Name: Identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Scopri la tecnica MyDoBID per isolare fibre muscolari scheletriche umane liofilizzate e classificarle per isoforma MHC. Questo metodo consente l'analisi differenziale dell'espressione proteica a livello cellulare.

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Gli anticorpi contro MHC I (A4.840) e MHCIIa (A4.74) utilizzati in questo studio sono stati sviluppati dal Dr. H. M. Blau e l'anticorpo contro MHCIIx (6H1) è stato sviluppato dal Dr. C. A. Lucas e ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), grazie agli auspici del National Institute of Child Health and Human Development e mantenuto dall'Università dell'Iowa. Dipartimento di Scienze Biologiche (Iowa City, IA). Ringraziamo Victoria L. Wyckelsma per aver fornito i campioni di muscolo umano per questo studio. La maggior parte delle immagini nella Figura 1 proviene da BioRender.com.
Finanziamento: Questo studio non ha ricevuto finanziamenti esterni.

MyDoBID- Una nuova tecnica per identificare in modo efficiente i tipi di fibre muscolari

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<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
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<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Raccolta fibre Sulla base di diversi anni di esperienza, la maggior parte dei ricercatori è in grado di padroneggiare questa tecnica; Tuttavia, la pratica porta a una raccolta più rapida ed efficiente delle fibre per le analisi a valle. Per essere in grado di isolare 30 segmenti di fibra singola di una qualità per il pooling, si consiglia di raccogliere 50 segmenti di fibra per campione. Si consiglia di studiare attentamente il video di raccolta delle fibre e dopo aver eseguito due sessioni di pratica...

Il muscolo scheletrico è un tessuto eterogeneo, con distinte proprietà cellulari, metaboliche e contrattili che dipendono dal fatto che la cellula (fibra) sia a contrazione lenta (tipo I) o a contrazione rapida (tipo II). Il tipo di fibra può essere identificato esaminando le isoforme della catena pesante della miosina (MHC), che differiscono l'una dall'altra in diversi modi, tra cui il tempo di contrazione, la velocità di accorciamento e la resistenza alla fatica1. Le principali isoforme MHC includono il tipo I, il tipo IIa, il tipo IIb e il tipo IIx e i loro profili metabolici sono ossidativi (tipo I e IIa) o glicolitici (IIx, IIb)1. La proporzione di questi tipi di fibre varia nel tipo di muscolo e tra le specie. Il tipo IIb è ampiamente presente nel muscolo dei roditori. I muscoli umani non contengono fibre di tipo IIb e sono costituiti prevalentemente da fibre isoforme MHC di tipo I e IIa, con una piccola percentuale di fibre IIx2. I profili di espressione proteica variano tra i diversi tipi di fibre e possono essere alterati con l'invecchiamento3, l'esercizio fisico 4,5 e la malattia6.
La misurazione delle risposte cellulari in diversi tipi di fibre muscolari scheletriche è spesso trascurata o non è possibile a causa dell'esame degli omogenati muscolari (un mix di tutti i tipi di fibre). Il western blot a fibra singola consente l'indagine di più proteine nelle singole fibre muscolari7. Questa metodologia è stata precedentemente utilizzata per produrre caratteristiche nuove e informative della singola fibra che non era possibile ottenere utilizzando preparati omogeneizzati. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni della metodologia originale del western blot a fibra singola, tra cui la natura dispendiosa in termini di tempo, l'incapacità di generare repliche del campione e l'uso di reagenti a chemiluminescenza potenziata (ECL) costosi e sensibili. Se si utilizza tessuto fresco, questo metodo è ulteriormente limitato a causa dei vincoli di tempo dovuti alla necessità di isolare le singole fibre entro un periodo di tempo limitato (ad esempio, 1-2 ore). Fortunatamente, questa restrizione è mitigata isolando segmenti di fibra singola dal tessuto liofilizzato8. Tuttavia, la raccolta di fibre da campioni liofilizzati è limitata dalle dimensioni e dalla qualità del tessuto sottoposto a biopsia.
L'identificazione del tipo di fibra utilizzando il metodo del dot blotting9 è stata significativamente elaborata e ampliata in questo protocollo completo. In precedenza, è stato dimostrato che un minimo di ~2-10 mg di tessuto muscolare umido è adeguato per la liofilizzazione e l'analisi della proteina isoforma MHC a fibra singola9. Christensen et al.9 hanno utilizzato il 30% di un segmento di fibra di ~1 mm per rilevare l'isoforma MHC presente mediante dot blotting, che è stata confermata dal western blotting. Questo lavoro ha dimostrato che sostituendo il western blotting con il dot blotting, i costi complessivi sono stati ridotti di ~ 40 volte (per 50 segmenti di fibra). Le fibre sono state poi "raggruppate" in campioni di tipo I e di tipo II, che hanno permesso la replicazione sperimentale9. Tuttavia, una limitazione è stata che sono stati ottenuti solo due campioni specifici per tipo di fibra: di tipo I (MHCI positivo) e di tipo II (fibre MHCII positive), con campioni di tipo II contenenti una miscela di MHCIIa e MHCIIx 6,10. In particolare, il protocollo corrente dimostra come è possibile identificare le fibre pure di tipo IIx e fornisce un flusso di lavoro altamente dettagliato (riepilogato nella Figura 1), comprese le strategie di risoluzione dei problemi comuni del protocollo.

<table><tbody><tr><td>1x Tampone denaturante</td><td>Preparare secondo la ricetta</td><td>I componenti possono provenire da Sigma-Aldrich o da altre aziende distributrici di prodotti chimici</td><td>. Il tampone denaturante 1x si ottiene diluendo 3x tampone denaturante 1 su 3 v/v con 1X Tris-HCl (pH 6,8). Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>3x tampone denaturante</td><td>Produrre secondo la ricetta</td><td>I costituenti possono provenire da Sigma-Aldrich o da altri distributori chimici 3x</td><td>tampone denaturante contiene: 0,125 M Tris-HCI, 10% glicerolo, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoetanolo e 0,001% blu bromofenolo, pH 6,8. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Etanolo al 95%</td><td>N/A</td><td>L'etanolo al 100% può essere acquistato da qualsiasi azienda</td><td>Diluito al 95% con H2O ultrapuro.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> A2066</td><td>Diluire 1 su 1.000 con tampone BSA.</td></tr><tr><td>Bilance analitiche</td><td>Mettler Toledo</td><td>Numero di modello: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Potenziatore di anticorpi</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td><td>Il nome del prodotto è Miser Antibody Extender Solution NC.</td></tr><tr><td>Becher (100 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>Nome del modello: Mini Spin.</td></tr><tr><td>Tampone bloccante: 5% di latte scremato nel tampone di lavaggio.</td><td>Diploma</td><td>Store ha acquistato</td><td></td></tr><tr><td>un buffer BSA: 1 % BSA/PBST, 0,02 % NaN3</td><td>BSA: Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PBS: Laboratori Bio-Rad. NaN3 : Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaN3: S2002</td><td>Albumina sierica bovina (BSA), soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e sodio azide (NaN3). Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Leva di apertura della cassetta&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4560000</td><td>Utilizzato per aprire le cassette di gel prefabbricate.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Numero di modello: Universal hood III</td><td>Qualsiasi sistema di imaging con funzionalità di imaging su gel Stain-Free.</td></tr><tr><td>Criterion blotter</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>Include impacco di ghiaccio, vassoio di trasferimento, rullo, 2 supporti per cassette, carta da filtro, cuscinetti in schiuma e coperchio con cavi.</td></tr><tr><td>Criterion Cell (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (chemiluminescenza potenziata)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705062</td><td>Nome del prodotto: Substrato ECL occidentale Clarity Max.</td></tr><tr><td>Tampone per elettroforesi 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>Diluire 10x TGS 1 in 10 con H2O ultrapuro.</td></tr><tr><td>Carta da filtro, spessore 0,34 mm</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>Bulk formato 3 mm, confezione da 100 fogli, 315 x 335 mm.</td></tr><tr><td>Pinza per dissezione di tessuti fini</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Jeweller' S Forcipe n. 5.</td></tr><tr><td>Vassoio/coperchio piatto in plastica&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Abbastanza grande da poter essere posizionato sulla membrana. Assicurarsi che la superficie sia completamente piana.</td></tr><tr><td>Sistema di liofilizzazione</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4,5 L con tavolino per campioni a camera di vetro.</td></tr><tr><td>Congelatore -80 oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualsiasi congelatore con una temperatura costante di -80 &deg; C è adatto.</td></tr><tr><td>Releaser di gel</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>Scivolare sotto la membrana per raccogliere o spostare la membrana.</td></tr><tr><td>Matita grigia</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Software per laboratori di immagini&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>Le cifre si riferiscono alla versione del software 5.2.1, ma possono essere utilizzate altre versioni.</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Laboratori Bio-Rad</td><td>1660521</td><td>Qualsiasi incubatore che può essere impostato su 37 gradi C sarebbe sufficiente.</td></tr><tr><td>Lampada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico con pulce</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rullo a membrana&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1651279</td><td>Può essere acquistato nel pacchetto di trasferimento. Tuttavia, se questo prodotto non è disponibile, sarebbe sufficiente un tubo cilindrico con superficie liscia abbastanza lungo da rotolare sulla membrana.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga&nbsp; (0,6 ml)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IgG HRP di topo secondaria</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>IgG anti-topo di capra (H+L), RRID AB_228341. Diluire a 1 su 20.000 in tampone di blocco.</td></tr><tr><td>Topo IgM HRP secondario</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>Capra Anti-Topo IgM mu catena. Utilizzare alla stessa diluizione delle IgG di topo.</td></tr><tr><td>Anticorpo primario contro la catena pesante della miosina I (MHCI)</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>Intervallo di diluizione: da 1 su 200 a 1 su 500 in tampone BSA.</td></tr><tr><td>Anticorpo primario contro la catena pesante della miosina IIa (MHCIIa)</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>Intervallo di diluizione: da 1 su 200 a 1 su 500 in tampone BSA.</td></tr><tr><td>Anticorpo primario Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx)</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>Intervallo di diluizione: da 1 su 200 a 1 su 500 in tampone BSA.</td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa 0,45 &; micro; m&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620115</td><td>per il Western blotting.</td></tr><tr><td>Coperchio per piastre di Petri</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette in plastica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>164-5050</td><td>Nome del prodotto: Alimentatore di base.</td></tr><tr><td>Scala proteica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler Scala proteica prestabilita, da 10 a 180 kDa.</td></tr><tr><td>Membrana PVDF 0,2 & micro; m</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio HRP secondario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31460</td><td>Capra anti-Coniglio IgG (H+L), RRID AB_228341. Diluizione uguale agli anticorpi secondari di topo.</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Righello</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di strippaggio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td>Nome del prodotto: Restore Western Blot Stripping Buffer.</td></tr><tr><td>Fazzoletto (senza pelucchi)</td><td>Kimberly-Clark professional</td><td>34120</td><td>Nome del prodotto: Kimwipe.</td></tr><tr><td>Tampone di trasferimento (1x tampone Tris Glycine (TG), 20% metanolo)</td><td>TG: Bio-Rad Laboratories&nbsp; &nbsp; Metanolo: Merck</td><td>TG tampone: 1610771&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Metanolo: 1,06018</td><td>diluire 10x tampone TG con H2O ultrapuro a 1x. Aggiungere il 100% di metanolo a una concentrazione finale del 20% di metanolo. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Vassoio di trasferimento</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Gel prefabbricato ad attivazione UV</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678085</td><td>Tipo di gel: 4&ndash; 15% Criterion TGX Gel proteico senza macchie, 26 pozzetti, 15 &micro;L.</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio (1x TBST)</td><td>10x TBS: Astral Scientific&nbsp; Tween 20: Sigma</td><td>&nbsp; BIOA0027-4L</td><td>1x ricetta TBST: 10x soluzione salina tamponata Tris (TBS) viene diluita fino a 1x con H2O ultrapuro, Tween 20 viene aggiunto a una concentrazione finale dello 0,1%. Conservare il buffer a 4 °C.</td></tr><tr><td>Contenitori per il lavaggio</td><td>Sistema</td><td>Store ha acquistato</td><td>Qualsiasi contenitore tupperware, che si adatti alle dimensioni approssimative della membrana, sarebbe sufficiente.</td></tr></tbody></table>

identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

La tecnica qui descritta può essere utilizzata per identificare specifiche isoforme della catena pesante della miosina (MHC) in segmenti di singole fibre muscolari utilizzando il dot blotting, di seguito denominato rilevamento della catena pesante della miaosina mediante lotto Dot Bper l'entificazione IDdel tipo di fibra muscolare (MyDoBID). Questo protocollo descrive il processo di liofilizzazione del muscolo scheletrico umano e l'isolamento di segmenti di singole fibre muscolari. Utilizzando MyDoBID, le fibre di tipo I e II sono classificate rispettivamente con anticorpi specifici per MHCI e IIa. Le fibre classificate vengono quindi combinate in campioni specifici per ogni biopsia.
La proteina totale in ciascun campione è determinata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil-solfato (SDS-PAGE) e tecnologia gel attivata dai raggi UV. Il tipo di fibra dei campioni viene convalidato utilizzando il western blotting. Viene inoltre descritta l'importanza di eseguire la normalizzazione del carico proteico per migliorare il rilevamento della proteina bersaglio in più western blot. I vantaggi del consolidamento delle fibre classificate in campioni specifici per il tipo di fibra rispetto ai western blot a fibra singola includono la versatilità del campione, l'aumento della produttività del campione, l'investimento di tempo più breve e le misure di risparmio sui costi, il tutto mantenendo preziose informazioni specifiche sul tipo di fibra che vengono spesso trascurate utilizzando campioni muscolari omogeneizzati. Lo scopo del protocollo è quello di ottenere un'identificazione accurata ed efficiente delle fibre di tipo I e di tipo II isolate da campioni di muscolo scheletrico umano liofilizzato.
Queste singole fibre vengono successivamente combinate per creare campioni specifici per il tipo di fibra di tipo I e di tipo II. Inoltre, il protocollo è stato esteso per includere l'identificazione delle fibre di tipo IIx, utilizzando l'actina come marcatore per le fibre che erano negative per MHCI e MHCIIa, che sono confermate come fibre IIx mediante western blotting. Ogni campione specifico per tipo di fibra viene quindi utilizzato per quantificare l'espressione di varie proteine bersaglio utilizzando tecniche di western blotting.

Identificazione delle singole fibre muscolari MHCI, MHCIIa e MHCIIx mediante dot blotting Una caratteristica di MyDoBID è la categorizzazione della diversa intensità del segnale MHC e Actin in una data fibra (Figura 4A). Il tipo di fibra è stato identificato dalla presenza o dall'assenza delle isoforme MHCI e IIa (Figura 4B). Sei fibre non hanno mostrato alcun rilevamento di MHC o actina, indicando che non c'era alcuna fibra raccolta. I risul...

Questo protocollo dimostra l'isolamento di una singola fibra dal muscolo scheletrico umano liofilizzato e la classificazione del tipo di fibra in base all'isoforma della catena pesante della miosina (MHC) utilizzando la tecnica del dot blotting. I campioni di fibre MHC I e II identificati possono quindi essere ulteriormente analizzati per le differenze specifiche del tipo di fibra nell'espressione proteica utilizzando il western blotting.

Identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

La nostra ricerca si concentra sul muscolo scheletrico, che è composto da cellule con proprietà metaboliche e contrattili distintive, caratterizzate da fibre a contrazione lenta o veloce. Approfondiamo i fattori che contribuiscono a queste differenze ed esploriamo le loro implicazioni nel contesto dell'invecchiamento, dell'esercizio fisico e di varie malattie. La misurazione delle risposte cellulari in diverse fibre muscolari scheletriche è spesso trascurata o non è possibile a causa dell'esame degli omogenati muscolari.La tecnica MyDoBID ci permette di analizzare ripetutamente le differenze proteiche di tipo fibra che in precedenza erano impossibili da misurare. Questo protocollo identifica in modo accurato ed efficiente le fibre muscolari di tipo uno e di tipo due da campioni di muscolo scheletrico umano liofilizzato. Questo metodo recentemente rivisto fornisce ai ricercatori un approccio diretto per studiare le differenze proteiche nel muscolo scheletrico a livello cellulare.In particolare, facilita l'identificazione delle fibre X di tipo due, che storicamente sono state difficili da distinguere. La tecnica consente ai ricercatori di far luce su tutti i tipi di fibre, compresa l

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Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l'acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata per la biopsia del musculus tibialis anteriore che limita i danni alle fibre.

Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

Prove crescenti indicano che l'eccessiva infiltrazione di lipidi all'interno del muscolo scheletrico provoca lipotossicità e diabete. Qui, presentiamo un protocollo completo, che include l'elaborazione dei tessuti, la colorazione con Bodipy, l'acquisizione di immagini e l'analisi, per quantificare le dimensioni, la densità e la distribuzione subcellulare delle goccioline lipidiche in un modo specifico per il tipo di fibra.

Tipo di fibra e analisi subcellulare specifica del contenuto di goccioline lipidiche nel muscolo scheletrico

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Questo protocollo descrive l'isolamento delle singole fibre muscolari intate dal soleo ossidativo e l'istituzione di colture mioblastiche altamente purificate derivate da queste fibre. La procedura ottimizzata fornisce in modo affidabile circa 300–500 miofibre intatte per topo, permettendo analisi molecolari e cellulari a valle.

Saggio di isolamento a fibra singola per la valutazione del comportamento ossidativo delle miofibre

Viene presentato un protocollo per sintetizzare peptoidi con funzionalità cationica mista nella stessa sequenza (monomeri di tipo lisina e arginina). Viene anche descritto il successivo test di questi composti contro la Leishmania mexicana, i protozoi parassiti che causano la leishmaniosi cutanea.

Un metodo efficiente per la sintesi di peptoids con monomeri misto Lisina-tipo / Arginina-tipo e valutazione della loro attività anti-Leishmania

Proponiamo un protocollo per identificare gli acidi grassi senza la necessità di purificarli. Combina le informazioni sui tempi di ritenzione con gli spettri di massa di tre tipi di derivati degli acidi grassi: esteri metilici degli acidi grassi (FAME), derivati della 4,4-dimetilossazolina (DMOX) e esteri 3-piridilcarbinil (picolinil).

Identificazione di acidi grassi a<em&gt; Bacillus cereus</em

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Scopri la tecnica MyDoBID per isolare fibre muscolari scheletriche umane liofilizzate e classificarle per isoforma MHC. Questo metodo consente l'analisi differenziale dell'espressione proteica a livello cellulare.

Identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano

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