Name: Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Scopri due metodi per differenziare cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali: il metodo a monostrato e quello a corpi embrionali. Questa tecnica aiuta a generare MSC per modelli di malattie genetiche.

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Siamo estremamente grati a tutti i membri del Mao and Hu Lab, passati e presenti, per le interessanti discussioni e i grandi contributi al progetto. Siamo grati al National Clinical Research Center for Child Health per il grande supporto. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), dalla Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).

1. Mantenimento delle hiPSCs
<ol><li>Scongelamento di hiPSC<ol><li>Estrarre le celle dall'azoto liquido e scongelarle rapidamente a bagnomaria a 37 °C. Trasferire le cellule di scongelamento in una provetta da 15 mL preparata con 3 mL di terreno di mantenimento iPSC (Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente il mezzo.</li>
		<li>Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipettare le cellule su e giù 2-3 volte).</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) e 2 mL di terreno di mantenimento con 10 μM Y-27632 aggiunti in anticipo (circa 4 x 104 cellule/cm2).</li>
		<li>Coltivare le cellule per 5-6 giorni (confluenza 80%-90%) a 37 °C, 5% di CO2 con iPSC che cambiano terreno di mantenimento ogni giorno.</li>
	</ol></li>
	<li>Passaggio di hiPSC<ol><li>Rimuovere il terreno di mantenimento iPSC dalla piastra a 6 pozzetti. Lavare le hiPSC una volta con DPBS.</li>
		<li>Aggiungere 700-800 μL di soluzione di EDTA 0,48 mM e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente (RT), quindi rimuovere la soluzione di digestione. Continuare l'incubazione a 37 °C per 3-5 minuti.</li>
		<li>Quando le cellule vengono digerite in fogli (non digerire le cellule in cellule singole), aggiungere 1 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 per terminare la digestione. Pipettare con cura le cellule su e giù 2-3 volte.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) e 2 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 aggiunti in anticipo. NOTA: Il rapporto di passaggio varia da 1:6 a 1:20 (circa 4 x 104 cellule/cm2) e la dimensione media dell'aggregazione è di circa 50-200 μm.</li>
		<li>Coltivare le cellule fino all'80%-90% di confluenza (5-6 giorni) a 37 °C, 5% di CO2 con cambio di terreno di mantenimento iPSC ogni giorno.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Differenziazione delle MSC dalle hiPSC attraverso la formazione di EB
NOTA: Il metodo è derivato dalla letteratura precedente 21,22,23,24. Una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1. Le caratteristiche del metodo sono riassunte nella Tabella 1.
<ol><li>Preparazione del mezzo<ol><li>Preparare il terreno di differenziazione delle MSC integrando α-MEM con l'1% (v/v) di GlutaMAX, il 10% (v/v) di FBS, 10 ng/mL di FGF2 e 5 ng/mL di TGFβ.</li>
		<li>Preparare il terreno di mantenimento delle MSC integrando α-MEM con l'1% (v/v) di GlutMAX, il 10% (v/v) di FBS e 1 ng/mL di FGF2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di hiPSC<ol><li>Linee di colture di hiPSCs (passaggio almeno 2-3 volte dopo lo scongelamento) in terreno di mantenimento iPSC su una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) a 37 °C, 5% di CO2 fino all'80%-90% di confluenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 0: Formazione EB<ol><li>Rimuovere il terreno di mantenimento iPSC dalla piastra a 6 pozzetti. Lavare le hiPSC una volta con DPBS.</li>
		<li>Aggiungere 700-800 μL di soluzione di EDTA 0,48 mM e incubare per 1 minuto a RT, quindi rimuovere la soluzione di digestione. Continuare l'incubazione a 37 °C per 3-5 minuti.</li>
		<li>Quando le cellule vengono digerite in fogli (non digerire le cellule in singole cellule), aggiungere 2 mL di terreno di mantenimento delle iPSCs (contenente 10 μM di inibitore della roccia e 1:100 GFR- gel della matrice extracellulare) per terminare la digestione.</li>
		<li>Trasferire le cellule in una piastra di attacco bassa a 6 pozzetti. Seminare le cellule in un rapporto di 2 pozzetti di piastra di coltura tissutale e 1 pozzetto di piastra a basso attacco. Incubare le cellule in un agitatore (60 giri/min) a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore per formare EB sferici.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 1-Giorno 7: Differenziazione EB<ol><li>Trasferire gli EB nella provetta da centrifuga con una pipetta Pasteur (senza distruggere gli EB) e lasciare sedimentare naturalmente gli EB per 5-10 minuti a RT. Quindi, rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Trasferire gli EB su una piastra di attacco bassa a 6 pozzetti con 2 mL di terreno di differenziazione MSC. Coltivare gli EB sull'agitatore a 37 °C, 5% di CO2 per 7 giorni con cambio di terreno una volta.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 8-Giorno 17: Inoculazione EB<ol><li>Trasferire gli EB nella provetta da centrifuga con una pipetta Pasteur (senza distruggere gli EB) e lasciare sedimentare naturalmente per 5-10 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Trasferire gli EB in una piastra a 6 pozzetti rivestita di gel con matrice extracellulare GFR con 2 mL di terreno di mantenimento MSC. Coltura fino al 90% di confluenza (~10 giorni) con cambio regolare del terreno dopo l'adesione cellulare.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 18-Giorno 27: Maturazione ed espansione delle MSC<ol><li>Trattare la coltura derivata da EB con una soluzione di dissociazione a 37 °C per 5-10 minuti (il tempo di digestione varia a causa della presenza di diversi tipi di cellule).</li>
		<li>Quando una parte delle cellule viene digerita in singole cellule, aggiungere 2 mL del terreno di mantenimento MSC per terminare la digestione e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga. Lavare le cellule rimanenti non digerite una volta con DPBS e digerire di nuovo. Ripetere più volte fino a quando tutte le cellule sono digerite in singole cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Seminare le cellule su una piastra di coltura ricoperta di gelatina (circa 2 x 105 cellule/cm2). Coltura fino al 90% di confluenza nel terreno di mantenimento MSC con cambio regolare del terreno. Designare questa generazione di celle come passaggio 0 (P0) a questo punto.</li>
		<li>Per rendere le MSC pure e mature, continuare a far passare le cellule due volte con un rapporto di divisione di 1:3 in circa 6 giorni. La maggior parte delle cellule presenta una morfologia simile a quella dei fibroblasti (a forma di fuso).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Differenziazione delle MSC dalle hiPSC tramite coltura monostrato
NOTA: Il metodo è derivato dalla letteratura precedente 25,26,27,28. Una panoramica di questo metodo è illustrata nella Figura 1. Le caratteristiche del metodo sono riassunte nella Tabella 1.
<ol><li>Preparazione del mezzo<ol><li>Preparare il terreno di mantenimento MSC integrando α-MEM con l'1% (v/v) di GlutMAX, il 10% (v/v) di FBS e 1 ng/mL di FGF2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di hiPSC<ol><li>Linee di colture di hiPSCs (passaggio almeno 2-3 volte dopo lo scongelamento) nel terreno di mantenimento delle iPSC su una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) a 37 °C, 5% di CO2 fino al 50%-60% di confluenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 0-Giorno 13: Differenziazione mediante colture monostrato dirette<ol><li>Rimuovere il terreno di mantenimento iPSC dalla piastra a 6 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere direttamente 2 mL del terreno di mantenimento MSC e la coltura per 14 giorni a 37 °C, 5% di CO2, cambiando il terreno ogni giorno.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 14-Giorno 35: Maturazione delle MSC per passaggio ripetuto<ol><li>Trattare le colture monostrato con una soluzione di dissociazione a 37 °C per 5-10 minuti (il tempo di digestione varia a causa della presenza di diversi tipi di cellule).</li>
		<li>Quando le cellule vengono digerite in singole cellule, aggiungere 2 mL di terreno di mantenimento MSC per terminare la digestione e trasferire la sospensione cellulare nella provetta da centrifuga. Lavare le cellule rimanenti non digerite una volta con DPBS e digerire di nuovo. Ripetere più volte fino a quando tutte le cellule sono digerite in singole cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Seminare le cellule su un piatto di coltura ricoperto di gelatina (circa 2 x 105 cellule/cm2). Coltura fino al 90% di confluenza nel terreno di mantenimento MSC con cambio regolare dei terreni. Designare questa generazione di celle come passaggio 0 (P0) a questo punto.</li>
		<li>Per rendere le MSC pure e mature, continuare a far passare le cellule 6 volte con un rapporto di divisione 1:3 in circa 18 giorni. La maggior parte delle cellule presenta una morfologia simile a quella dei fibroblasti (a forma di fuso).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi degli antigeni di superficie delle MSC che guidano le hiPSC mediante citometria a flusso
NOTA: Analogamente agli antigeni di superficie delle MSC derivate dal midollo osseo, le MSC che guidano le hiPSC esprimono CD105, CD73 e CD90, ma non esprimono CD45, CD3429. Inoltre, le hiPSC possono essere utilizzate come cellule di controllo negativo. L'analisi degli antigeni di superficie delle MSC e delle hiPSC che guidano le hiPSC mediante citometria a flusso è mostrata nella Figura 2.
<ol><li>Trattare le MSC che guidano le hiPSC con una soluzione di dissociazione a 37 °C per 2-3 minuti. Trattare le hiPSC con un reagente di dissociazione EDTA 0,48 mM e incubare per 1 minuto a RT, quindi rimuovere il reagente di dissociazione. Continuare l'incubazione a 37 °C per 3-5 minuti.</li>
	<li>Quando le cellule vengono digerite in singole cellule, aggiungere il terreno (terreno di mantenimento MSC alle MSC e mezzo di mantenimento iPSC alle iPSC) per terminare la digestione.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Lavare le cellule una volta con DPBS freddo, centrifugare a 350 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Contare e risospendere le cellule in una soluzione fredda di FBS-DPBS al 10% (v/v) a 10 x 106 cellule/mL e distribuire 100 μL/provetta di sospensione cellulare (1 x 106 cellule/provetta) in provette da centrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 5 μL di soluzione bloccante il recettore Fc umano a 100 μL di sospensione cellulare. Incubare per 5-10 minuti a RT per eseguire un blocco aspecifico.</li>
	<li>Centrifugare a 350 x g per 5 min e rimuovere il surnatante. Lavare le celle due volte con una soluzione fredda di FBS-DPBS (v/v) al 2%.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 100 μL freddi di soluzione FBS-DPBS (v/v) al 2%.</li>
	<li>Aggiungere 5 μL (1 test) di anti-CD34-FITC e 5 μL (1 test) di anti-CD45-APC alla cella da 100 μL Sospensione. Aggiungere 5 μL (1 test) di anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) di anti-CD90-FITC e 5 μL (1 test) di anti-CD105-PE a un'altra provetta di sospensione cellulare da 100 μL. Aggiungere 5 μL di FITC per il controllo dell'isotipo delle IgG1 umane, PE per il controllo dell'isotipo delle IgG1 umane e APC per il controllo dell'isotipo delle IgG1 umane alla terza provetta di sospensione cellulare da 100 μL. Incubare per 15-20 minuti su ghiaccio al buio. Nel frattempo, prepara le perline monocoloranti.</li>
	<li>Lavare le celle due volte con una soluzione fredda di FBS-DPBS (v/v) al 2%.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di soluzione fredda FBS-DPBS al 2% (v/v) per risospendere le celle e filtrare tramite un filtro a rete da 200 mesh.</li>
	<li>Analizzare i campioni utilizzando la citometria a flusso. Analizzare la sospensione cellulare colorata con anticorpi di controllo isotipo e impostare il gate. Quindi analizza la sospensione cellulare colorata con anticorpi bersaglio.</li>
</ol>5. Differenziamento osteogenico delle MSC che guidano le hiPSC
NOTA: Le MSC che guidano le hiPSC possiedono un potenziale di differenziazione osteogenica (Figura 3A, B). Di seguito è riportato il protocollo per la differenziazione osteogenica.
<ol><li>Preparare il terreno di induzione osteogenico integrando α-MEM con il 10% di FBS, 100 nM di desametasone, 10 mM di beta-glicerofosfato e 100 μM di acido ascorbico.</li>
	<li>Seminare 1 x 105 MSC in una piastra a 48 pozzetti ricoperta di gelatina e coltivare fino a quando non è confluente al 60%-70%.</li>
	<li>Rimuovere il terreno e aggiungere 0,3 mL di terreno di induzione osteogenica. Coltura delle cellule in un terreno di induzione osteogenica per 14 giorni a 37 °C, 5% di CO2 , con cambio di terreno ogni 3 giorni.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo e lavare con DPBS una volta.</li>
	<li>Aggiungere 0,3 mL di PFA al 4% e incubare a RT per 30 min.</li>
	<li>Rimuovere il PFA. Sciacquare le cellule con 0,3 mL di DPBS per 10 minuti a RT e ripetere 3 volte.</li>
	<li>Rimuovere il DPBS, aggiungere 0,2 mL di soluzione colorante rossa di alizarina e incubare per 30 minuti a RT.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione colorante, sciacquare le cellule con 0,3 mL di DPBS per 10 minuti a RT e ripetere 3 volte.</li>
	<li>Osservare la colorazione della deposizione di calcio al microscopio ottico.</li>
</ol>6. Differenziamento adipogenico delle MSC che guidano le hiPSC
NOTA: Le MSC che guidano le hiPSC possiedono un potenziale di differenziazione adipogenica (Figura 3C, D). Di seguito è riportato il protocollo per la differenziazione adipogenica.
<ol><li>Preparare il terreno di induzione adipogenica integrando α-MEM con il 10% di FBS, 1 μM di desametasone, 1 μM di IBMX, 10 μg/mL di insulina e 100 μM di indometacina. Preparare il terreno adipogenico di mantenimento integrando α-MEM con il 10% di FBS e 10 μg/mL di insulina.</li>
	<li>Seminare 1 x 105 MSC in una piastra a 48 pozzetti ricoperta di gelatina e coltivare fino a quando la densità cellulare non raggiunge il 90%.</li>
	<li>Rimuovere il terreno e aggiungere 0,3 mL di terreno di induzione adipogenica. Continuare a coltivare le cellule nel terreno di induzione adipogenica per 4 giorni a 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Rimuovere il terreno e aggiungere 0,3 mL di terreno adipogenico di mantenimento. Continuare a coltivare le cellule nel terreno adipogenico di mantenimento per 3 giorni a 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Ripetere i passaggi 6.3 e 6.4 2-3 volte fino alla differenziazione e maturazione degli adipociti.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo e lavare con DPBS una volta.</li>
	<li>Aggiungere 0,3 mL di PFA al 4% e incubare a RT per 10 min. Rimuovere il PFA e risciacquare 2 volte con DPBS.</li>
	<li>Applicare la colorazione Oli Red O secondo le istruzioni del produttore e osservare le goccioline lipidiche al microscopio ottico.</li>
</ol>7. Differenziamento condrogenico delle MSC che guidano le hiPSC
NOTA: Le MSC che guidano le hiPSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogenica (Figura 3E, F). Di seguito è riportato il protocollo per il differenziamento condrogenico.
<ol><li>Preparare il terreno di induzione del condroblasto integrando α-MEM con il 10% di FBS, 100 nM di desametasone, l'1% di insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 μM di acido ascorbico, 1 mM di piruvato di sodio, 50 μg/mL di prolina, 0,02 nM di fattore di crescita trasformante β3 (TGFβ3) e 0,5 μg/mL di proteina morfogenetica ossea 6 (BMP-6).</li>
	<li>Raccogliere 2,5 x 105 MSC che guidano hiPSC e centrifugare le cellule a 150 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Sospendere le cellule in 1 mL di α-MEM e poi centrifugare a 150 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in 0,5 mL di terreno di induzione condrogenico. Centrifugare le cellule a 150 x g per 5 min.</li>
	<li>Svitare direttamente il coperchio e la coltura per 21 giorni con il cambio del terreno di induzione condrogenico ogni 3 giorni a 37 °C, 5% CO2 . Muovere delicatamente la provetta da centrifuga per sospendere i pellet condrogenici (senza distruggerli) ogni giorno durante la differenziazione condrogenica.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e lavare due volte con 0,5 mL di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 0,3 mL di PFA al 4% e fissare per 24 ore.</li>
	<li>La paraffina incorpora i pellet condrogenici e quindi li seziona (3 μm). Colorare le sezioni in blu di toluidina (1%) per 30 min.</li>
	<li>Osservare la matrice condrocitaria extracellulare al microscopio ottico.</li>
</ol>

Caratterizzazione degli antigeni di superficie e capacità di proliferazione nelle MSC che guidano le hiPSC

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<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+derivation+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (22), e3080(2018).</li>
<li>Hua, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+pulsed+ultrasound+promotes+osteogenic+potential+of+iPSC-derived+MSCs+but+fails+to+simplify+the+iPSC-EB-MSC+differentiation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778(2022).</li>
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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+from+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+MSCs+facilitate+cutaneous+wound+healing+by+promoting+collagen+synthesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 49(2015).</li>
<li>Hu, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+secreted+by+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+attenuate+limb+ischemia+by+promoting+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10(2015).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+retain+adequate+osteogenicity+and+chondrogenicity+but+less+adipogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144(2015).</li>
<li>Wang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+results+in+downregulation+of+c-Myc+and+DNA+replication+pathways+with+immunomodulation+toward+CD4+and+CD8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells.</a> Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Kim, S., Kim, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem-like+cells+for+producing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, sono stati esaminati due metodi rappresentativi di differenziazione delle hiPSC in MSC: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Entrambi i metodi erano in grado di derivare l...

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte derivate dal mesoderma1. Le MSC sono presenti in quasi tutti i tessuti connettivi2. Da quando le MSC sono state scoperte per la prima volta negli anni '70 e isolate con successo dal midollo osseo nel 1987 da Friedenstein et al.3,4,5, una varietà di tessuti somatici umani (inclusi fetali e adulti) sono stati utilizzati per isolare le MSC come ossa, cartilagine, tendini, muscoli, tessuto adiposo e stroma di supporto ematopoietico 1,2,6,7. Le MSC dimostrano elevate capacità proliferative e plasticità per differenziarsi in molte linee cellulari somatiche e potrebbero migrare verso tessuti danneggiati e infiammati 2,8,9. Queste proprietà rendono le MSC un potenziale candidato per la medicina rigenerativa10. Tuttavia, le MSC derivate da tessuti somatici (st-MSC) sono limitate da una donazione limitata, da una limitata capacità proliferativa cellulare, da variazioni di qualità e da preoccupazioni di biosicurezza per la possibile trasmissione di agenti patogeni, se presenti, dai donatori11,12.
Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) derivano dalla riprogrammazione di cellule adulte con fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), che hanno funzioni simili a quelle delle cellule staminali embrionali13,14. Possono auto-rinnovarsi e possedere il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellule somatiche, comprese le MSC. Rispetto alle st-MSC, le iPSC-MSC hanno il vantaggio di una fornitura illimitata, un costo inferiore, una maggiore purezza, convenienza nel controllo di qualità, facile per la produzione su larga scala e la modificazione genica 15,16,17.
A causa di questi vantaggi delle iPSC-MSC, sono stati riportati una varietà di metodi che guidano le MSC dalle iPSC. Questi metodi di differenziazione sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l'uso di colture monostrato 11,18,19,20. In questo caso, è stato caratterizzato un approccio rappresentativo per ciascuna delle due metodologie. Inoltre, sono stati effettuati confronti tra due approcci rappresentativi basati su tempo, costo, capacità proliferativa, espressione di biomarcatori MSC e capacità di differenziazione in vitro.

<table><tbody><tr><td>Kit di colorazione rosso alizarina</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>C0148S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano-CD105 (PE)</td><td>Biolegend</td><td>323206</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano-CD34 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>343503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano-CD45 (APC)</td><td>Biolegend</td><td>304011</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano-CD73 ( APC)</td><td>Biolegend</td><td>344006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano-CD90 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Solarbio</td><td>A8100</td><td></td></tr><tr><td>BMP-6</td><td>Novoprotein</td><td>C012</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore di livello di anidride carbonica</td><td>Cristallo</td><td>CO-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>Perle di compensazione</td><td>BioLegend</td><td>424601</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Tecnologia STEMCELL</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>ST1254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp; medium</td><td>Servicebio</td><td>G4610</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HAKATA</td><td>HS-FBS-500</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemcell</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo umano IgG1 APC</td><td>BioLegend</td><td>403505</td><td></td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo IgG1 umano FITC</td><td>BioLegend</td><td>403507</td><td></td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo IgG1 umano PE</td><td>BioLegend</td><td>403503</td><td></td></tr><tr><td>TGF umano-&beta; 1</td><td>Proteina staminale</td><td>78067</td><td></td></tr><tr><td>TruStain umana FcX&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>ST1398</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Solarbio</td><td>SI9020</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>P3376</td><td></td></tr><tr><td>iPSC mezzo di manutenzione</td><td>STEMCELL Technology</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>ITS Media Supplement</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>C0341-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, fattore di crescita ridotto</td><td>BD Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione Oli Red O</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>C0158S</td><td></td></tr><tr><td>Prolina</td><td>Solarbio</td><td>P0011</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3</td> Kit di colorazione blu <td>di toluidina Novoprotein</td><td>CJ44</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Solarbio</td><td>G2543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme(1x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso</td><td>Costar</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-66</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemcell</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-MEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30265</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Solarbio</td><td>G8100</td><td></td></tr></tbody></table>

confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte che sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa. Poiché le MSC derivate da tessuti somatici sono limitate da donazioni limitate, variazioni di qualità e biosicurezza, negli ultimi 10 anni si è assistito a un grande aumento degli sforzi per generare MSC da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Gli sforzi passati e recenti nella differenziazione delle hiPSC in MSC sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l'uso di colture monostrato. Questo protocollo descrive questi due metodi rappresentativi per derivare le MSC dalle hiPSC. Ogni metodo presenta i suoi vantaggi e svantaggi, tra cui il tempo, il costo, la capacità di proliferazione cellulare, l'espressione dei marcatori MSC e la loro capacità di differenziazione in vitro. Questo protocollo dimostra che entrambi i metodi possono derivare MSC mature e funzionali dalle hiPSC. Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica, mentre il metodo EB è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Seguendo il protocollo (Figura 1A), le hiPSC sono state differenziate in MSC attraverso i metodi di formazione EB e di coltura monostrato. Durante il differenziamento, le cellule hanno mostrato diverse morfologie rappresentative (Figura 1B,C).
Come mostrato nella Figura 1B, le colonie di hiPSCs mostrano una tipica morfologia compatta prima della differenziazione con un bordo chiaro compos...

Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...

Lo scopo del nostro studio è un meccanismo e una strategia terapeutica di ricerca della malattia genetica. La nostra ricerca si basa su modelli di malattia multilivello, come linee cellulari, iPSC, organoidi e topi. Le iPSC hanno un netto vantaggio rispetto ad altri modelli.Le iPSC dei pazienti e tutte le cellule e gli organoidi derivati successivi condividono lo stesso genoma con i pazienti, il che fornisce una banca di cellule e modelli di pazienti per molte malattie. Inoltre, con i metodi di iPSC consolidati dai pazienti sono abbastanza maturi. Rimangono molte sfide nella direzione della differenziazione delle iPSC in cellule e organoidi specifici, con una comprensione più approfondita dei meccanismi di sviluppo nello sviluppo attuale che si verificherà nel campo.

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In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l'uso di studi di disturbi autonomici multipli.

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Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell'ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

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Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali (Video) | JoVE Journal

Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

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