Preparazione del campione per la criotomografia in situ di cellule di mammifero
December 15th, 2023
Questo metodo fornisce un protocollo accessibile e flessibile per la preparazione di griglie di microscopia elettronica (EM) per la criotografia cellulare in situ e la microscopia ottica ed elettronica correlata (CLEM).
Lo scopo di questa ricerca è quello di sviluppare una metodologia per la preparazione dei campioni che sia accessibile e riproducibile in modo affidabile. Raggiungendo questo obiettivo, la potenza della tomografia crioelettronica cellulare diretta può essere utilizzata per rispondere a un'ampia varietà di domande biologiche. Le sfide della preparazione della rete sono enormi.
Le cellule non si attaccano facilmente alle griglie e la manipolazione può causare danni allo strato di carbonio, con conseguente perdita di aree della griglia visualizzabili. Inoltre, la prevalenza di sottili protrusioni cellulari viene ridotta senza prestare attenzione alle corrette condizioni di preparazione del campione. I protocolli attuali richiedono in genere attrezzature specializzate per risolvere i principali colli di bottiglia della semina, come il micro patterning e i supporti stampati in 3D per l'attacco e la manipolazione delle cellule, rispettivamente.
Questo protocollo fornisce soluzioni con una maggiore accessibilità, pur mantenendo la flessibilità per questi strumenti specializzati da utilizzare per le applicazioni a valle.
Panoramica
Questo metodo fornisce un protocollo accessibile e flessibile per la preparazione di griglie per microscopia elettronica (EM) per la criotomografìa cellulare in situ e la microscopia elettronica e ottica correlativa (CLEM). Il protocollo affronta le sfide nella preparazione delle griglie, assicurando l'adesione cellulare e minimizzando i danni allo strato di carbonio.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Microscopia elettronica
Sfondo
- La criotomografìa elettronica cellulare diretta è uno strumento potente per la ricerca biologica.
- La preparazione delle griglie è critica per l'imaging e l'analisi di successo.
- I metodi attuali spesso richiedono attrezzature specializzate, limitando l'accessibilità.
- Questo protocollo mira a semplificare il processo mantenendo la flessibilità.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una metodologia riproducibile e accessibile per la preparazione delle griglie EM.
- Migliorare l'usabilità della criotomografìa elettronica negli studi biologici.
- Affrontare le sfide comuni nell'adesione cellulare e nell'integrità della griglia.
Metodi utilizzati
- Trattamento di scarica al neon delle griglie per migliorare l'adesione cellulare.
- Applicazione di fibronectina bovina per promuovere l'adesione cellulare.
- Procedure di semina cellulare e trasfezione per cloni molecolari dell'HIV.
- Congelamento rapido delle griglie per l'imaging della criotomografìa elettronica.
Risultati principali
- Adesione riuscita delle cellule alle griglie EM con danni minimi.
- Osservazione di cellule produttrici di HIV utilizzando la microscopia correlativa criogenica.
- Preservazione efficace dell'integrità della griglia durante il processo di preparazione.
- Dimostrazione della riproducibilità del protocollo in molteplici tentativi.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora l'accessibilità per la preparazione delle griglie EM.
- Consente lo studio efficace dei processi cellulari utilizzando la criotomografìa elettronica.
- Le applicazioni future possono sfruttare questo metodo per varie indagini biologiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Robust sample preparation for in situ cryotomography of mammalian cells is critical for enabling high-resolution structural studies in native cellular contexts. This protocol addresses key bottlenecks in grid handling, cell attachment, and reproducibility, directly impacting the reliability of downstream imaging and integrative analyses. Improved accessibility and standardization in sample preparation enhance predictive confidence and portfolio decision-making in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cellular ultrastructure for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving native cell environments.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular assemblies in situ.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for correlative imaging workflows.
- Standardizes grid preparation to ensure reproducibility and quantitative imaging outputs.
- Improves readiness for high-content screening and integrative microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables structural assessment of viral and cellular interactions in preclinical systems.
- Supports risk-adjusted advancement by providing high-fidelity morphological data.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and advanced imaging, supporting workflows from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Provides reproducible sample preparation for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, high-quality grids for quantitative imaging and assay development.
- Analytics: Enables acquisition of robust structural data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining cellular context in imaging outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a flexible, accessible protocol adaptable to diverse cell types and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in structural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of sample preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing imaging failures.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, grid handling, and microscopy techniques.
- Needs access to glow discharge devices, biosafety cabinets, and plunge-freezing instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid preparation and imaging quality.
- Adaptable to various adherent mammalian cell types with protocol modifications as needed.
- Grid fragility and manipulation remain practical limitations requiring careful handling.
