui gli autori posizionano un rack di colonne all'interno di un frigorifero a 4 °C durante il rebuffering. Nelle versioni originali di questo protocollo, le nuove colonne di filtrazione su gel venivano "bloccate" inizialmente tamponando il lisato e scartando il primo output. Sebbene ciò non sia ritenuto necessario, le colonne devono essere lavate con tampone EB e conservate a 4 °C tra i lotti di lisato. Il primo lisato di output può avere un'attività di espressione proteica inferiore rispetto agli output successivi a causa di una certa ritenzione di fondo dei componenti del lisato sulla nuova colonna.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 ml di lisato a ciascuna colonna e attendere che passi nella colonna. Aggiungere altri 0,5 mL di EB per depositare il lisato nella colonna mentre si scarta l'eluato.</li>
	<li>Eluire il lisato filtrato in gel aggiungendo altri 2,5 ml di EB a ciascuna colonna, raccogliendo l'output posizionando un vassoio fresco e pulito o un altro recipiente sotto le colonne.</li>
</ol>6. Integrazione di lisato cellulare
<ol><li>Utilizzare lo spettrofotometro nanodrop (vedere la tabella dei materiali) per misurare l'Abs280nm del lisato filtrato in gel. Se supera i 60, diluirlo per raggiungere Abs280nm = 60 utilizzando un ulteriore tampone EB a 4 °C. NOTA: Mentre il controllo dell'input della densità cellulare nella rottura utilizzando OD600nm determina approssimativamente la forza di uscita del lisato, la normalizzazione dell'Abs280nm dopo la rottura e l'elaborazione del lisato migliora ulteriormente la coerenza del batch delle prestazioni del lisato. Il lisato Abs280nm può essere regolato su e giù, con conseguenze per la resa e l'aggregazione dell'espressione proteica (vedi sezione Discussione). Se il lisato non integrato indica un Abs280nm &lt; 60, potrebbe essere necessario includere più biomassa Leishmania nella fase di disgregazione, cioè aumentare il carico del disgregatore cellulare aOD 600nm &gt; 300 nel passaggio 2.1.</li>
	<li>Aggiungere 5x Feeding Solution (5x FS, Tabella 1) al lisato in un rapporto 2:5 e mescolare accuratamente a vortice. Aliquotarlo in contenitori idonei (ad es. provette per microfuge da 1,5 mL) e congelarlo in azoto liquido. Se si seguono i passaggi facoltativi 7.1-7.3 per l'ottimizzazione delle espressioni LTE riportati di seguito, utilizzare il rNTP.Mg ridotto 5x FS della Tabella 1 invece del 5x FS predefinito. Includere 5 aliquote da 100 μl per il congelamento da utilizzare negli esperimenti di ottimizzazione. NOTA: Il congelamento con il 5x FS predefinito in un rapporto 2:5 crea LTE integrato pronto per l'espressione, utilizzato a 7 μL/10 μL di espressione (quindi, il 5x FS diventa 1x FS nella reazione finale). Tuttavia, gli autori raccomandano di seguire gli ulteriori passaggi opzionali in cui 0,6 volte la quantità predefinita di rNTP e magnesio è fornita nel 5x FS. Questo è seguito da una fase di ottimizzazione in cui viene aggiunta una miscela equimolare dei due (denominata rNTP.Mg) per completare le reazioni di prova a un valore ottimizzato. Il parziale 5x FS contiene anche un oligonucleotide che interrompe l'espressione endogena dell'mRNA (vedi sezione Introduzione). La sequenza dell'oligonucleotide è CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT.</li>
</ol>7. Controllo qualità e ottimizzazione dell'LTE integrato finale
NOTA: I passaggi minimi necessari per determinare l'appropriata aggiunta di rNTP.Mg al rNTP ridotto e al lisato integrato con magnesio prevedono l'espressione di eGFP o di un fluoroforo simile (ad esempio, sfGFP) senza un partner di fusione. Concentrazioni crescenti di rNTP.Mg vengono aggiunte alle reazioni per determinare il punto in cui il livello di espressione (misurato come eGFP RFU tramite un lettore di piastre multimodale) viene ottimizzato. Le terminazioni premature di eGFP, che non sono fluorescenti, diventano evidenti diminuendo l'RFU di eGFP a concentrazioni di rNTP.Mg troppo elevate. Tuttavia, i malfunzionamenti a corto prodotto di LTE si verificano più frequentemente nelle proteine espresse più grandi (&gt;50 kDa). Pertanto, è possibile eseguire questa ottimizzazione utilizzando un modello più grande di eGFP, soprattutto se è disponibile in un vettore di espressione adatto, fornendo una fusione di fluorofori che si desidera venga prodotta da LTE per una particolare applicazione o studio (vedere la sezione Risultati rappresentativi).
<ol><li>Scongelare un'aliquota da 100 μL e impostare sei reazioni di espressione da 10 μL, ciascuna composta da 7 μL di lisato parzialmente integrato dalla fase 6.2, 1 μL di soluzione di rabbocco come da Tabella 2 e 2 μL di acqua ultrapura contenente una quantità sufficiente di DNA per raggiungere una concentrazione finale di 50 ng/μL nella reazione.</li>
	<li>Incubare le reazioni per 2 ore a 25 °C e monitorare l'aumento della fluorescenza della GFP utilizzando un lettore di piastre multimodale. NOTA: I valori di configurazione adatti per GFP sono l'eccitazione a 485 nm (larghezza di banda 5 nm), l'emissione a 516 nm (larghezza di banda 5 nm), con un intervallo di lettura di 1 min per 2 ore.</li>
	<li>Classificare i valori dell'espressione finale per determinare la concentrazione rNTP.Mg corrispondente alla RFU eGFP più alta. Se sono disponibili dati cinetici, un eccesso di rNTP.Mg sarà indicato anche da un aumento bifasico di eGFP RFU durante il periodo di espressione di 2 ore (vedere la sezione Risultati rappresentativi).</li>
	<li>Una volta determinata la concentrazione di rNTP.Mg top-up ottimizzata, aggiungerla a tutte le ulteriori espressioni proteiche utilizzando il lotto di LTE che è stato parzialmente integrato nelle fasi precedenti. NOTA: Se l'aliquotazione al punto 6.2 viene eseguita con attenzione con volumi fissi, il rabbocco può essere aggiunto successivamente a ciascuna aliquota senza scongelamento, ad esempio con le aliquote poste su ghiaccio secco. Queste aliquote sono ora completamente integrate, poiché il rabbocco di rNTP.Mg corretto verrà miscelato attraverso ciascuna di esse quando vengono scongelate e miscelate per l'uso.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo semplificato per la produzione di estratti traslazionali (LTE) di Leishmania

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<li>Johnston, W. A., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+eukaryotic+cell-free+lysate+from+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae.</a> Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).</li>
<li>Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+instabilities+explain+batch-to-batch+variability+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PD-10 SuperDex 25 colonne</td><td>Cytiva</td><td></td><td>17085101 Colonne di filtrazione su gel</td></tr><tr><td>Disgregatore cellulare per cavitazione ad azoto</td><td>Parr Industries</td><td>4635 o 4639</td><td>Disgregatore cellulare</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td>Additivo per colture</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 10000U/ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>Miscela</td></tr> <tr><td>di antibioticiOptiplate 384</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007290</td><td>Piastra multipozzetto per espressioni 10ul</td></tr><tr>Sintesi <td></td><td>di IDT</td> <td>oligonucleotidi</td><td>. Oligo con sequenza CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT</td></tr><tr><td>Creatina Fosfochinasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-15-4</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>Tecan Spark</td><td>Tecan</td><td></td><td>o simile Platereader multimodale</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager</td><td>Biorad</td><td></td><td>o simile SDS-PAGE gel Imager</td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris Gels</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125</td><td>SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Biofotometro</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o similare Spettrofotometro per cuvette</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Spettrofotometro Nanodrop</td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti JXN-26</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>o simile, con rotori/provette da 10K e 50K g</td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o similare, con provette</td></tr> <tr><td>per microcentrifuga da 1,5 mlIncubatore per palloni Inova S44i</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o agitatore per incubatrice per fiasche da 5 litri Palloni di</td></tr><tr><td>coltura in vetro da 5 litri</td><td>Palloni di vetro</td><td></td><td></td> deflettori per la crescita di coltura</tr><tr><td>Bactotriptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td>Terreno di crescita</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Merck</td><td>VM930053</td><td>Terreno di crescita</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi grado analitico</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi grado analitico</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi grado analitico</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi grado analitico</td></tr><tr>Acqua<td>ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>O uscita da qualsiasi erogatore d'acqua di tipo MilliQ</td></tr></tbody></table>

produzione e ottimizzazione di lte, un sistema di espressione proteica libera derivato da leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

Lo scopo dell'espressione proteica cell-free è quello di produrre proteine a lunghezza intera in una forma attiva ripiegata adatta a un'ampia gamma di applicazioni. L'LTE (Leishmania tarentolae extract) è stato precedentemente confrontato con altri sistemi di espressione liberi da cellule procariotiche ed eucariotiche, dimostrando un'elevata capacità di evitare il troncamento e l'aggregazione quando funziona in modo ottimale, in particolare rispetto all'espressione libera da cellule basata su E. coli 33. Tuttavia, in precedenza ciò era accompagnato da una significativa variazione della qualità dell'output da lotto a lotto. Il metodo attuale incorpora ulteriori miglioramenti per garantire una qualità di produzione costante, principalmente attraverso l'integrazione parziale della soluzione di alimentazione necessaria prima del congelamento iniziale dell'LTE in aliquote. Segue l'ottimizzazione delle rNTP.Mg di input trascrizionali in una soluzione di top-up che può essere aggiunta ad ogni reazione successiva o utilizzata per completare direttamente le aliquote congelate. È interessante notare che le reazioni di ottimizzazione rappresentano anche l'uso tipico dell'LTE per esprimere praticamente le proteine, con reazioni effettuate a 25 °C per 2 ore.
I dati derivanti dall'ottimizzazione della concentrazione di rNTP.Mg nelle reazioni libere da cellule forniscono un set di dati rappresentativo. I livelli di espressione in genere aumentano all'aumentare dell'input trascrizionale (rNTP.Mg), indicando un'espressione riuscita. Tuttavia, viene raggiunta una soglia in cui il sistema tende verso l'espressione non produttiva di prodotti troncati, in particolare nel caso di proteine più grandi (&gt;50 kDa). Questa espressione non ottimale porta ad una perdita del segnale di fluorescenza con l'aumentare della rNTP.Mg, particolarmente evidente con le fusioni di fluorofori C-terminali, dove la traduzione del polipeptide non raggiunge il fluoroforo stesso. Per le fusioni N-terminali, mentre una riduzione delle RFU (Unità di Fluorescenza Relativa) complessive non si verifica necessariamente con un eccesso di rNTP.Mg, l'espressione fallita è visibilmente evidente sui gel SDS-PAGE come prodotti fluorescenti multipli di dimensioni decrescenti. Questo approccio sfrutta la capacità della GFP (Green Fluorescent Protein) di mantenere la fluorescenza anche quando visualizzata su un gel SDS-PAGE convenzionale, a condizione che i campioni non vengano riscaldati dopo la miscelazione. Invece, vengono miscelati con il tampone di caricamento del gel e caricati direttamente sul gel. Mentre i materiali e le apparecchiature in gel SDS-PAGE sono generalmente intercambiabili, l'imager per gel deve essere in grado di visualizzare la fluorescenza GFP. Una configurazione tipica per la visualizzazione GFP è fornita con eccitazione a 485 nm (larghezza di banda 5 nm), emissione a 516 nm (larghezza di banda 5 nm) e un intervallo di lettura di 1 minuto su 2 ore.
È possibile ottimizzare il sistema utilizzando la sola espressione di eGFP. Le Figure 2A, B (riquadro) illustrano gli output di espressione tipici delle reazioni di ottimizzazione per due lotti LTE, con RFU eGFP che aumenta con l'aumentare delle concentrazioni di rNTP.Mg, raggiungendo un livello ottimale di +0,6 volte rNTP.Mg (Figura 2A) e +0,3 volte rNTP.Mg (Figura 2B) per la massima RFU. La soluzione di alimentazione rNTP ridotta include 0,6 volte rNTP.Mg, per un totale di livelli di rNTP.Mg di 1,2 volte e 0,9 volte la quantità predefinita per questi batch LTE. La Figura 2C illustra la cinetica dell'aumento delle RFU durante la reazione per il lotto LTE nella Figura 2B, dimostrando una reazione bifasica con due fasi discrete per tutta la durata della reazione.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig02.jpg"> Figura 2: Ottimizzazione dell'aggiunta di top-up di rNTP.Mg in LTE con rNTP ridotto 5x FS. (A) Livelli di espressione di eGFP dopo 140 minuti di espressione da un plasmide di controllo a livelli di top-up variabili di rNTP.Mg nella reazione di espressione libera da cellule (n = 3, media ± SD tracciata). (B) Ottimizzazione di un diverso lotto di produzione LTE, che mostra un'espressione ridotta oltre una certa soglia di rNTP.Mg. (C) Cinetica dell'accumulo di eGFP nelle stesse reazioni di (B), con aumento del rNTP.Mg rabbocco. Questi dati rappresentano anche la cinetica tipica dell'accumulo di proteine nell'espressione batch di LTE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tuttavia, va notato che l'eGFP, essendo una piccola proteina (27 kDa) facile da ripiegare, è probabile che venga espressa, ripiegata e maturata indipendentemente dal sistema di espressione libero da cellule utilizzato. Il fallimento del sistema è più probabile quando si esprimono proteine di interesse più grandi, con prodotti troncati che diventano più evidenti a dimensioni superiori a 70 kDa33. Pertanto, l'ottimizzazione del sistema con la/e proteina/e destinata/e all'uso effettivo è superiore, con l'eGFP ancora presente per la quantificazione ma come fusione N-terminale con la proteina di interesse.
La Figura 3 rappresenta una tipica ottimizzazione del livello di top-up rNTP.Mg quando si utilizza un modello proteico più grande incline a fornire prodotti troncati (eGFP-Sox18). Utilizzando un formato semi-nativo su gel SDS-PAGE (cioè senza riscaldamento dei campioni), è possibile visualizzare il progressivo fallimento dell'espressione. L'aggiunta ottimale di rNTP.Mg a +0,1x (combinata con la rNTP.Mg 0,6x nella soluzione di alimentazione parziale, per un totale di 0,7x) riduce chiaramente la frazione della banda proteica a lunghezza intera come parte dei prodotti di espressione fluorescenti totali, indicando un fallimento del sistema con un'aggiunta di rNTP.Mg eccessiva.
Come menzionato nel protocollo, è possibile saltare la fase di ottimizzazione della rNTP.Mg e aggiungere direttamente l'intera quantità di rNTP.Mg nella soluzione di alimentazione "predefinita" durante l'integrazione subito dopo la filtrazione del gel nella fase 6.2. In questo modo, il protocollo ripristina essenzialmente i metodi originali pubblicati per la creazione di LTE34. Tuttavia, gli autori ritengono che la personalizzazione del sistema per prestazioni ottimali, come dimostrato nella Figura 3 (da corsia D a corsia E), superi la complessità aggiuntiva del protocollo e aumenti il valore dell'LTE come strumento di espressione proteica.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig03.jpg"> Figura 3: Effetto dell'aumento del top-up di rNTP.Mg sull'espressione di eGFP-Sox18 in LTE parzialmente integrato. Gel SDS-PAGE semi-nativo che descrive l'impatto dell'aumento del top-up di rNTP.Mg sull'espressione di eGFP-Sox18. Corsia A: +0,1x (rNTP.Mg) ricarica, Corsia B: +0,2x (rNTP.Mg), Corsia C: +0,3x (rNTP.Mg), Corsia D: +0,4x (rNTP.Mg). La fusione N-terminale di eGFP viene visualizzata mediante scansione a fluorescenza del gel. La banda principale nella corsia A rappresenta l'intera eGFP-Sox18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Componente</td>
			<td rowspan="2">Concentrazione delle scorte</td>
			<td>5x soluzione di alimentazione</td>
			<td>μL di materiale di partenza/mL 5x Soluzione di alimentazione</td>
		</tr><tr><td>Predefinito (rNTP ridotto)</td>
			<td>Predefinito (rNTP ridotto)</td>
		</tr><tr><td>Spermidina</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>DTT</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Creatina Fosfato</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>HEPES-KOH pH7.6</td>
			<td>2500 mM</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>PEG3000</td>
			<td>0,5 V/V</td>
			<td>0,05 V/V</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td>
			<td>120 volte</td>
			<td>5 volte</td>
			<td>43</td>
		</tr><tr><td>Aminoacidi</td>
			<td>3,6 mM (ea)</td>
			<td>0,68 mM (cada)</td>
			<td>190</td>
		</tr><tr><td>ATP</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>8,5 (5,1) mM</td>
			<td>85 (51)</td>
		</tr><tr><td>GTP</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>3,2 (1,9) mM</td>
			<td>32 (19)</td>
		</tr><tr><td>UTP</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>Programmazione</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>Mg(OAc)2</td>
			<td>1 milione</td>
			<td>16,7 (10) mM</td>
			<td>16,7 (10)</td>
		</tr><tr><td>Oligo leader anti-splicing</td>
			<td>1 milione</td>
			<td>0,05 mM</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>T7 RNA polimerasi</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Creatina Fosfochinasi</td>
			<td>5 unità/μL</td>
			<td>0,2 unità/μl</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Acqua ultrapura</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19 (93)</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione di 5x soluzione di alimentazione (5x FS) per LTE. È necessario 1 mL di 5x FS per ogni 2,5 mL di lisato non integrato dopo la filtrazione su gel. L'integrazione con il 5x FS predefinito crea un LTE pronto per l'espressione da utilizzare nelle reazioni di espressione con un rapporto di 7 μL/10 μL. La ricetta rNTP.Mg ridotta (quantità in corsivo) è consigliata per l'ottimizzazione dell'espressione LTE e contiene 0,6 volte i livelli predefiniti di rNTP e magnesio. Questi possono essere regolati a livelli variabili (da 0,6 a 1,1 volte) nel successivo esperimento di ottimizzazione utilizzando le aggiunte descritte nella Tabella 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ricarica rNTP</td>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>MgOAc (1 M)</td>
			<td rowspan="2">Acqua ultrapura</td>
		</tr><tr><td>(1 μL/10 μL rxn)</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
		</tr><tr><td>+0x</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>Pagine +0,1x</td>
			<td>3.4</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.7</td>
			<td>193</td>
		</tr><tr><td>Pagine +0,2x</td>
			<td>6.8</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1.3</td>
			<td>185</td>
		</tr><tr><td>Pagine +0,3x</td>
			<td>10.2</td>
			<td>3.8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>178</td>
		</tr><tr><td>Cifre +0,4x</td>
			<td>13.6</td>
			<td>5.1</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>2.7</td>
			<td>171</td>
		</tr><tr><td>Pagine +0,5x</td>
			<td>17</td>
			<td>6.4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.3</td>
			<td>163</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Composizione di (rNTP.Mg) soluzioni di ricarica per l'ottimizzazione LTE. Queste soluzioni vengono utilizzate per ottimizzare l'LTE aggiungendo 1 μL di soluzione di rabbocco per 10 μL di reazione di espressione proteica. Una volta determinato un livello di rabbocco nell'esperimento di ottimizzazione, può essere aggiunto in modo coerente a tutte le successive reazioni di espressione proteica utilizzando le stesse aliquote batch LTE. In alternativa, può essere aggiunto direttamente alle aliquote stesse con un'aggiunta di 1 μl per 7 μl (senza scongelamento). Dopo lo scongelamento e la miscelazione, questi lisati vengono utilizzati a 8 μL di LTE per 10 μL di espressione proteica, mantenendo il livello di topup rNTP.Mg stabilito durante l'ottimizzazione.

Produzione e ottimizzazione di LTE, un sistema di espressione proteica libera derivato da Leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

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Questo protocollo descrive il sistema di sintesi proteica senza cellule (CFPS) utilizzato nella costruzione di cellule sintetiche. Delinea le fasi chiave con risultati rappresentativi in diversi micro-compartimenti. Il protocollo mira a stabilire le migliori pratiche per i diversi laboratori della comunità delle cellule sintetiche, facendo avanzare i progressi nello sviluppo delle cellule sintetiche.

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

Il controllo dell'espressione proteica non è solo essenziale per ogni organismo vivente, ma anche un'importante strategia per studiare le funzioni proteiche nei modelli cellulari. Il protocollo presentato mostra l'applicazione dell'interferenza anticorpale nelle cellule di mammifero, compresi i neuroni primari dell'ippocampo, e dimostra l'uso di ricostruzioni tridimensionali nello studio della funzione delle proteine.

Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

Scopri il sistema di espressione proteica libera LTE derivato da Leishmania tarentolae per la produzione di proteine ricombinanti. Questo metodo liofilizzato stabile a temperatura ambiente semplifica il trasporto e le applicazioni sul campo.

Produzione e ottimizzazione di LTE, un sistema di espressione proteica libera derivato da Leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti (Video) | JoVE Journal

Produzione e ottimizzazione di LTE, un sistema di espressione proteica libera derivato da Leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti

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