Un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per l'isolamento di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento di singoli nuclei
28 luglio 2023
Lo studio descrive un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per isolare nuclei di alta qualità da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei a valle.
Questa ricerca si concentra sul supporto di studi di scoperta di farmaci che utilizzano il sequenziamento di RNA a singolo nucleo per studiare l'efficacia e la sicurezza di potenziali trattamenti. Pertanto, stiamo sviluppando protocolli standardizzati di estrazione dei nuclei per campioni di tessuto fresco congelato da vari organi. Il nostro obiettivo era quello di automatizzare e standardizzare l'estrazione dei nuclei per ottenere risultati coerenti e affidabili riducendo la variabilità non biologica.
Il vantaggio è la parziale automazione attraverso l'utilizzo di un dissociatore robotico e il flusso di lavoro semplice e breve che può essere applicato su vari campioni di tessuto di diverse specie. Avere protocolli standardizzati può aiutarci a rispondere a domande sulla biodistribuzione dei farmaci, nonché a esplorare i meccanismi alla base di eventuali segnali di sicurezza che potremmo osservare. In futuro, testeremo l'applicabilità del nostro protocollo per altre applicazioni a valle, come ATAC-seq o multiomica.
Cercheremo anche di stabilire protocolli per rilevare transgeni viralmente espressi in singoli nuclei.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo standardizzato e parzialmente automatizzato per l'estrazione di nuclei di alta qualità da tessuti mammiferi congelati, con l'obiettivo di migliorare l'efficacia e l'affidabilità del sequenziamento dell'RNA a livello di singolo nucleo. Il protocollo contribuisce a potenziare gli studi sulla scoperta di farmaci riducendo la variabilità non biologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Sequenziamento dell'RNA da singolo nucleo
- Studi sulla scoperta di farmaci
- Isolamento di nuclei di alta qualità
Sfondo
- Sviluppo di protocolli standardizzati per l'estrazione dei nuclei
- Concentrazione su campioni di tessuto fresco congelato provenienti da diversi organi
- Obiettivo di affrontare la biodistribuzione dei farmaci e i segnali di sicurezza
Metodi Utilizzati
- Estrazione parzialmente automatizzata dei nuclei mediante un dissociazione robotico
- Tessuti di mammiferi provenienti da diverse specie
- Applicazione della purificazione con gradiente di saccarosio
Risultati principali
- Nuclei di alta qualità ottenuti senza segni di detriti o aggregazioni
- Risultati coerenti tra diversi tipi di tessuto
- Bassa variabilità tecnica e proporzioni cellulari simili tra i campioni
Conclusioni
- Lo studio automatizza e standardizza con successo l'estrazione dei nuclei.
- Questo protocollo può contribuire in modo significativo a rispondere a domande biologiche nella scoperta di farmaci e nelle valutazioni di sicurezza.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'isolamento standardizzato di nuclei singoli da tessuti congelati consente un'analisi trascrittomica robusta nella scoperta di farmaci, supportando indagini sia sull'efficacia che sulla sicurezza. Minimizzando la variabilità non biologica attraverso una parziale automazione, questo protocollo aumenta la fiducia predittiva nel sequenziamento dell'RNA da singolo nucleo nelle analisi successive. La sua adattabilità a diversi tipi di tessuto lo rende una capacità riutilizzabile per la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi a livello di intero portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Scoperta e Validazione del Target
- Permette l'analisi del meccanismo d'azione dei farmaci e dell'espressione genica specifica per tessuto in campioni difficili da dissociare o in campioni archiviati.
- Riduce la variabilità tecnica, favorendo la validazione funzionale delle target e la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Facilita la generazione di dati riproducibili per la selezione ipotesi-guidata del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sospensioni di nuclei di alta qualità adatte a protocolli standardizzati di sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo.
- Permette la riproducibilità del saggio e la coerenza dei risultati quantitativi su diversi tipi di tessuto e specie.
- Consente una lavorazione scalabile e parzialmente automatizzata dei campioni per una valutazione affidabile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea all'analisi dei tessuti rilevanti per la malattia per la scoperta traslazionale di biomarcatori quando si utilizzano campioni congelati o di archivio.
- Mantiene la continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, supportando studi su multi-tessuti e multi-specie.
- Fornisce una base per future applicazioni di multi-omica e ATAC-seq, come indicato nella prospettiva del protocollo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica, consentendo un'analisi trascrittoma ad alta fedeltà da tessuti congelati per l'identificazione di composti promettenti e studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la trascrittomica a singolo nucleo da diversi tessuti.
- Screening: Fornisce preparazioni quantitative e riproducibili di nuclei per saggi di sequenziamento successivi.
- Analisi: Offre output standardizzati come conteggi genici, conteggi UMI e contenuto mitocondriale per il confronto tra campioni.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'analisi della biodistribuzione dei farmaci e dei segnali di sicurezza in tessuti rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo ampiamente adattabile a diversi tipi di tessuto e specie, supportando studi su tutta la linea di prodotti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi trascrittomica.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e l'automazione parziale dei flussi di lavoro di isolamento dei nuclei.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale riducendo la variabilità tecnica.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione aggiustata per il rischio dei candidati farmaceutici sulla base di dati molecolari solidi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nell'isolamento dei nuclei e nei flussi di lavoro successivi di sequenziamento.
- Necessita dell'accesso a un dissociatore robotico, a un contatore cellulare fluorescente automatico e a infrastrutture standard di biologia molecolare.
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità tra studi e siti.
- Adattabile a vari tessuti di mammiferi con minima ottimizzazione, come dimostrato in diverse specie.
- Le possibili limitazioni includono la necessità di aggiustamenti del protocollo per tessuti non standard o per future applicazioni di multiomica.
