Name: Piattaforma per la rilevazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali basata sullimmunoistochimica e sullanalisi digitale delle immagini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri l'analisi quantitativa delle cellule immunitarie endometriali mediante immunoistochimica digitale. Questa piattaforma consente di identificare le cause di aborto ricorrente nei pazienti con alterata sensibilità endometriale.

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Gli autori sono grati a tutte le donne che hanno acconsentito e donato campioni per questo studio.

Il contenuto e il protocollo della ricerca sono stati esaminati eticamente e approvati dal comitato etico di ricerca dell'ospedale urologico di Shenzhen Zhongshan. Tutte le donne (20-40 anni) coinvolte nello studio hanno fornito il consenso informato per la raccolta e l'utilizzo del campione.
1. Acquisizione di tessuto patologico
<ol><li>Preparare gli strumenti per la raccolta dei tessuti, vale a dire righello di misurazione, pinzetta, cassetta per inclusione, carta per inclusione e cestello per tessuti.</li>
	<li>Osservare se la quantità di tessuto endometriale (più grande di un fagiolo mung), raccolta utilizzando un approccio standard con un catetere pipelle, è sufficiente.</li>
	<li>Trasferisci il tessuto endometriale dalla formalina sulla carta da inclusione con una pinzetta e misura le dimensioni del tessuto endometriale con un righello.</li>
	<li>Avvolgere il tessuto endometriale con carta da inclusione e posizionarlo in una cassetta per inclusione.</li>
	<li>Posizionare la cassetta di inclusione nel cestello dei tessuti per la disidratazione.</li>
</ol>2. Disidratazione dei tessuti
<ol><li>Mettere il cestello di tessuto nella camera di reazione del disidratatore (vedi Tabella dei materiali) e iniziare la procedura per la disidratazione tissutale di routine: formalina per 100 min; formalina per 100 min; 75% di alcol per 60 min; alcol all'85% per 60 min; 95% di alcol per 60 min; 100% alcol per 60 min; 100% alcol per 60 min; 100% alcol per 60 min; xilene per 35 min; xilene per 20 min; xilene per 20 min; cera per 80 min; cera per 80 min; cera per 80 min. Il processo dura circa 15 ore.</li>
	<li>Al termine della procedura di disidratazione dei tessuti, aprire la camera di reazione del disidratatore, rimuovere il cestello di tessuto.</li>
</ol>3. Inclusione dei tessuti
<ol><li>Estrarre uno stampo da incasso adatto in base alle dimensioni del campione e riempire con cera di paraffina a 70 ° C.</li>
	<li>Posizionare rapidamente il tessuto nello stampo e regolare con cura in modo che il tessuto si trovi al centro dello stampo.</li>
	<li>Spostare lo stampo senza intoppi sulla piastra di raffreddamento e premere delicatamente il tessuto mentre la paraffina sul fondo si solidifica.</li>
	<li>Metti la cassetta di inclusione sopra lo stampo e riempi con altra cera.</li>
	<li>Posizionare lo stampo sulla piastra di raffreddamento e, quando la paraffina è completamente solidificata, rimuovere il blocco con la cassetta attaccata lontano dallo stampo.</li>
</ol>4. Sezioni di tessuto
<ol><li>Inserire il blocco sulla clip del campione del microtomo, posizionare la lama nel supporto, regolare l'angolo tra il piano del blocco e la lama, regolare lo spessore della sezione a 4 μm, ruotare il volantino e iniziare l'affettatura.</li>
	<li>Esporre la superficie del tessuto appropriata tagliando alcune sezioni sottili dal blocco. Estrarre le sezioni continue e complete con il pennello.</li>
	<li>Quando un numero sufficiente di sezioni è stato tagliato, smettere di girare il volantino, rimuovere le sezioni non qualificate all'estremità anteriore con una pinzetta e far galleggiare le sezioni sulla superficie di acqua a 42 °C a bagnomaria con pinzette e pennello.</li>
	<li>Dopo che le sezioni sono completamente appiattite, prelevare le sezioni su vetrini antidistacco e trasferirle in uno scaldino a 65 °C per cuocere per 60 min.</li>
	<li>Al termine della cottura, estrarre i vetrini dallo scaldavetrini.</li>
</ol>5. Colorazione immunoistochimica
<ol><li>Diluire l'anticorpo primario in una soluzione di lavoro con diluente anticorpale. Vedere la Tabella 1 per i dettagli.</li>
	<li>Mettere la soluzione anticorpale diluita in uno speciale flacone di reagenti e il kit di rilevamento nello scomparto dei reagenti di uno strumento di colorazione automatico IHC (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare i vetrini su un supporto per vetrini, coperto da un'apposita coprente, e inserirli nel vano di reazione sperimentale dello strumento.</li>
	<li>Dopo che lo strumento ha riconosciuto automaticamente il reagente e le informazioni sperimentali sul vetrino, fare clic sul pulsante Start per avviare la colorazione immunoistochimica. L'esperimento dura circa 3 ore.</li>
</ol>6. Disidratazione e sigillatura del vetrino
<ol><li>Dopo la colorazione immunoistochimica, estrarre il supporto per vetrini, rimuovere la speciale piastrella di copertura, inserire il vetrino colorato nel supporto per vetrini e lavare via il colorante rimanente sul vetrino con acqua pulita.</li>
	<li>Trasferire il portavetrini su un montavetrini automatizzato (vedi Tabella dei materiali), selezionare ed eseguire la procedura di disidratazione e sigillatura.</li>
	<li>Estrarre i vetrini dopo la disidratazione e la sigillatura.</li>
</ol>7. Scansione del vetrino
<ol><li>Posizionare i vetrini sul rack per vetrini dello scanner di immagini patologiche panoramiche (vedere Tabella dei materiali) e posizionarlo nello scomparto di scansione dei vetrini dello strumento per la scansione di immagini patologiche panoramiche. La scansione richiede 2 minuti. Vedere la Figura 1.</li>
</ol>8. Analisi delle immagini
<ol><li>Importa immagine<ol><li>Aprire il software di analisi delle immagini patologiche (vedi Tabella dei materiali) e creare una nuova cartella. Importare immagini immunoistochimiche da analizzare.</li>
	</ol></li>
	<li>Costruire un classificatore di tessuti<ol><li>Contrassegnare diversi tessuti e l'annotazione vuota per addestrare e stabilire un classificatore per identificare rispettivamente il tessuto e l'area vuota.</li>
		<li>Utilizza l'ottimizzazione in tempo reale per osservare la capacità di riconoscimento del software in tempo reale durante l'annotazione dei segni. Se il riconoscimento non è tempestivo, annotare l'annotazione e addestrarsi di nuovo fino a quando il riconoscimento del tessuto non è accurato.</li>
	</ol></li>
	<li>Algoritmo di analisi della build<ol><li>Selezionare l'algoritmo standard nel software in base al tipo di esperimento: multiplex IHC.</li>
		<li>Impostare i parametri di colore del riconoscimento delle celle selezionando i pixel negativi e positivi tipici. Su questa base, imposta i parametri di nucleo, citoplasma e membrana cellulare e osserva la situazione di riconoscimento cellulare in tempo reale fino a quando non sono stati trovati i parametri più adatti per l'immagine.</li>
		<li>Impostare la soglia positiva di riconoscimento delle celle e osservare la situazione di riconoscimento in tempo reale fino a quando non viene regolata la soglia appropriata.</li>
		<li>Selezionare il classificatore di tessuti nell'algoritmo e controllare la parte di tessuto nel classificatore di tessuti, in modo da identificare le cellule sulla base dei tessuti. A questo punto, la creazione di un algoritmo di analisi è completata.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'analisi delle immagini<ol><li>Selezionate l'area di analisi. Usa l'algoritmo stabilito per analizzare le immagini.</li>
	</ol></li>
	<li>Al termine dell'analisi del software, verificare manualmente se il riconoscimento dell'immagine è accurato, incluso il riconoscimento dei tessuti, il riconoscimento delle cellule negative e positive.</li>
	<li>Se il riconoscimento dell'immagine non è accurato, regolare nuovamente l'algoritmo e la soglia dei parametri ed eseguire nuovamente l'analisi dell'immagine fino a quando non ha esito positivo. Esportare i risultati dell'analisi. Vedere la Figura 1.</li>
	<li>Anche altre cellule immunitarie possono essere analizzate in base ai passaggi precedenti (vedi Figura 1). Impostare diversi parametri di analisi in base all'effettiva espressione di diversi marcatori immunitari endometriali (cellule CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrofagi CD68+, macrofagi CD163+M2, CD1a+DC e cellule CD8+T25,26).</li>
	<li>Attraverso il calcolo del software, ottenere la proporzione di cellule immunitarie endometriali (vedi Tabella 2). Usalo per valutare i livelli di varie cellule immunitarie nell'endometrio di pazienti con aborto spontaneo ricorrente.</li>
</ol>

Analisi delle immagini del tessuto endometriale colorato immunoistochimicamente

<ol><li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss%3A+a+committee+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li>
<li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98(2020).</li>
<li>Kavvadas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Evaluation+of+CD3%2C+CD4%2C+CD8%2C+and+CD20+in+Decidual+and+Trophoblastic+Tissue+Specimens+of+Patients+with+Recurrent+Pregnancy+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss.</a> 12 (2), 177-193 (2022).</li>
<li>Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexplained+repeated+pregnancy+loss+and+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Obstetrics%2C+Gynecology%2C+and+Reproductive+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells.</a> European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).</li>
<li>Du, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+percentage+of+CD3%28%2B%29T+cells+and+pregnancy+outcome+in+women+with+recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss.</a> Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).</li>
<li>Faas, M. M., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells+and+macrophages+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells and macrophages in pregnancy.</a> Placenta. 56, 44-52 (2017).</li>
<li>Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variety+of+opportunities+for+immune+interactions+during+trophoblast+development+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).</li>
<li>Meyer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chymase-producing+cells+of+the+innate+immune+system+are+required+for+decidual+vascular+remodeling+and+fetal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth.</a> Scientific Reports. 7, 45106(2017).</li>
<li>Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+immune+cell+involvement+in+decidual+spiral+arteriole+remodeling+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).</li>
<li>Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+CD56%2B+natural+killer+cells+in+women+with+recurrent+miscarriage%3A+a+histomorphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study.</a> Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+uterine+natural+killer+cell+percentage+in+the+periimplantation+endometrium+from+fertile+women+and+women+with+recurrent+reproductive+failure%3A+establishment+of+a+reference+range%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).</li>
<li>Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells+in+peri-implantation+endometrium+from+women+with+repeated+implantation+failure+after+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF.</a> Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).</li>
<li>Laird, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+immune+cells+and+molecules+in+women+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).</li>
<li>Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+miscarriages+and+the+association+with+regulatory+T+cells%3B+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review.</a> Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105(2020).</li>
<li>Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endometrial+immune+environment+of+women+with+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The endometrial immune environment of women with endometriosis.</a> Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).</li>
<li>Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Function+and+Composition+Changes+of+Immune+Cells+During+Normal+and+Pathological+Pregnancy+at+the+Maternal-Fetal+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2317(2019).</li>
<li>Hey-Cunningham, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+utilizing+flow+cytometry+and+immunohistochemistry+reveals+inflammatory+changes+in+local+endometrial+and+systemic+dendritic+cell+populations+in+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis.</a> Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Immune+Infiltration+in+Endometriosis+and+Their+Relationship+to+r-AFS+Stages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages.</a> Frontiers in Genetics. 12, 631715(2021).</li>
<li>Attems, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+consensus+criteria+for+the+evaluation+of+Lewy+pathology+in+post-mortem+brains%3A+a+multi-centre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologic%22%5BJournal%5D)">Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study.</a> Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+Assessment+of+Aging-Related+Tau+Astrogliopathy+%28ARTAG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG).</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).</li>
<li>Modis, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+changes+in+corneal+opacification+vary+depending+on+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology.</a> Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+immunohistochemistry+method+for+precise+protein+measurements+directly+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+specimens%3A+analytical+performance+measuring+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2.</a> Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).</li>
<li>Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Immunohistochemistry+and+Digital+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).</li>
<li>Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Immune+Cells+in+Recurrent+Spontaneous+Abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion.</a> Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).</li>
<li>Diao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+endometrial+immune+cell-based+score+%28EI-score%29+for+the+prediction+of+implantation+success+for+patients+undergoing+IVF%2FICSI%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI.</a> Placenta. 99, 180-188 (2020).</li>
<li>Hewitt, S. C., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology.+A+hand+to+support+the+implantation+window%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell biology. A hand to support the implantation window.</a> Science. 331 (6019), 863-864 (2011).</li>
<li>Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chorionic+gonadotropin+and+Notch1+in+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communication+%28London%2CEngland%29%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Algars, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+and+location+of+tumor-infiltrating+macrophages+and+lymphatic+vessels+predict+survival+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients.</a> International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).</li>
<li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li>
<li>Ascierto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Mechanisms+of+Resistance+to+Anti-PD-1+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).</li>
<li>O'Rourke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+peripherally+infused+EGFRvIII-directed+CAR+T+cells+mediates+antigen+loss+and+induces+adaptive+resistance+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma.</a> Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984(2017).</li>
<li>Canesin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+WNT5A-mimicking+peptide+Foxy-5+effectively+reduces+the+metastatic+spread+of+WNT5A-low+prostate+cancer+cells+in+an+orthotopic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model.</a> PLoS One. 12 (9), e0184418(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo ha stabilito una piattaforma digitale di analisi delle immagini immunoistochimiche per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali delle pazienti RM. Qui, sono stati rilevati sei marcatori immunitari endometriali per valutare il microambiente immunitario endometriale nelle pazienti con RM.
Un endometrio ricettivo durante la fase luteale media è fondamentale per il successo dell'impianto e della gravidanza27,28<sup class=...

L'aborto spontaneo ricorrente (RM) è la perdita di due o più gravidanze consecutive ed è una malattia complessa che ha attirato l'attenzione dei medici negli ultimi anni. Il tasso di incidenza della RM nelle donne in età fertile è dell'1%-5% 1. I risultati di studi precedenti mostrano che i fattori immunitari sono strettamente associati alla patogenesi di RM 2,3,4,5. Il mantenimento dell'omeostasi immunitaria all'interfaccia materno-fetale è necessario per l'impianto e lo sviluppo dell'embrione. Le cellule immunitarie dell'endometrio svolgono diversi ruoli regolatori per mantenere questa omeostasi, come promuovere l'invasione del trofoblasto, rimodellare le arterie spirali e contribuire allo sviluppo della placenta 6,7,8,9.
In precedenza sono state segnalate cellule immunitarie endometriali aberranti nelle donne con RM. I risultati mostrano una stretta associazione tra l'alta densità di cellule natural killer uterine (uNK) e la presenza di RM10,11,12. Un aumento del numero di macrofagi è stato riportato nell'endometrio delle donne con RM, rispetto a quelle che hanno avuto un parto vivo13. Le cellule T regolatorie (Treg) svolgono un ruolo nella tolleranza immunitaria materna nei confronti dell'embrione e il loro livello e la loro funzione sono diminuiti nella decidua dei pazienti con RM14. Anche le cellule T di citotossicità (CTL) e le cellule dendritiche (DC) svolgono un ruolo nella regolazione immunitaria della gravidanza15,16. Pertanto, un'analisi quantitativa completa delle cellule immunitarie endometriali locali durante la fase medio-luteale potrebbe aiutare a comprendere meglio la patogenesi della RM. Alcuni metodi attuali per l'analisi quantitativa delle cellule immunitarie endometriali utilizzano la citometria a flusso che può marcare con precisione le cellule immunitarie con più marcatori17,18. Tuttavia, l'applicazione clinica della citometria a flusso è limitata perché può essere eseguita solo su tessuto fresco. L'ottenimento di tessuto fresco è possibile solo quando è disponibile un grande volume di tumore in eccesso, un evento raro per l'endometrio. L'immunoistochimica può osservare bene la morfologia dei tessuti in situ e può anche marcare varie cellule immunitarie, mentre le tecniche immunoistochimiche tradizionali non possono eseguire analisi quantitative delle cellule immunitarie.
Rispetto agli esperimenti di immunoistochimica convenzionali, l'analisi immunoistochimica quantitativa delle cellule immunitarie nell'endometrio ha un importante significato clinico. Il punteggio dell'intensità IHC è solitamente classificato su una scala a quattro punti o forte e debole nella diagnostica e nella ricerca patologica 19,20,21. Tuttavia, questa tecnica semi-quantitativa è soggettiva, altamente imprecisa e dimostra una significativa variabilità intra-osservatore e inter-osservatore22. Una possibile soluzione è l'applicazione dell'apprendimento automatico, che è prezioso nell'analisi digitaledelle immagini 23,24. Fornendo misurazioni quantitative, questo approccio consente una valutazione più precisa dell'infiltrazione, della distribuzione e della densità delle cellule immunitarie all'interno del tessuto uterino. Queste informazioni quantitative possono aiutare a chiarire i cambiamenti dinamici nelle popolazioni di cellule immunitarie durante il ciclo mestruale e in varie condizioni patologiche. Nel complesso, la capacità di analizzare quantitativamente le cellule immunitarie nell'endometrio attraverso l'immunoistochimica offre preziose informazioni sul microambiente immunitario dell'utero.
Pertanto, il protocollo mirava a sviluppare e convalidare una piattaforma di analisi delle immagini di immunoistochimica digitale per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie dell'endometrio, comprese le cellule uNK, le Treg, i macrofagi, le DC e le cellule T citotossiche durante la fase luteale media nelle pazienti con RM.

<table><tbody><tr><td>Vetrino coprioggetti automatizzato</td><td>Sakuraus</td><td>DRS-Prisma-P-JCS& Film-JC2</td><td></td></tr><tr><td>CD163</td><td>GrowGn Biotechnology</td><td>NCL-L-CD163</td><td></td></tr><tr><td>CD1a</td><td>Gene Tech</td><td>GM357129</td><td></td></tr><tr><td>CD56</td><td>Gene Tech</td><td>GT200529</td><td></td></tr><tr><td>CD8</td><td>Novocastra</td><td>NCL-L-CD8-4B11</td><td></td></tr><tr><td>Disidratatore</td><td>Thermo Fisher</td><td>Excelsior ES</td><td></td></tr><tr><td>Patologia digitale e</td><td>laboratori Indica</td><td>HALO</td><td></td></tr><tr><td>Coloratore biologico Foxp3</td><td>YILIFANG</td><td>14-477-82</td><td></td></tr><tr><td>IHC</td><td>Leica</td><td>BOND III</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma di analisi delle immagini</td><td>Indica labs</td><td>HALO</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Olympus life science</td><td>VS200</td><td></td></tr></tbody></table>

piattaforma per la rilevazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali basata sull'immunoistochimica e sull'analisi digitale delle immagini

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

Per valutare il microambiente immunitario endometriale delle pazienti con aborto spontaneo ricorrente (RM), è stata sviluppata e convalidata una piattaforma di analisi delle immagini di immunoistochimica digitale per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali durante la fase luteale media. Tutti i campioni di endometrio sono stati raccolti durante la fase luteale media del ciclo mestruale. I tessuti endometriali inclusi in paraffina sono stati sezionati in vetrini spessi 4 μm ed è stata eseguita la colorazione immunoistochimica (IHC) per rilevare le cellule immunitarie dell'endometrio, comprese le cellule uNK CD56+, le Treg Foxp3+, i macrofagi CD163+ M2, le DC CD1a+ e le cellule T CD8+. I vetrini panoramici sono stati scansionati utilizzando uno scanner digitale per diapositive e per l'analisi quantitativa è stato utilizzato un sistema commerciale di analisi delle immagini. La percentuale di cellule immunitarie endometriali è stata calcolata dividendo il numero di cellule immunitarie nelle cellule endometriali totali. Utilizzando il sistema di analisi delle immagini commerciale, la valutazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali, che sono difficili o impossibili da analizzare con l'analisi convenzionale delle immagini, potrebbe essere analizzata facilmente e accuratamente. Questa metodologia può essere applicata per caratterizzare quantitativamente il microambiente endometriale, compresa l'interazione tra le cellule immunitarie, e la sua eterogeneità per le diverse pazienti con insufficienza riproduttiva. La piattaforma per la valutazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali può essere di importante importanza clinica per la diagnosi e il trattamento delle pazienti con RM.

Al fine di valutare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali e ridurre l'instabilità causata da errori operativi causati dall'uomo, abbiamo creato una piattaforma di analisi quantitativa digitale per le cellule immunitarie endometriali utilizzando il rilevamento immunoistochimico automatico e il sistema di valutazione quantitativa digitale. La piattaforma di analisi delle immagini immunoistochimiche è stata istituita per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali di pazienti con aborto ...

Qui, è stata sviluppata e convalidata una piattaforma digitale di analisi delle immagini immunoistochimiche per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali di pazienti con aborti spontanei ricorrenti nella finestra di impianto.

Piattaforma per la rilevazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali basata sull'immunoistochimica e sull'analisi digitale delle immagini

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

Attualmente, è difficile stabilizzare l'analisi entro un certo intervallo. È anche difficile mantenere il controllo di qualità dell'esperimento. La nostra ricerca può aiutare le pazienti con sensibilità endometriale anormale in immune a trovare la causa del fallimento riproduttivo.La proporzione locale di cellule immunitarie nell'endometrio può essere rilevata in modo stabile e ripetuto. I nostri risultati possono promuovere il progresso della ricerca sulla valutazione della sensibilità endometriale in pazienti con ripetuti fallimenti di impianto.

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Visualizzazione, quantificazione e mappatura delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente tumorale

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Piattaforma per la rilevazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali basata sullimmunoistochimica e sullanalisi digitale delle immagini (Video) | JoVE Journal

Piattaforma per la rilevazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali basata sull'immunoistochimica e sull'analisi digitale delle immagini

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