Preparazione del campione per la criotomografia in situ di cellule di mammifero
15 dicembre 2023
Questo metodo fornisce un protocollo accessibile e flessibile per la preparazione di griglie di microscopia elettronica (EM) per la criotografia cellulare in situ e la microscopia ottica ed elettronica correlata (CLEM).
Lo scopo di questa ricerca è quello di sviluppare una metodologia per la preparazione dei campioni che sia accessibile e riproducibile in modo affidabile. Raggiungendo questo obiettivo, la potenza della tomografia crioelettronica cellulare diretta può essere utilizzata per rispondere a un'ampia varietà di domande biologiche. Le sfide della preparazione della rete sono enormi.
Le cellule non si attaccano facilmente alle griglie e la manipolazione può causare danni allo strato di carbonio, con conseguente perdita di aree della griglia visualizzabili. Inoltre, la prevalenza di sottili protrusioni cellulari viene ridotta senza prestare attenzione alle corrette condizioni di preparazione del campione. I protocolli attuali richiedono in genere attrezzature specializzate per risolvere i principali colli di bottiglia della semina, come il micro patterning e i supporti stampati in 3D per l'attacco e la manipolazione delle cellule, rispettivamente.
Questo protocollo fornisce soluzioni con una maggiore accessibilità, pur mantenendo la flessibilità per questi strumenti specializzati da utilizzare per le applicazioni a valle.
Panoramica
Questo metodo fornisce un protocollo accessibile e flessibile per la preparazione di griglie per microscopia elettronica (EM) destinate alla crio-tomografia cellulare in situ e alla microscopia correlative tra luce ed elettroni (CLEM). Il protocollo affronta le sfide legate alla preparazione delle griglie, garantendo l'adesione cellulare e riducendo al minimo i danni allo strato di carbonio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Microscopia elettronica
Sfondo
- La tomografia crioelettronica cellulare diretta è uno strumento potente per la ricerca biologica.
- La preparazione della griglia è fondamentale per un'immagine e un'analisi di successo.
- I metodi attuali spesso richiedono attrezzature specializzate, limitando l'accessibilità.
- Questo protocollo mira a semplificare il processo mantenendo al contempo la flessibilità.
Scopo dello studio
- Sviluppare una metodologia riproducibile e accessibile per la preparazione delle griglie per microscopia elettronica.
- Migliorare l'usabilità della tomografia crioelettronica negli studi biologici.
- Affrontare le sfide comuni nell'adesione cellulare e nell'integrità della griglia.
Metodi Utilizzati
- Trattamento con scarica al plasma delle griglie per migliorare l'adesione cellulare.
- Applicazione di fibronectina bovina per favorire l'attacco cellulare.
- Seeding cellulare e procedure di trasfezione per cloni molecolari di HIV.
- Immersione rapida in azoto liquido delle griglie per l'analisi mediante tomografia crioelettronica.
Risultati principali
- Allegamento riuscito delle cellule alle griglie di microscopia elettronica con danni minimi.
- Osservazione di cellule produttrici di HIV mediante microscopia criogenica correlativa.
- Preservazione efficace dell'integrità della griglia durante il processo di preparazione.
- Dimostrazione della riproducibilità del protocollo in più prove sperimentali.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora l'accessibilità per la preparazione delle griglie per microscopia elettronica.
- Permette lo studio efficace dei processi cellulari mediante tomografia elettronica criogenica.
- Applicazioni future potranno sfruttare questo metodo per svariate indagini biologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Una preparazione robusta del campione per la criotomografia in situ di cellule di mammifero è fondamentale per consentire studi strutturali ad alta risoluzione in contesti cellulari nativi. Questo protocollo affronta i principali colli di bottiglia nella manipolazione delle griglie, nell'adesione cellulare e nella riproducibilità, influenzando direttamente l'affidabilità delle analisi di imaging e integrate a valle. Una maggiore accessibilità e standardizzazione nella preparazione del campione migliora la fiducia predittiva e il processo decisionale nei progetti di ricerca preclinica e traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente la visualizzazione diretta dell'ultrastruttura cellulare per la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio preservando l'ambiente cellulare nativo.
- Facilita l'indagine guidata da ipotesi sugli assemblaggi molecolari in situ.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni biologici validati per flussi di lavoro di imaging correlative.
- Standardizza la preparazione delle griglie per garantire riproducibilità e risultati quantitativi nell'imaging.
- Migliora la prontezza per screening ad alto contenuto e piattaforme di microscopia integrativa.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli output di imaging a modelli cellulari rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Consente la valutazione strutturale delle interazioni virali e cellulari in sistemi preclinici.
- Supporta un avanzamento proporzionato al rischio fornendo dati morfologici ad alta fedeltà.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di preparazione del campione si integra nell'interfaccia tra biologia della scoperta e imaging avanzato, supportando flussi di lavoro che vanno da studi meccanicistici iniziali alla validazione di modelli preclinici.
- Biologia della scoperta: Fornisce una preparazione del campione riproducibile per la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici.
- Screening: Offre griglie standardizzate di alta qualità per l'analisi quantitativa e lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Permette l'acquisizione di dati strutturali robusti per analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega la ricerca di base e la ricerca preclinica mantenendo il contesto cellulare negli output delle immagini.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo flessibile e accessibile, adattabile a diversi tipi cellulari e modalità di imaging.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nella validazione strutturale dei bersagli.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità, la standardizzazione e la scalabilità dei flussi di lavoro di preparazione dei campioni.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale riducendo i fallimenti nell'imaging.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione dei bersagli validati strutturalmente in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nella manipolazione delle griglie e nelle tecniche di microscopia.
- Necessita dell'accesso a dispositivi per la scarica al plasma, armadi a flusso laminare e strumentazione per la congelazione rapida.
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire una preparazione riproducibile delle griglie e una qualità costante delle immagini.
- Adattabile a diversi tipi di cellule mammifere aderenti, con modifiche al protocollo secondo necessità.
- La fragilità delle griglie e la loro manipolazione rappresentano limitazioni pratiche che richiedono una gestione accurata.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
