Name: Guaine di mais staccate per limaging su cellule vive dellinfezione da patogeni fungini del mais fogliare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato di inoculazione su guaine di mais staccate per studiare le interazioni tra mais e patogeni fungini come Colletotrichum graminicola. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale di tessuti non fissati, migliorando la riproducibilità dei risultati sperimentali e offrendo nuove prospettive per la gestione delle malattie nelle colture.

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Gli autori ringraziano l'USDA-NIFA per il loro sostegno finanziario (numeri di sovvenzione 2018-67013-28489 e 2020-70410-32901). Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo manoscritto sono esclusivamente quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Ringraziamo la studentessa brasiliana di Science Without Borders, Mayara de Silva, per le immagini che appaiono nella Figura 6A e nella Figura 7D. Ringraziamo anche il Dipartimento di Patologia Vegetale dell'Università del Kentucky per aver fornito l'accesso ai microscopi confocali Olympus.

NOTA: il flusso di lavoro per il metodo è illustrato nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig01.jpg"> Figura 1: Fasi del protocollo di inoculo ottimizzato utilizzando guaine fogliari di mais staccate. La preparazione della sospensione di spore, l'inoculazione della guaina fogliare e la preparazione del campione per la microscopia su cellule vive sono evidenziate rispettivamente nelle caselle verde (A), viola (B) e arancione (C). Creato con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Materiale vegetale e fungino
<ol><li>Crescita delle piante<ol><li>Coltivare piantine di mais (vedi Tabella dei materiali) in serra (14 h luce/27 °C e 10 h buio/22 °C) in contenitori SC10 (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un terreno di coltura composto da tre parti di terriccio commerciale (vedi Tabella dei materiali) e due parti di terriccio sterilizzato a vapore.</li>
		<li>Innaffia le piantine per 2 minuti con un sistema di irrigazione dall'alto una volta al giorno, al mattino.</li>
		<li>Raccogli le piantine allo stadio V2 tagliandole a livello del terreno. Lo stadio di crescita V2 viene raggiunto quando le piantine sono alte da 5 a 10 cm e hanno due foglie a collare visibili21.</li>
		<li>Avvolgere le piante con un tovagliolo di carta umido e metterle in un sacchetto di plastica per il trasporto in laboratorio per ulteriori lavorazioni.</li>
	</ol></li>
	<li>Colture fungine<ol><li>Riattivare le colture di silice fungina immagazzinate in condizioni asettiche22cospargendo circa 50 granuli di silice infestata su un terreno di agar appropriato. Per evitare cambiamenti morfologici e perdita di patogenicità, la sottocoltura ceppa non più di 3 volte dopo la riattivazione. L'agar destrosio di patate (PDA; vedi Tabella dei materiali) è usato abitualmente per la coltura di C. graminicola, mentre l'agar di farina d'avena (OA; vedi Tabella dei materiali) è usato per S. maydis.</li>
		<li>Per preparare il PDA per la coltura di ceppi fungini, sospendere 19,5 g di PDA disidratato preparato in commercio in 500 mL di acqua deionizzata (DI). Per produrre OA, far bollire 36 g di OA disidratato preparato commercialmente in acqua deionizzata per 15-30 minuti, filtrare attraverso tre strati di garza e portare il filtrato a 500 ml con acqua deionizzata. Mezzi di sterilizzazione in autoclave.</li>
		<li>Aumentare il terreno fuso e raffreddato con un antibiotico appropriato (ad es. igromicina B, geneticina) quando si lavora con ceppi trasformanti. Le concentrazioni finali di igromicina o geneticina in 500 mL di terreno sono rispettivamente di 250 μg/mL e 100 μg/mL.</li>
		<li>Incubare le colture in condizioni ottimali fino allo sviluppo di un micelio sporulante. Colletotrichum graminicola e S. maydis crescono bene a 23 °C con luce fluorescente continua e livelli di umidità ambientale. La sporulazione avviene entro 7 giorni dall'inoculazione (dai) per S. maydis o 14 dai per C. graminicola.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inoculazioni della guaina fogliare
<ol><li>Gruppo unità filtro in lana di vetro<ol><li>Utilizzare forbici o cesoie per impieghi gravosi per tagliare il tappo e a circa 0,5 mm dal fondo conico di una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Posizionare un pezzo di lana di vetro (circa 0,5 cm x 0,5 cm; vedere la tabella dei materiali) all'interno del tubo tagliato per coprire il foro centrale, come illustrato nella Figura 2.</li>
		<li>Indossare guanti durante il taglio della lana di vetro, poiché il vetro borosilicato può causare irritazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione delle rastrelliere di supporto della guaina fogliare<ol><li>Tagliare una piastra PCR a 96 pozzetti senza bordatura (vedere la Tabella dei materiali) in sei rack di supporto a due colonne (8 x 2 pozzetti) come illustrato nella Figura 3A.</li>
		<li>Capovolgere i rack a due colonne in modo che i fondi conici dei pozzetti siano rivolti verso l'alto e le parti superiori piatte rivolte verso il basso (Figura 3B).</li>
		<li>Mettere ogni supporto in una piastra di Petri di vetro contenente carta da filtro inumidita e coprirla con il coperchio (vedi Tabella dei materiali). Questa unità funziona come una piccola camera di umidità per le guaine.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dell'inoculo<ol><li>Per ciascun ceppo fungino, posizionare un'unità filtrante in lana di vetro assemblata in una provetta sterile intatta da 1,5 mL per microcentrifuga, come illustrato nella Figura 2. Quest'ultimo funge da provetta di raccolta.</li>
		<li>Etichettare i tubi.</li>
		<li>Raccogliere i conidi dalle colture sporulanti inondando prima ogni piastra con 3-4 ml di acqua deionizzata sterile. In alcuni casi può essere necessaria più acqua per produrre uno strato di liquido sulla superficie della colonia. Gli agenti bagnanti non sono necessari in questo sistema.</li>
		<li>Staccare le spore dall'agar utilizzando un pestello sterile a punta conica (vedi Tabella dei materiali) per raschiare uniformemente l'intera piastra.</li>
		<li>Applicare 1 mL di sospensione di spore su un'unità filtrante in lana di vetro in modo asettico e lasciare che le spore fluiscano per gravità nella provetta di raccolta.</li>
		<li>Centrifugare le provette di raccolta contenenti le sospensioni di spore filtrate a 3.500 x g per 5 min. Le spore devono essere pellettate sul fondo della provetta della microcentrifuga. NOTA: La centrifugazione delle spore di C. graminicola a velocità più elevate di quelle qui raccomandate comporta una significativa perdita di vitalità.</li>
		<li>Versare il liquido in un contenitore autoclavabile, aggiungere 1 ml di acqua deionizzata sterile e agitare delicatamente per risospendere le spore pellettate. Centrifugare come al punto 2.3.6.</li>
		<li>Lavare le spore 3 volte per rimuovere qualsiasi matrice conidiale che possa contenere autoinibitori che potrebbero ridurre la germinazione o la penetrazione.</li>
		<li>Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 300-500 μL di acqua deionizzata sterile per risospendere le spore per la quantificazione.</li>
		<li>Utilizzare un emocitometro al microscopio composto con un ingrandimento di 100x per determinare la concentrazione di spore. La colorazione delle spore non è necessaria prima del conteggio.</li>
		<li>Preparare una sospensione 5 x 105 spore/mL con acqua deionizzata sterile. NOTA: La sospensione di spore di C. graminicola può essere mantenuta a temperatura ambiente per non più di 4 ore prima di una rapida perdita di vitalità. La refrigerazione dei conidi non aumenta la vitalità.</li>
	</ol></li>
	<li>Inoculazioni di guaine<ol><li>Verificare le pratiche e le procedure di biosicurezza pertinenti prima di inoculare le piante con ceppi fungini.</li>
		<li>Rimuovi la guaina dalla prima foglia vera delle piantine V2 facendo scorrere una miniatura lungo il margine sovrapposto della guaina e allentala delicatamente dal germoglio. Allentare la guaina da entrambi i lati del tiro prima di provare a rimuoverlo.</li>
		<li>Tagliare le guaine fogliari recuperate in segmenti di 3-5 cm. Non è necessario disinfettare le guaine in superficie prima dell'inoculazione.</li>
		<li>Srotolare ogni segmento molto delicatamente per esporre lo strato epidermico interno (assiale).</li>
		<li>Durante la preparazione delle guaine per l'inoculazione, tenere le guaine asportate rimanenti avvolte con un tovagliolo di carta umido per evitare l'essiccazione.</li>
		<li>Posizionare 20 μL della sospensione di spore fungine sulla superficie interna al centro del pezzo di guaina, direttamente sopra la nervatura centrale, come illustrato nella Figura 4.</li>
		<li>Posizionare le guaine fogliari inoculate orizzontalmente, con la nervatura centrale posta in basso, nel supporto all'interno di una piastra di Petri di vetro contenente una carta da filtro inumidita come illustrato nella Figura 5.</li>
		<li>Ogni rack può contenere fino a sette guaine. Inoculare almeno cinque guaine per ceppo per compensare la perdita di repliche che può verificarsi durante la preparazione o l'incubazione del campione.</li>
		<li>Metti le piccole camere di umidità in una scatola trasparente rivestita con carta di germinazione inumidita (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Copri la scatola con il coperchio. Incubare la scatola a 23 °C con illuminazione continua per il tempo previsto, che dipende dal fungo e dagli stadi di sviluppo del fungo che verranno osservati. Un riassunto dell'andamento temporale delle guaine di granturco inoculate con C. graminicola è riportato nella tabella 1.</li>
		<li>Controlla ogni giorno la presenza di segni/sintomi di malattia sulle guaine e mantieni umide sia la germinazione che la carta da filtro. Le guaine fogliari possono essere conservate fino a 6 giorni senza evidente morte o degradazione delle cellule vegetali in assenza di inoculazione.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione dell'unità filtrante in lana di vetro. (A) Una pallina di lana di vetro di 0,5 cm x 0,5 cm viene posizionata all'interno della provetta per microcentrifuga 1 a cui è stato rimosso il fondo conico. (B-C) Il tubo filtrante viene quindi inserito nel tubo di microcentrifuga 2 per generare un'unità filtrante assemblata per la preparazione della sospensione di spore. Creato con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig03.jpg"> Figura 3: Metodo di taglio di una piastra PCR a 96 pozzetti senza bordatura. (A) Piastra PCR tagliata in sei rack di supporto, 8 x 2 pozzetti. Un esempio di supporto a guaina singola è raffigurato in (B). Le guaine fogliari sono disposte orizzontalmente sul supporto. Creato con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig04.jpg"> Figura 4: Metodo di inoculazione della guaina. Singola goccia di inoculo applicata direttamente sulla superficie adassiale della sezione della guaina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig05.jpg"> Figura 5: Metodo di incubazione della guaina. Guaine fogliari inoculate poste orizzontalmente in una rastrelliera di supporto all'interno di una piastra di Petri di vetro contenente carta da filtro inumidita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. Microscopia a cellule vive
<ol><li>Preparazione del campione per microscopia<ol><li>Sciacquare delicatamente i pezzi della guaina con acqua deionizzata sterile per rimuovere eventuali spore non aderenti o crescita fungina superficiale.</li>
		<li>Posizionare la guaina su un vetrino da microscopio pulito (vedere Tabella dei materiali) con la superficie adassiale (interna) del pezzo di guaina rivolta verso il basso e la superficie abassiale (esterna) rivolta verso l'alto.</li>
		<li>Utilizzare una nuova lama di rasoio a filo singolo (vedere la tabella dei materiali) per tagliare circa 1 cm dalle estremità della guaina e rimuovere la maggior parte del tessuto della lamina su entrambi i lati della nervatura centrale.</li>
		<li>Tenere la lama del rasoio con un angolo di 90° rispetto alla guaina per radere il tessuto dalla costola mediana abassiale ed esporre lo strato epidermico sulla superficie adassiale sopra il punto inoculato. Cerca di mantenere uno spessore uniforme. Una volta rasate le guaine fogliari, non è consigliabile un'ulteriore potatura in quanto ciò potrebbe danneggiare il campione.</li>
		<li>Assicurarsi che le sezioni rasate non superino le dimensioni di 1 cm x 1 cm. Evitare di premere al centro della guaina durante questo processo. Quando si lavora con guaine inoculate con diverse sospensioni di spore, disinfettare i guanti e cambiare la lama del rasoio tra un campione e l'altro.</li>
		<li>Tenere a portata di mano un vetrino da microscopio pulito. Sollevare la sezione della guaina da un bordo e trasferirla con cura su una nuova slitta. La superficie inoculata (assiale) della guaina deve essere più in alto, più vicina alla lente dell'obiettivo. Montare le sezioni delicatamente per evitare danni alle strutture fungine.</li>
		<li>Applicare 60 μL di acqua deionizzata sterile sulla sezione e aggiungere un vetrino coprioggetti di 24 mm x 60 mm (vedere la tabella dei materiali). Fallo lentamente per evitare bolle d'aria.</li>
		<li>Quando si è pronti per la microscopia, sigillare il vetrino coprioggetto con uno smalto trasparente (vedere la tabella dei materiali) posizionando una piccola goccia su ciascun bordo e quindi collegando le gocce con un pennello per smalto per ottenere una sigillatura perfetta. NOTA: Questo protocollo di guaina può essere utilizzato con colorazioni citologiche, ad es. 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), rosso neutro o blu tripano, o per l'osservazione della plasmolisi cellulare per valutare la vitalità delle cellule vegetali. Per la colorazione della guaina o i saggi di plasmolisi cellulare, non sigillare il vetrino coprioggetto.</li>
		<li>Per i saggi di plasmolisi, aggiungere una soluzione ipertonica (0,75 M di saccarosio o 1 M di cloruro di sodio) su un bordo del vetrino coprioggetto e utilizzare una carta velina piegata priva di lanugine per aspirare la soluzione attraverso il campione fino all'altro bordo del vetrino coprioggetto. Per la colorazione, utilizzare un metodo simile per applicare la soluzione antimacchia.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia a campo largo<ol><li>Una volta che le guaine fogliari sono montate sui vetrini del microscopio, ispezionarle per la colonizzazione fungina utilizzando un microscopio ottico a campo largo con un ingrandimento di 400x.</li>
		<li>Per osservare le strutture fungine in dettaglio, utilizzare un obiettivo a immersione in acqua anziché l'olio per una migliore qualità dell'immagine dei campioni. L'aberrazione sferica dovuta a una mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione può causare la degradazione dell'immagine. Gli obiettivi per l'acqua sono disponibili sia per i microscopi ottici a campo largo che per i microscopi confocali.</li>
		<li>Per determinare la quantità relativa di colonizzazione per guaina, contare il numero di cellule di mais invase da ciascun sito di penetrazione fungina utilizzando un microscopio ottico a campo largo con un ingrandimento di 100x. Questa quantificazione è una fase di screening appropriata prima di qualsiasi analisi statistica che confronti i ceppi, i trattamenti e/o le fasi di sviluppo.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia confocale a scansione laser<ol><li>Per osservare le proteine fluorescenti nei tessuti di mais durante lo sviluppo di ceppi fungini transgenici, regolare i parametri di base di acquisizione delle immagini. Identificare le migliori impostazioni di eccitazione/emissione in base al marcatore fluorescente selezionato. NOTA: Un obiettivo d'acqua 60x è preferibile quando si analizzano fusioni fluorescenti costruite con proteine secrete. I moderni microscopi confocali sono dotati di obiettivi a immersione in acqua altamente corretti per evitare artefatti e aberrazioni di forma.</li>
		<li>Se si intende l'imaging di proteine fluorescenti su cellule vive, utilizzare ceppi fungini non trasformati come controlli per l'autofluorescenza. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione delle immagini per acquisire la dinamica dell'ospite fungino su un microscopio confocale invertito e per la proteina fluorescente mCherry. Impostare la potenza del laser fino al 5%, 450-600 alta tensione (HV) a seconda del livello di espressione, guadagno 1,375 X, offset 3%, un fattore di zoom ottico di 1 per l'analisi di un massimo di cinque celle di mais per sezione e un fattore di zoom ottico di 2-5 per le singole ife. NOTA: Le immagini confocali Z-stack ad alta risoluzione forniscono dati tridimensionali e una migliore visione delle interazioni in tempo reale tra l'ospite e l'agente patogeno.</li>
		<li>Per quantificare le intensità di fluorescenza corrispondenti alle proteine di fusione secrete, utilizzare un software di analisi delle immagini del produttore del confocale o un programma di elaborazione delle immagini come ImageJ, che può essere scaricato gratuitamente online. Consultare un manuale per i dettagli su come quantificare i segnali fluorescenti di conseguenza.</li>
	</ol></li>
</ol>

Visualizzazione delle interazioni cellulari tra le guaine di mais e i funghi

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti e nulla da rivelare.

Il metodo di inoculazione della guaina fogliare ottimizzato qui descritto è modificato da un protocollo originale che è stato sviluppato ed è stato applicato alle guaine fogliari di riso 6,8,36. Consente osservazioni dirette e dettagliate della crescita e dello sviluppo fungino nelle cellule vegetali viventi con microscopia a campo largo o confocale. Il protocollo è adatto per la caratterizzazione, il confronto e la quantificazi...

Le analisi spaziali e temporali a livello cellulare sono fondamentali per comprendere la fisiologia e la citologia delle interazioni fungo-pianta. I tessuti fogliari che sono stati fissati chimicamente 1,2,3 o eliminati e colorati4, così come le membrane artificiali 5, sono stati utilizzati in passato per studiare la citologia dello sviluppo dei patogeni fogliari e le interazioni pianta-fungo. Tuttavia, lo studio degli eventi di infezione nei tessuti viventi dell'ospite in tempo reale senza fissazione o chiarificazione è impegnativo a causa di problemi tecnici relativi alla preparazione di campioni otticamente trasparenti per l'imaging.
Alla fine degli anni '40 è stato sviluppato un protocollo di inoculazione con guaina fogliare staccata per l'indagine microscopica in campo chiaro della resistenza delle cellule epidermiche di riso viventi al fungo dell'esplosione del riso Magnaporthe oryza6. Più recentemente, osservazioni molecolari, fisiologiche e citologiche dettagliate della colonizzazione dell'ospite da parte delle specie Colletotrichum e Magnaporthe sono state notevolmente facilitate dalla combinazione di versioni modificate di questo metodo di guaina fogliare con trasformanti fungini che esprimono proteine fluorescenti e protocolli di imaging di cellule vive ad alte prestazioni, tra cui l'epifluorescenza e la microscopia confocale 7,8,9,10.11,12,13.
Questo documento descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato utilizzando guaine fogliari di mais staccate per l'osservazione dei processi di infezione da parte di patogeni fungini fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Lo abbiamo utilizzato in particolare per studiare Colletotrichum graminicola (C. graminicola), l'agente causale della peronospora delle foglie antracnosi e del marciume del gambo, e della Stenocarpella maydis, che causa la peronospora delle foglie di Diplodia e il marciume del gambo. Tuttavia, il metodo dovrebbe essere applicabile ad altri patogeni fungini fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Le risposte citologiche e fisiologiche durante gli eventi di infezione e colonizzazione in queste guaine fogliari asportate sono simili a quelle delle lame fogliari intere12,14,15. Inoltre, la colonizzazione emibiotrofica delle cellule epidermiche della guaina da parte di C. graminicola è simile alla colonizzazione delle cellule del midollo del gambo16,17. Le guaine distaccate mostrano una maggiore sincronicità e riproducibilità sperimentale della penetrazione e della colonizzazione fungina rispetto alle lame fogliari o ai tessuti del midollo del gambo14,16,17,18. La maggior parte delle varietà di mais può essere utilizzata per questo protocollo. Tuttavia, gli inbred o gli ibridi con eccessivi pigmenti viola nelle guaine sono meno adatti poiché i pigmenti interferiscono con l'imaging. Il mais dolce Golden Jubilee è stato particolarmente utile per i nostri studi perché i semi non trattati sono disponibili in commercio, le piante sono altamente suscettibili a molte malattie fogliari e crescono bene in serra. Le prime epidemie di marciume del gambo dell'antracnosi negli Stati Uniti hanno provocato la perdita totale dei raccolti di mais dolce in Indiana negli anni '7019,20. Questo metodo di inoculazione della guaina fogliare può essere applicato per osservare e quantificare direttamente la crescita e lo sviluppo fungino nelle cellule vegetali viventi rispetto a quelle uccise localmente, per dimostrare le reazioni di resistenza nelle risposte compatibili/incompatibili all'infezione fungina e per testare le interazioni tra ceppi fungini sulla stessa guaina in tempo reale.

<table><tbody><tr><td>Fotocamera per microscopio monocromatica Axiocam</td><td>ZEISS</td><td>426560-9010-000</td><td>Compatibile con il microscopio Axioplan 2; fornisce un basso rumore di lettura e un'alta velocità per l'imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza Axioplan 2</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Consente la visualizzazione dal vivo e l'acquisizione di immagini/video&nbsp; di campioni biologici&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco 24 x 1,5/2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002431</td><td>Sorvall Legend Micro 17; velocità massima: 13.300 giri/min (17.000 x g)</td></tr><tr><td>Piastra di Petri batteriologica Falcon con coperchio</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-105</td><td>Materiale in polistirene; superficie idrofobica</td></tr><tr><td>Carta da filtro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-920-115</td><td>Whatman grado 1 per camere umide su piastra di Petri</td></tr><tr><td>FV 3000 microscopio confocale a scansione laser</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Per la visualizzazione di trasformanti fungini'&nbsp;</td></tr><tr><td>Carta per germinazione</td><td>Anchor Paper Co.</td><td>SD7615L</td><td>76# peso elevato per camere umide in scatola di plastica</td></tr><tr><td>Piastre Petri in vetro</td><td>VWR International</td><td>75845-542</td><td>Tipo 1 classe A, 33 vetro borosilicato ad espansione; set completo (coperchio + fondo), per camere umide su piastra Petri Lana</td></tr><tr><td>di vetro&nbsp;</td><td>Ohio Valley Specialità chimiche&nbsp;</td><td>3350</td><td>Per unità filtranti in lana di vetro</td></tr><tr><td>Emocitometro/camera di conteggio Neubauer e vetro di copertura</td><td>VWR International</td><td>15170-172</td><td>0,1 mm di profondità; viene fornito con due vetri di copertura da 0,4 mm</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-457&nbsp;</td><td>Confezione da 100 in vetro borosilicato; 22 mm lunghezza, 22 mm larghezza</td></tr><tr><td>Semi di cultivar di mais Golden Jubilee</td><td>West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada</td><td>CN361</td><td>Matura&nbsp; in 95-105 giorni; tipo di seme:</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga F1&nbsp;</td><td>Stati Uniti Scientifici&nbsp; &nbsp;</td><td>1415-2500</td> Vetrini per microscopio <td>con capacità di 1,5 mL</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-123&nbsp;</td><td>Guida a linguetta bianca Superfrost; 76 mm di lunghezza, 25 mm di larghezza</td></tr><tr><td>Farina d'avena Agar (OA)</td><td>VWR International</td><td>255210</td><td>Difco Farina d'avena Agar, BD; 500 g</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Revlon</td><td>43671</td><td>Smalto trasparente per sigillare vetrini da microscopio; colore 771</td></tr><tr><td>Trasparente Piastra PCR a 96 pozzetti senza bordo</td><td>USA Sientific</td><td>1402-9500</td><td>100 uL volume piastra</td></tr><tr><td>Pestello per provette per microcentrifuga</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1415-5390</td><td>Punta conica; materiale in polipropilene</td></tr><tr><td>PlanApo 60X/1,00 WLSM obiettivo ad acqua&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>1-UB933</td><td>Compatibile con il microscopio confocale Olympus FV 3000</td></tr><tr><td>Destrosio di patata agar (PDA)</td><td>VWR International</td><td>90000-758</td><td>Difco Destrosio di patata Media, BD; 500 g</td></tr><tr><td>Pro-Mix BX</td><td>Premium Horticulture Supply Co.</td><td>N/A</td><td>Substrato di coltivazione premium per uso generico formulato per fornire a&nbsp; equilibrio tra ritenzione idrica e corretto drenaggio</td></tr><tr><td>SC10 cone-tainers&nbsp;</td><td>Serra Megastore&nbsp;</td><td>CN-SS-SC-10B</td><td>1,5 pollici di diametro, 8,25 pollici di profondità e un volume di 164 mL</td></tr><tr><td>SC10 vassoio cone-tainers</td><td>Serra Megastore&nbsp;</td><td>CN-SS-SCTR98</td><td>24 pollici di lunghezza x 12 pollici di larghezza x 6,75 pollici di altezza; contiene fino a 98 coni SC10</td></tr><tr><td>Lama di rasoio a filo singolo</td><td>Lama Thermo Fisher Scientific</td><td>17-989-145</td><td>AccuTec; materiale in acciaio; lama di 38 mm di lunghezza</td></tr><tr><td>Contenitori/scatole di stoccaggio con chiusura a scrocco</td><td>Target</td><td>002-02-0405</td><td>Scatole di stoccaggio a vista chiara per camera umida; dimensioni esterne: 23 5/8 pollici x 16 3/8 pollici x 6 1/2 pollici; Capacità di 32 qt.</td></tr></tbody></table>

guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Abbiamo ottimizzato un protocollo per inoculare guaine fogliari di mais con funghi patogeni fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Il metodo è modificato da quello originariamente applicato alle guaine delle foglie di riso e consente l'osservazione microscopica diretta della crescita e dello sviluppo dei funghi nelle cellule vegetali viventi. Le guaine fogliari raccolte da piantine di mais con due colletti fogliari completamente emersi vengono inoculate con gocce da 20 μL di 5 x 105 spore/mL di sospensioni di spore fungine e incubate in camere di umidità a 23 °C sotto luce fluorescente continua. Dopo 24-72 ore, il tessuto in eccesso viene rimosso con una lama di rasoio per lasciare un singolo strato di cellule epidermiche, un campione otticamente trasparente che può essere visualizzato direttamente senza la necessità di fissazione chimica o pulizia. Le cellule vegetali e fungine rimangono in vita per tutta la durata dell'esperimento e le interazioni possono essere visualizzate in tempo reale. Le guaine possono essere colorate o sottoposte a plasmolisi per studiare la citologia dello sviluppo e la vitalità delle cellule ospiti e patogene durante l'infezione e la colonizzazione. I ceppi fungini trasformati per esprimere proteine fluorescenti possono essere inoculati o co-inoculati sulle guaine per una maggiore risoluzione e per facilitare la valutazione di interazioni competitive o sinergiche. I ceppi fungini che esprimono proteine di fusione fluorescenti possono essere utilizzati per tracciare e quantificare la produzione e il targeting di queste singole proteine nelle piante. I tessuti della guaina inoculati possono essere estratti per caratterizzare acidi nucleici, proteine o metaboliti. L'uso di questi saggi di guaina ha notevolmente fatto progredire gli studi dettagliati dei meccanismi di patogenicità fungina nel mais e anche degli effettori proteici fungini e dei metaboliti secondari che contribuiscono alla patogenicità.

Gli esempi seguenti descrivono i risultati rappresentativi in seguito all'uso del metodo di inoculazione della guaina fogliare di mais. Questi esempi dimostrano la facilità, la velocità e la precisione con cui l'osservazione e il confronto delle interazioni mais-funghi possono essere realizzati in tempo reale con questo saggio ottimizzato. L'imaging di cellule vive consente anche l'estrazione di informazioni quantitative, fornendo uno strumento utile per studi molecolari, citologici e fisiologici comparativi. Ulteriori d...

Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.

Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...

Quindi il nostro team mira a comprendere i meccanismi di patogenicità fungina nelle piante per migliorare la gestione delle malattie. Attualmente stiamo esplorando il modo in cui il fungo autoctono del mais regola la secrezione proteica al di là della sua funzione di pulizia. Il nostro protocollo mostra un'elevata sincronicità tra le repliche e la riproducibilità della colonizzazione fungina.Inoltre, con i nostri saggi, non è necessario eliminare o fissare i campioni prima di acquisirli in tempo reale. Il metodo offre una varietà di applicazioni nelle interazioni pianta-patogeno e ha contribuito a studi dettagliati sui meccanismi di patogenicità fungina nel mais e all'analisi genomica comparativa.

detached-maize-sheaths-for-live-cell-imaging-infection-fungal-foliar

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Defensine pianta gioca un ruolo importante nella difesa delle piante contro gli agenti patogeni. Per un uso efficace di questi peptidi antimicotici come agenti antifungini, comprendere le loro modalità di azione (MOA) è critico. Qui, è descritto un metodo di imaging di cellule vive per studiare aspetti critici di MOA di questi peptidi.

Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta

Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.

Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero

Questo è un protocollo semplice di un test di guaina di foglie d'orzo che utilizza reagenti minimi e attrezzature di laboratorio comuni (incluso uno smartphone di base). Lo scopo è quello di visualizzare il processo di infezione precoce della malattia blastica in laboratori senza accesso ad apparecchiature di microscopia avanzate.

Visualizzazione dei siti di infezione precoce della malattia dell'esplosione del riso (Magnaporthe oryzae) sull'orzo (Hordeum vulgare) utilizzando un microscopio di base e uno smartphone

I primordi delle foglie di mais sono profondamente inguainati e arrotolati, rendendoli difficili da studiare. Qui presentiamo metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale.

Metodi migliorati per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di Primordia di foglie di mais per fluorescenza e imaging confocale

Questo protocollo di immunolocalizzazione nei meiociti maschi del mais mantiene l'integrità tridimensionale delle cellule durante la meiosi. Permette il tracciamento dinamico della localizzazione intracellulare di fino a tre anticorpi indipendenti in materiale conservato con paraformaldeide, oltre al DAPI, che colora il DNA.

Immunolocalizzazione tridimensionale nei meiociti del mais

Time-lapse microscopia di marcatori autofagia fluorescente permette il monitoraggio della risposta autofagia dinamica con alta risoluzione temporale. Utilizzando l'autofagia specifico e marcatori di organelli in una combinazione di 3 colori diversi, siamo in grado di seguire il contributo di una proteina di formazione dell'autofagosoma in un contesto spaziale e temporale robusto.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l'utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all'interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Qui viene presentato un metodo comodo e potente per studiare l'autofagia in Penicillium chrysogenum utilizzando tamponi di fame (miscele di agarosio e acqua di rubinetto in un vetrino da microscopio contenente una cavità centrale).

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

Il Lateral Root Inducible System (LRIS) consente l'induzione sincrona delle radici laterali ed è presentato per Arabidopsis thaliana e mais.

Laterale Root inducibile di sistema in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E mais

L'ameba sociale Dictyostelium discoideum è stata recentemente istituita come sistema per studiare il misfolding e la proteostasi delle proteine. Qui, descriviamo una nuova metodologia basata sull'imaging per studiare l'aggregazione proteica indotta dalla temperatura e la risposta allo stress cellulare in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

Scopri un protocollo ottimizzato di inoculazione su guaine di mais staccate per studiare le interazioni tra mais e patogeni fungini come Colletotrichum graminicola. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale di tessuti non fissati, migliorando la riproducibilità dei risultati sperimentali e offrendo nuove prospettive per la gestione delle malattie nelle colture.

Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

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