Name: Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: Impara l'isolamento e la coltura di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale umana mediante digestione enzimatica. Questo metodo consente la differenziazione in osteoblasti, adipociti e condrociti per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Gli autori sono grati al Dr. Mathew Mazhavancheril, direttore e capo del Centro di ricerca Pushpagiri a Thiruvalla, per il suo supporto nella documentazione delle procedure presso il Centro di ricerca.

Il protocollo qui delineato è conforme alle linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). L'uso dei denti estratti è stato condotto seguendo standard etici per garantire l'integrità, la dignità e i diritti dei partecipanti. I partecipanti selezionati per questo studio erano individui sani di età inferiore ai 30 anni che necessitavano di estrazione dentale per il trattamento ortodontico. Quelli con carie dentale estesa o grave parodontite sono stati esclusi dallo studio. I denti decidui sono stati raccolti dai bambini che hanno richiesto l'estrazione dei denti trattenuti. Il consenso informato scritto è stato ottenuto anche dai soggetti coinvolti in questo studio.
1. Estrazione e trasporto dei denti
<ol><li>Raccolta di denti decidui e permanenti<ol><li>Spiegare ai partecipanti lo scopo della procedura e il potenziale utilizzo dei denti estratti per scopi di ricerca.</li>
		<li>Eseguire l'estrazione dei denti in anestesia locale somministrando un agente anestetico in prossimità del dente da estrarre. In particolare, per questo studio sono stati iniettati 1,75 ml di lidocaina miscelata con epinefrina (vedi Tabella dei materiali) in rapporto 1:200.000. È preferibile selezionare denti che non presentino carie dentale grave o parodontite20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasporto dei denti estratti NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni asettiche per evitare contaminazioni. Ciò include l'uso di dispositivi di protezione individuale, come guanti e camice da laboratorio, e il lavoro in un ambiente sterile, come un cappuccio a flusso laminare a rischio biologico.<ol><li>Dopo che il dente è stato estratto, sciacquarlo con una soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il sangue e altri detriti. Utilizzando una pinza sterile e un bisturi, rimuovere con cura eventuali residui di tessuto molle attaccati dalla superficie del dente (Figura 2A).</li>
		<li>Immergere il dente in una soluzione disinfettante, come etanolo al 70%, per 10 s. Dopo la disinfezione, sciacquare il dente con PBS sterile per lavare via eventuali residui di disinfettante.</li>
		<li>Mettere il dente in un contenitore sterile contenente il mezzo di trasporto. NOTA: Il mezzo di trasporto consisteva in Alpha-MEM, un terreno di coltura commerciale integrato con antibiotici: 100 U/mL di penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei materiali). Questo mezzo forniva nutrienti essenziali alle cellule all'interno del dente estratto, garantendone la sopravvivenza fino all'elaborazione in laboratorio. Gli antibiotici servivano a inibire la crescita batterica.</li>
		<li>Mantenere una temperatura di 4 °C durante il trasporto per rallentare le attività metaboliche cellulari e ritardare la morte cellulare. Trasporta il dente in laboratorio per le fasi successive, tra cui l'elaborazione e l'isolamento delle cellule staminali della polpa dentale.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Raccolta del tessuto pulpare
<ol><li>Fissare il dente utilizzando una pinza dentale per assicurarsi che rimanga in posizione durante la procedura. Utilizzare un disco diamantato per tagliare il dente in un manipolo dentale (vedere Tabella dei materiali) collegato a un refrigerante ad acqua (Figura 2B). NOTA: L'obiettivo è esporre la camera pulpare senza causare danni inutili al tessuto pulpare all'interno.</li>
	<li>Utilizzare un escavatore dentale (vedi Tabella dei materiali) per rimuovere il tessuto pulpare. Questo strumento consente l'estrazione della polpa senza infliggere danni, preservando così la vitalità delle cellule staminali della polpa dentale (Figura 2C).</li>
	<li>Posizionare il tessuto ottenuto su una capsula di Petri di vetro. Lavare il tessuto pulpare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato.</li>
</ol>3. Digestione del tessuto pulpare e isolamento cellulare
<ol><li>Macinazione e digestione dei tessuti<ol><li>Con una lama chirurgica sterile, tritare accuratamente il tessuto pulpare in piccoli frammenti (Figura 2D) e posizionarlo in un mini trituratore di tessuti con PBS per ottenere una miscela finemente omogeneizzata. Questo processo aumenta la superficie del tessuto, facilitando un'azione enzimatica più efficiente durante la digestione.</li>
		<li>Trasferire i frammenti di tessuto omogeneo tritati in una provetta da 15 mL e digerire enzimaticamente utilizzando una miscela di 3 mg/mL di collagenasi di tipo I e 4 mg/mL di dispasi (vedere la Tabella dei materiali). Questi enzimi sono stati disciolti nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per ottenere le concentrazioni desiderate.</li>
		<li>Incubare il tessuto pulpare nella miscela enzimatica (punto 3.1.2) per circa 2 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, neutralizzare gli enzimi e raccogliere le cellule mediante centrifugazione (passaggio 3.2.1) per un'ulteriore coltura.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugazione e risospensione<ol><li>Dopo l'incubazione, trasferire il tessuto digerito in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Questo passaggio separa le cellule dai frammenti di tessuto rimanenti e dagli enzimi non digeriti. Eliminare con cura il mezzo surnatante, assicurandosi di non disturbare il pellet della cella sul fondo della provetta.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura fresco. Questo mezzo fornisce i nutrienti e l'ambiente necessari per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule isolate.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Coltura cellulare
<ol><li>Placcatura e incubazione delle cellule<ol><li>Trasferire con cura le cellule risospese in un pallone di coltura di 25 cm². NOTA: Tutto il materiale di una singola polpa viene trasferito in un unico pallone per colture cellulari da 25 cm2 . Un volume del terreno di 5-7 mL garantisce una copertura e una disponibilità di nutrienti sufficienti per le cellule. Assicurarsi che il terreno di coltura per i DPSC sia il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10%-20% di siero fetale bovino (FBS) (vedere la Tabella dei materiali) per fornire i fattori di crescita necessari. Inoltre, integrare il terreno con l'1% di penicillina/streptomicina per prevenire la contaminazione batterica. Assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente in tutto il pallone per favorire una crescita omogenea.</li>
		<li>Incubare il matraccio a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Variazione del fluido e confluenza di monitoraggio<ol><li>Cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni per fornire nutrienti freschi e rimuovere le scorie metaboliche. Per fare ciò, aspirare con cura il vecchio terreno utilizzando una pipetta sierologica sterile e sostituirlo con un terreno nuovo.</li>
		<li>Monitorare regolarmente la coltura cellulare al microscopio per monitorare la crescita delle cellule e verificare la presenza di eventuali segni di contaminazione.</li>
		<li>Continuare questo processo fino a quando le celle raggiungono l'80%-90% di confluenza, il punto in cui le celle coprono la maggior parte della superficie del pallone ma non sono eccessivamente affollate.</li>
	</ol></li>
	<li>Tripsinizzazione e passaggio o congelamento cellulare<ol><li>Una volta che le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il terreno residuo e le cellule non aderenti.</li>
		<li>Aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% al matraccio per staccare le cellule dalla superficie del pallone. Incubare per 2-5 minuti a 37 °C fino al distacco delle cellule.</li>
		<li>Neutralizzare la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura, quindi pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per garantire il completo distacco delle cellule.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.</li>
		<li>Risospendere le cellule in un terreno di coltura fresco e ripiastarle (passaggio) per un'ulteriore crescita o congelarle per un uso futuro. Durante il congelamento, utilizzare un mezzo di congelamento che contenga un crioprotettore, come il DMSO, per proteggere le cellule dai danni durante il congelamento.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Caratterizzazione dei DPSC
<ol><li>Analisi di citometria a flusso<ol><li>Per confermare la natura delle cellule staminali mesenchimali delle cellule isolate, eseguire l'analisi di citometria a flusso22,23. Inizialmente, tripsinizzare e raccogliere le cellule come descritto nel passaggio 4.3.</li>
		<li>Determinare la vitalità cellulare mediante la tecnica di esclusione del colorante tripano. Eseguire l'analisi utilizzando un analizzatore di vitalità cellulare (vedi Tabella dei materiali) durante il 2° e l'8° passaggio. Eseguire l'analisi fenotipica tramite un citometro a flusso durante il 3° e il 7° passaggio.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, lavare le cellule in un tampone per citometria a flusso per rimuovere gli anticorpi in eccesso e analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso. NOTA: Il tampone per citometria a flusso è composto da soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS), siero fetale bovino (FBS) all'1%-2% e sodio azide allo 0,1% (NaN3). L'FBS o BSA blocca il legame aspecifico degli anticorpi, mentre l'azoturo di sodio agisce come conservante. Un'alta percentuale di cellule dovrebbe esprimere i marcatori delle cellule staminali mesenchimali e mancare dei marcatori ematopoietici, confermando la loro identità come DPSC24.</li>
		<li>Staccare le DPSC e colorarle con anticorpi in immunofluorescenza per l'analisi della citometria a flusso. NOTA: La selezione dei marcatori per l'analisi della citometria a flusso delle cellule staminali mesenchimali (MSC) si basa sul consenso stabilito dalla Società Internazionale di Terapia Cellulare (ISCT), che afferma che le MSC dovrebbero esprimere CD105, CD73 e CD90 e non hanno l'espressione di CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19 e HLA di classe II25. Questi marcatori sono comunemente usati negli studi che studiano le cellule staminali della polpa dentale26. Le concentrazioni di anticorpi per la colorazione possono variare a seconda dell'anticorpo specifico utilizzato e si raccomanda di seguire le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali) per le diluizioni degli anticorpi e le condizioni di incubazione25.</li>
		<li>Stabilire i criteri di classificazione 27,28 per l'espressione dei marcatori CD come detto: meno del 10%, nessuna espressione; tra l'11% e il 40%, bassa espressione; un intervallo compreso tra il 41% e il 70%, espressione moderata; superiore al 71%, alta espressione.</li>
		<li>Inoltre, confermare l'assenza di marcatori ematopoietici incubando un'aliquota cellulare separata con anticorpi contro CD34 e CD45.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Differenziazione multilineage
NOTA: I seguenti passaggi delineano i protocolli per la differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica delle cellule staminali dentali. Iniziare seminando le colture a una densità di 1 x 105 cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale rivestita di fibronectina con terreno completo (CM). Monitorare la crescita cellulare fino al raggiungimento della confluenza dell'80%-90% prima di avviare il protocollo di differenziazione desiderato. Per valutare il potenziale di differenziazione multilineage delle DPSC, avviare il processo di differenziazione verso osteoblasti, adipociti e condrociti seminando le cellule in piastre a 24 pozzetti e coltivandole in terreni di differenziazione appropriati.
<ol><li>Differenziamento osteogenico<ol><li>Inizia coltivando i DPSC in un terreno di coltura regolare in condizioni standard fino a raggiungere la confluenza del 70%-80%.</li>
		<li>Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, quindi lavare le cellule una volta con 1x PBS. Aggiungere il mezzo di differenziazione osteogenico (ODM) alle cellule. NOTA: L'ODM è costituito da Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) integrato con il 10% di FBS, 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 mM di beta-glicerofosfato e 100 nM di desametasone (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Incubare le cellule nel terreno osteogenico a 37 °C con CO2 al 5%. Cambiare il terreno osteogenico ogni 2-3 giorni. NOTA: Dopo 14-21 giorni, le DPSC dovrebbero essersi differenziate in cellule simili agli osteoblasti. Ciò può essere confermato controllando un aumento dell'espressione di marcatori specifici per gli osteoblasti, come la fosfatasi alcalina, o utilizzando tecniche di colorazione per rilevare la matrice mineralizzata, come la colorazione S rosso di alizarina.</li>
		<li>Fissare le cellule incubandole con etanolo ghiacciato al 70% per 1 ora a -20 °C.</li>
		<li>Colorare le cellule fissate con una soluzione colorante 40 nM di Alizarina Rosso S (pH 4,2) a temperatura ambiente al buio per 10-15 minuti. Visualizzare la colorazione al microscopio per confermare la differenziazione osteogenica (Figura 3). Confermare la differenziazione colorando le cellule con Alizarina Red S, che identifica i depositi di calcio indicativi di mineralizzazione29,30.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione adipogenica<ol><li>Come descritto nella sezione precedente, i DPSC vengono coltivati in condizioni standard in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C. Passaggio delle celle quando raggiungono circa il 70%-80% di confluenza.</li>
		<li>Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Sostituire il mezzo di derivazione lavato con un mezzo di differenziazione adipogenico. Questo terreno è generalmente costituito da DMEM, 10% FBS, 10 μg/mL di insulina, 1 μM di desametasone, 200 μM di indometacina e 0,5 mM di IBMX (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Cambiare il mezzo di differenziazione ogni 3-4 giorni. Dopo circa 3 settimane, lavare le DPSC adipogenico-differenziate con PBS e fissarle con paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Colorare le cellule fissate con Oil Red O (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare l'accumulo di goccioline lipidiche (Figura 4). Per confermare ulteriormente la differenziazione adipogenica, eseguire l'analisi dell'espressione genica di marcatori adipogenici come il recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPARγ) e l'adiponectina31,32.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione condrogenica<ol><li>Per la differenziazione condrogenica vengono utilizzate colture di DPSC mantenute in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C. Passaggio delle celle quando raggiungono circa il 70%-80% di confluenza.</li>
		<li>Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Sostituire il terreno di derivazione condrogenico, che in genere contiene il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, l'1% di ITS, 100 nM di desametasone, 50 μg/mL di ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL di prolina e 10 ng/mL di Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3) (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Mantenere le cellule nel mezzo di differenziazione condrogenico, cambiando il terreno ogni 2-3 giorni. Dopo circa tre settimane, le DPSC dovrebbero essersi differenziate in cellule simili ai condrociti.</li>
		<li>Fissare le cellule incubandole con paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, colorare le cellule con Alcian Blue (vedi Tabella dei materiali) e visualizzarle al microscopio per confermare la differenziazione condrogenica (Figura 5).</li>
		<li>Confermare la differenziazione delle DPSC in condrociti utilizzando tecniche come la colorazione con Alcian Blue per i proteoglicani o l'analisi dell'espressione genica di marcatori condrogenici come l'aggrecano, SOX9 e il collagene di tipoII 33,34.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo delinea l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) da denti decidui e permanenti umani. Include una descrizione dell'immagazzinamento e della proliferazione di queste cellule, nonché la valutazione del loro potenziale di differenziazione in vitro in osteoblasti, adipociti e condrociti35.
Chen et al.36 hanno dimostrato che le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) possono essere ottenute da varie fonti, inclusi denti umani vitali infetti afflitti da condizioni come parodontite, riassorbimento radicolare, pericoronite e fratture dei denti, nonché denti soprannumerari e disallineati. Questa scoperta è stata ulteriormente corroborata da studi successivi che hanno identificato i denti vitali infetti come potenziali fonti di DPSC 37,38,39,40. Tuttavia, Bernardi et al.10 hanno sottolineato che un aumento del riassorbimento radicale potrebbe influire negativamente sulla vitalità di queste cellule staminali. Un ostacolo significativo nel processo è la conservazione delle cellule e la prevenzione della loro degradazione, che inizia immediatamente dopo l'estrazione o l'esfoliazione del dente. Inoltre, è importante notare che i denti affetti da condizioni gravi come ascessi periapicali, tumori o cisti non dovrebbero essere utilizzati per estrarre le cellule staminali40,41.
Le DPSC possono essere ottenute attraverso la tecnica della digestione enzimatica (ED) o il metodo della crescita da espianti tissutali (OG), noto anche come tecnica di crescita spontanea14,15. I ricercatori utilizzano queste strategie per studiare l'efficienza della proliferazione cellulare o il mantenimento degli attributi morfologici e fenotipici delle cellule staminali isolate17. Gli studi hanno scoperto che le cellule staminali isolate con il metodo OG mostrano un tasso di proliferazione più lento e un'espressione più debole dei marcatori delle cellule staminali18. Al contrario, le DPSC isolate attraverso il metodo ED hanno dimostrato una proliferazione, una differenziazione e una maggiore espressione più rapide di marcatori di superficie aggiuntivi rispetto a quelle isolate con il metodo OG. È interessante notare che le cellule staminali immature della polpa dentale (IDPSC) estratte dai denti decidui utilizzando la tecnica OG hanno dimostrato che la coltura cellulare incoraggia la proliferazione selettiva delle IDPSC, prevenendo così la differenziazione precoce42.
La purificazione delle DPSC è fondamentale per ottenere cellule altamente rigenerative e richiede specifici marcatori cellulari. La selezione cellulare viene eseguita utilizzando metodi di selezione cellulare a fluorescenza o attivati magneticamente. Oltre ai suddetti marcatori, vengono utilizzati anche numerosi altri antigeni di superficie a causa della natura eterogenea delle DSC43. Tuttavia, non è stato identificato un singolo marcatore per segregare le sottopopolazioni.
Rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo, le DPSC sono state riconosciute come una fonte promettente di cellule multipotenti grazie al loro potenziale multilineage44. Questa staminalità è probabilmente il risultato della relativa immaturità dei tessuti di origine, poiché i denti del giudizio, spesso la fonte dell'estrazione delle DPSC, sono gli ultimi denti permanenti a svilupparsi e sono quindi meno maturi del midollo osseo45. Questo protocollo esplora con successo la natura multipotente delle cellule staminali della polpa dentale inducendo queste cellule a subire adipogenesi, osteogenesi e condrogenesi. In particolare, le DPSC sono l'unico tipo di cellula che sovraregola l'espressione di DSPP quando coltivate in condizioni osteogeniche, indicativo della loro futura differenziazione in odontoblasti46.
Le cellule staminali dentali, isolate da varie fonti, mostrano molti potenziali di proliferazione e differenziazione47. I significativi progressi compiuti nei sistemi in vitro hanno avuto un profondo impatto sulla biologia e sulle terapie delle cellule staminali. Nonostante questi progressi, permangono sfide nella traduzione delle terapie con cellule staminali dal laboratorio al letto del paziente. Particolare attenzione deve essere prestata alla sopravvivenza e alla stabilità delle cellule staminali per garantire che le tecniche di conservazione non compromettano la vitalità di tali cellule. Sebbene la ricerca sulle cellule staminali dentali abbia prodotto risultati promettenti in modelli animali, vi è un urgente bisogno di estendere questi risultati agli studi sull'uomo. Continuando a guidare una ricerca e uno sviluppo rigorosi, le cellule staminali dentali sono pronte a svolgere un ruolo sostanziale nel progresso del campo della banca delle cellule staminali.
Sebbene ampiamente utilizzato, l'approccio della digestione enzimatica per isolare le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, il processo può compromettere la vitalità cellulare, poiché enzimi come la collagenasi e la dispasi possono inavvertitamente danneggiare le membrane cellulari, producendo meno cellule staminali vive17. Inoltre, questo metodo spesso provoca la degradazione della matrice extracellulare vitale (ECM), che è fondamentale per preservare le proprietà intrinseche delle cellule staminali48. La procedura può anche alterare i marcatori della superficie cellulare, ostacolando l'identificazione e la caratterizzazione accurate delle DPSC43. Al di là di questi vincoli biologici, l'approccio richiede molto tempo, aumentando i rischi di contaminazione microbica dovuti a incubazioni prolungate a 37 °C. Inoltre, l'incoerenza tra i lotti di enzimi può portare a risultati variabili, mettendo a dura prova la riproducibilità della procedura di isolamento. L'onere finanziario non può essere trascurato, poiché gli enzimi di alta qualità adatti alla digestione dei tessuti sono costosi49. Inoltre, le conseguenze della digestione potrebbero vedere un'attività enzimatica residua che potrebbe influenzare negativamente le colture cellulari, influenzandone la salute, la proliferazione e la differenziazione. Infine, il potenziale della digestione enzimatica di isolare preferenzialmente alcune sottopopolazioni di DPSC rispetto ad altre potrebbe inavvertitamente distorcere il pool cellulare risultante, influenzando il loro potenziale terapeutico50.

La ricerca sulle cellule staminali è fiorita nella scienza biomedica grazie alle sue promettenti applicazioni nella medicina rigenerativa e nell'ingegneria tissutale. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC), derivate dal tessuto pulpare dei denti decidui umani e permanenti, hanno suscitato un notevole interesse come fonte di cellule staminali grazie alla loro pronta disponibilità e capacità multipotente 1,2. Queste cellule hanno il potenziale per differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui adipociti, osteoblasti e condrociti, come confermato da numerosi studi3.
Negli ultimi decenni, la ricerca e le applicazioni terapeutiche delle cellule staminali sono aumentate. Il potenziale espansivo delle cellule staminali richiede una diversificazione delle fonti da cui sono ottenute. Diversi fattori influenzano l'efficienza, la vitalità e la staminalità delle cellule scelte. Nonostante l'esistenza di vari serbatoi noti di cellule staminali, come il midollo osseo e i tessuti adiposi, le procedure invasive, la morbilità del sito e le preoccupazioni etiche legate a queste fonti spesso ne limitano l'esplorazione 4,5. Tra le varie fonti di cellule staminali, le cellule staminali dentali hanno attirato l'attenzione grazie alla loro facile accessibilità, all'elevata plasticità e alle diverse potenziali applicazioni. Le cellule staminali della polpa dentale umana, in particolare, sono state ampiamente studiate per le loro prospettive terapeutiche6. I denti, comunemente scartati come rifiuti medici, contengono una ricchezza di cellule staminali mesenchimali7. La salvaguardia di questo prezioso pool di cellule staminali richiede sforzi collettivi da parte di pazienti, dentisti e medici per garantire che queste risorse non vengano sprecate, rendendo ogni cellula staminale della polpa dentale disponibile per future esigenze rigenerative.
Le cellule staminali derivate dalla polpa dentale, come le cellule staminali della polpa dentale adulta umana (DPSC) e le cellule staminali dei denti decidui umani esfoliati (SHED), si trovano nella nicchia perivascolare della polpa dentale. Si ritiene che queste cellule provengano da cellule della cresta neurale cranica e mostrino marcatori precoci sia per le cellule staminali mesenchimali (MSC) che per le cellule staminali neuroectodermiche. DPSC e SHED hanno dimostrato multipotenza e la capacità di rigenerare diversi tipi di tessuto8.
Le potenziali fonti di cellule staminali dentali comprendono denti decidui sani e permanenti. Le cellule staminali costituiscono solo circa l'1% della popolazione cellulare totale nella polpa, evidenziando l'importanza di tecniche efficaci di isolamento ed espansione9. Di conseguenza, l'estrazione e l'espansione di queste cellule staminali sono passaggi fondamentali nell'isolamento DPSC10. I denti estratti o esfoliati devono essere conservati in un mezzo di trasporto ricco di sostanze nutritive, come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina tamponata con Hanks (HBSS).
L'ottenimento della polpa dentale può essere ottenuto attraverso vari metodi, a seconda del tipo di dente 7,11. Per i denti decidui con radici riassorbite, l'estrazione può essere eseguita attraverso l'apice della radice. Allo stesso modo, le brocce spinate sterili possono essere utilizzate per ottenere polpa da denti permanenti con un apice aperto immaturo. In caso di denti permanenti con radici completamente sviluppate, l'accesso alla camera pulpare comporta la separazione della corona dentale dalla radice. Ciò si ottiene tagliando il dente utilizzando un disco diamantato alla giunzione dello smalto cementizio. Questa incisione espone la camera pulpare, consentendo il recupero del tessuto pulpare 12,13,14.
Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) possono essere isolate attraverso la digestione enzimatica (DE) o la crescita da espianti di tessuto (OG), nota anche come crescita spontanea. Il metodo ED impiega enzimi, principalmente collagenasi I e dispasi, per scomporre il tessuto in sospensioni unicellulari15,16. Il metodo OG, più semplice e veloce, prevede il taglio dei frammenti di polpa e il loro inserimento diretto in una piastra di coltura, consentendo alle cellule di crescere dagli espianti di tessuto17. I ricercatori hanno utilizzato e confrontato entrambe le tecniche per valutare i tassi di proliferazione cellulare, la conservazione delle proprietà delle cellule staminali isolate, la differenziazione e l'espressione dei marcatori di superficie18. La definizione e la standardizzazione di protocolli per l'acquisizione di DPSC con elevata efficienza e staminalità può aprire la strada a terapie efficaci e sicure19. Questo protocollo comprende l'estrazione di DPSC mediante digestione enzimatica, elaborazione in laboratorio, conservazione e differenziazione cellulare con colorazione colorimetrica per adipogenesi, osteogenesi e condrogenesi.
Il protocollo descritto in questo articolo presenta una procedura passo-passo, che inizia con l'isolamento iniziale della polpa dentale dal dente, seguita dalla coltura e dal mantenimento delle DPSC in laboratorio, e si conclude con la loro caratterizzazione utilizzando specifici marcatori di cellule staminali (Figura 1). Vengono inoltre descritte le tecniche per indurre queste cellule staminali in diverse linee cellulari, evidenziandone la multipotenza.

<table><tbody><tr><td>3-isobuty-l-metil-xantina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>AS001</td><td></td></tr><tr><td>Blu Alciano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>RM471</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante rosso alizarina</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>GRM894</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina -Kit di colorazione</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha;-MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha Minimo Essenziale Mezzo (&alpha;-MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha-MEM, o Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha-MEM, o Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimicotic</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>012-04802</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerofosfato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di biosicurezza-Cappa a flusso laminare</td><td>Labconco Corporation, MO 64132-2696, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 e HLA-DR</td><td>BioLegend, Inc.CA 92121, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (70 & micro; m )</td><td>Laboratori HiMedia&nbsp; Ltd.Mumbai, India</td><td>TCP025</td><td>Filtro cellulare</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>REMI Elektrotechnik Limited (REMI)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Centrifuga</td><td>HiMedia Laboratories Ltd.Mumbai,India</td><td>1101 | 1102</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo I</td><td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo I</td><td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di crescita completo</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, India</td><td>AT006</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Provette coniche (15 o 50</td>) <td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>546021P / 546041P</td><td>15 mL e 50 ml</td></tr><tr><td>Contenitore per congelamento criogenico</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>Etichetta criogenica</td><td>India:</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>scatole di conservazione crioviale&nbsp;</td>Scatole <td></td><td></td><td>di conservazione Cryostore</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovials (1.8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td><td>PW1282</td><td>Fiaschetta di coltura autoportante</td></tr><tr><td>(25 cm&sup2;)</td><td>Corning Inc.NY 14831, Stati Uniti d'America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiasche di coltura</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, India</td><td>TCG4 / TCG6</td><td>T25 / T75</td></tr><tr><td>Piastre di coltura</td><td>HiMedia Laboratories Ltd.Mumbai, India</td><td>TCP129/TCP008</td><td>60 mm/100 mm</td></tr><tr><td>Dischi diamantati dentali</td><td>Komet SC 29730, USA</td><td></td><td>Komet&nbsp;</td></tr><tr><td>Cucchiaio dentale escavatore</td><td>Brasseler, GA 31419, USA</td><td>5023591U0</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Desametosone</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Desametosone</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TC185</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germania.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (70%)</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, India</td><td>MB106</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo -70%</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Pinze di estrazione Fisher Scientific</td></tr><tr><td>.</td><td>Dentsply Sirona, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td><td>RM9954</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura tissutale rivestita di fibronectina</td><td>Corning Inc.Corning, NY 14831,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences,CA 95131,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tampone per citometria a flusso</td><td>BD Biosciences,CA 95131,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto 22 x 22 mm</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, India</td><td>TCP017</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td> <td>Lonza Group Ltd, 4002 Basilea, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipolo dentale ad alta velocità&nbsp;</td><td>NSK Ltd, Tokyo 8216, Giappone</td><td></td> Siero di cavallo <td>serie Ti-Max Z</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IBMX, o 3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Pfizer Inc. NY 10017, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina-transferrina-selenio (ITS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-transferrina-selenio (ITS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451,USA</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>Premiscela di insulina-transferrina-selenio (ITS)</td><td>Corning Incorporated,MA 01876,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus Corp.,Tokyo 163-0914,Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (60%)</td> <td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>MB063</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaina miscelata con epinefrina</td><td>DENTSPLY, NC 28277, USA</td><td></td><td>Citanest</td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Air Liquide, 75007 Parigi, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di stoccaggio di azoto liquido</td><td>Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf AG,22339 Amburgo,Germania</td><td>30020</td><td>Accupipet-2-20 &; micro; L</td></tr><tr><td>Mini trituratore di tessuti</td><td>Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547, USA</td><td></td><td>Mini smerigliatrici ReadyPrep</td></tr><tr><td>Meno 80 congelatore</td><td>Blue Star Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer camera di conteggio</td><td>Marienfeld Superior, arktheidenfeld, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olio rosso O macchia</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>1024190250</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di differenziazione osteogenica (ODM)&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TCL119</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tamponata con fosfato (PBS) senza Ca++ e Mg++</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td><td>TS1101</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific,MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato Gibco (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>P3813-1PAK</td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Prolina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi Misura 15&nbsp;</td><td>Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ, REGNO UNITO</td><td>BDF-6955C</td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio</td><td>HiMedia Laboratories Ltd.Mumbai, India</td><td>AS102</td><td>4% w/v soluzione</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga sterili</td><td>Tarsons Products Pvt. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenitore sterile -20 mL</td><td>3M Center, MN 55144-1000,USA</td><td></td><td>3 M</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>P3813-1PAK</td><td>1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Pipette sterili (2, 5 e 10 mL</td>)<td>Eppendorf AG,22339 Amburgo,Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette e puntali sterili</td><td>Eppendorf India Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade Maniglia</td><td>Becton, Dickinson and Co.,NJ,USA</td><td>371030</td><td>BP Maniglia 3</td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGF-&beta; 3)</td> <td>R & D Systems, Inc.MN 55413, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGF-&beta; 3)</td> <td>R & D Systems, Inc.MN 55413, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blu Tripano 0,4%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tripano 0,4%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td><td>BSW-01D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth

Nell'ambito della medicina rigenerativa e delle applicazioni terapeutiche, la ricerca sulle cellule staminali sta rapidamente guadagnando terreno. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC), che sono presenti sia nei denti decidui che in quelli permanenti, sono emerse come una fonte vitale di cellule staminali grazie alla loro accessibilità, adattabilità e capacità di differenziazione innate. Le DPSC offrono un serbatoio abbondante e prontamente disponibile di cellule staminali mesenchimali, mostrando una versatilità e un potenziale impressionanti, in particolare per scopi rigenerativi. Nonostante le loro promesse, l'ostacolo principale risiede nell'isolare e caratterizzare efficacemente le DPSC, data la loro rappresentazione come una frazione minuscola all'interno delle cellule della polpa dentale. Altrettanto cruciale è la corretta conservazione di questa inestimabile risorsa cellulare. I due metodi predominanti per l'isolamento della DPSC sono la digestione enzimatica (ED) e la crescita da espianti di tessuto (OG), spesso indicata come crescita spontanea. Questo protocollo si concentra principalmente sull'approccio di digestione enzimatica per l'isolamento del DPSC, descrivendo in dettaglio le fasi che comprendono l'estrazione, l'elaborazione in laboratorio e la conservazione delle cellule. Oltre all'estrazione e alla conservazione, il protocollo approfondisce l'abilità di differenziazione delle DPSC. In particolare, delinea le procedure impiegate per indurre queste cellule staminali a differenziarsi in adipociti, osteoblasti e condrociti, mostrando i loro attributi multipotenti. Il successivo utilizzo di tecniche di colorazione colorimetrica facilita la visualizzazione accurata e la conferma del successo della differenziazione, convalidando così il calibro e la funzionalità dei DPSC isolati. Questo protocollo completo funziona come un modello che comprende l'intero spettro dell'estrazione, coltivazione, conservazione e caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale. Sottolinea il notevole potenziale dei DPSC, spingendo in avanti l'esplorazione delle cellule staminali e mantenendo la promessa di future scoperte rigenerative e terapeutiche.

L'esecuzione con successo del protocollo delineato ha prodotto cellule staminali della polpa dentale (DPSC) in grado di differenziare più lignaggi, dimostrando la loro multipotenza.
Saggi di vitalità La vitalità dei DPSC è stata valutata utilizzando un test di esclusione del Trypan Blue in vari punti temporali. I risultati mostrano una vitalità costantemente elevata (superiore al 95%) durante tutto il periodo di coltura, dimostrando la robustezza del nostro protocollo di isolamento e coltura.
Saggi dell'Unità Formante Colonie (CFU) Sono stati condotti saggi CFU per valutare la capacità di auto-rinnovamento dei DPSC. Una sospensione a cellula singola è stata placcata a bassa densità e coltivata per 14 giorni. Le colonie formate venivano poi colorate e contate. I risultati mostrano molte colonie, indicando un'alta percentuale di cellule che si autorinnovano all'interno della popolazione DPSC.
Tempo di raddoppio delle celle Il tempo di raddoppio delle cellule è stato calcolato in base alla curva di crescita delle DPSC. Le cellule sono state seminate a una densità specifica e contate regolarmente per costruire una curva di crescita. Il tempo di raddoppio è stato quindi calcolato utilizzando la fase di crescita esponenziale della curva. I risultati mostrano un tempo di raddoppio coerente con quello riportato per le MSC, suggerendo una popolazione cellulare sana e proliferativa (Figura 6).
Analisi di citometria a flusso L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che la grande maggioranza delle DPSC (ad esempio, &gt;95%) era positiva per CD90, CD73 e CD105, confermando la loro identità come MSC (Figura 7). Inoltre, meno del 2% delle cellule era positivo per CD45, CD34 e HLA-DR, confermando l'assenza di una significativa contaminazione delle cellule ematopoietiche o endoteliali.
Differenziamento osteogenico Al termine della differenziazione osteogenica, le cellule presentavano una matrice mineralizzata, che viene visualizzata mediante colorazione con Alizarin Red S (Figura 3). La presenza di colorazione rossa nelle cellule colorate indica la riuscita deposizione di una matrice mineralizzata, caratteristica essenziale del differenziamento osteogenico. L'incapacità di ottenere con successo la colorazione per differenziazione potrebbe essere potenzialmente collegata alle sfide affrontate durante la procedura di raccolta del campione.
Differenziazione adipogenica Durante la differenziazione adipogenica, le DPSC hanno accumulato goccioline lipidiche, indicative di adipogenesi. Le goccioline lipidiche possono essere osservate con la colorazione Oil Red O (Figura 4). Una differenziazione riuscita ha portato a goccioline lipidiche colorate di rosso-arancio all'interno delle cellule.
Differenziazione condrogenica Infine, dopo la differenziazione condrogenica, le DPSC hanno prodotto glicosaminoglicani, un componente critico della cartilagine confermato dalla colorazione con Alcian Blue, che si lega a questi glicosaminoglicani. Le cellule sottoposte con successo alla condrogenesi hanno mostrato una colorazione blu dopo la colorazione (Figura 5).
Le cellule che non sono riuscite a mostrare i rispettivi cambiamenti di colore nelle procedure di colorazione potrebbero essere dovute a una differenziazione non ottimale, probabilmente a causa di problemi con i mezzi di differenziazione o la qualità iniziale dei DPSC. Garantire la qualità dei terreni e degli integratori e la salute e il numero di passaggi dei DPSC utilizzati è importante. Il successo della differenziazione delle DPSC in osteoblasti, adipociti e condrociti convalida la natura multipotente di queste cellule e sottolinea il loro potenziale nella medicina rigenerativa e nelle applicazioni terapeutiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica sull'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione delle cellule staminali della polpa dentale. Questa figura fornisce una rappresentazione schematica del flusso di lavoro per l'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC). Il processo inizia con l'estrazione del dente (o dei denti), seguita dall'isolamento del tessuto pulpare, da cui derivano le DPSC. Dopo l'isolamento, le DPSC vengono sottoposte a vari test di caratterizzazione per confermare la loro identità di cellule staminali e valutarne la vitalità, il tasso di proliferazione e altri attributi chiave. La fase finale rappresentata in questo diagramma prevede l'induzione del differenziamento, in cui le DPSC vengono trattate con fattori specifici per guidare la loro trasformazione in tipi cellulari specializzati, come osteoblasti, adipociti o condrociti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig02.jpg"> Figura 2: Prelievo della polpa dai denti estratti. (A) Un dente estratto preparato per l'estrazione del tessuto pulpare. (B) Sezionamento del dente estratto utilizzando una fresa diamantata. (C) Rimozione del tessuto pulpare dalla camera pulpare. (D) Frammentazione del tessuto pulpare mediante lama chirurgica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig03.jpg"> Figura 3: Differenziazione osteogenica delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) evidenziata dalla colorazione con Alizarin Red S (40x). La colorazione rosso vivo rivela la deposizione della matrice mineralizzata, una caratteristica degli osteoblasti, confermando il successo della differenziazione osteogenica. Barra della scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig04.jpg"> Figura 4: Differenziazione adipogenica delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) dimostrata mediante colorazione con O rosso olio. La presenza di goccioline rosso vivo rappresenta l'accumulo di lipidi, un segno distintivo degli adipociti, confermando il successo della differenziazione adipogenica. Barra della scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig05.jpg"> Figura 5: Differenziazione condrogenica delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) dimostrata mediante colorazione Alcian Blue (40x). Il colore blu intenso indica la presenza di una matrice extracellulare ricca di proteoglicani, caratteristica dei condrociti, che conferma il successo della differenziazione condrogenica. Barra della scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig06.jpg"> Figura 6: Tempo di raddoppio cellulare per le cellule staminali della polpa dentale (DPSC). Questa figura illustra la curva di crescita dei DPSC nel tempo. Le cellule sono state inizialmente seminate a una densità specifica e la conta delle cellule è stata misurata a intervalli regolari (rappresentati sull'asse x) per monitorare il tasso di proliferazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig07.jpg"> Figura 7: Espressione del marcatore di superficie delle cellule staminali in coltura DPSC. Questa figura mostra l'espressione di specifici marcatori di superficie sui DPSC. I marcatori delle cellule staminali mesenchimali CD44, CD90 e CD105 mostrano alti livelli di espressione, indicando la presenza di tratti mesenchimali in queste cellule. Al contrario, l'espressione dei marcatori ematopoietici (CD34 e CD45) e della molecola del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (HLA-DR) è quasi trascurabile, confermando l'assenza di cellule di linea ematopoietica nella coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo enfatizza l'estrazione, la coltura e la conservazione di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale attraverso la digestione enzimatica. Inoltre, dimostra il loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti, evidenziando l'importanza della precisione e della coerenza nel processo.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani

In the realm of regenerative medicine and therapeutic applications, stem cell research is rapidly gaining traction. Dental pulp stem cells (DPSCs), which ...

Inizia fissando il dente umano estratto in posizione con una pinza dentale. Quindi tagliare il dente utilizzando un disco diamantato collegato a un manipolo dentale e un refrigerante ad acqua. Utilizzando un escavatore dentale, rimuovere il tessuto pulpare dal dente.Successivamente, utilizzare una lama chirurgica sterile per tritare accuratamente il tessuto pulpare in piccoli frammenti. Quindi posizionare questi frammenti in un mini tritacarte con PBS per formare una miscela omogenea. Trasferire i frammenti di tessuto tritati in una provetta da 15 millilitri e digerirli utilizzando una miscela di collagenasi di tipo uno e dispasi.Incubare il tessuto nella miscela enzimatica a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, neutralizzare gli enzimi. Quindi, trasferire il fazzoletto digerito in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi scartare con cura il surnatante e risospendere il pellet in DMEM fresco, integrato con il 10-20% di FBS. Per la coltura cellulare, trasferire con cura la sospensione cellulare in un pallone di coltura di 25 centimetri quadrati. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.Dopo due o tre giorni, utilizzando una pipetta sierologica sterile, aspirare con cura il terreno e sostituirlo con un terreno nuovo. Successivamente, per la caratterizzazione delle DPSC, accendere il citometro a flusso e confermare la natura delle cellule staminali mesenchimali delle cellule isolate. Il successo della differenziazione delle DPSC in osteoblasti, adipociti e condrociti convalida la natura multipotente delle DPSC.Il tempo di raddoppio delle DPSC era coerente con quello riportato per le cellule staminali mesenchimali, suggerendo una popolazione cellulare sana e proliferativa. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che la maggior parte delle DPSC era positiva per CD-90, CD-73 e CD-105, confermando la loro identità come cellule staminali mesenchimali. Inoltre, meno del 2% delle cellule era positivo per CD-34, CD-45 e HLADR, confermando l'assenza di una significativa contaminazione delle cellule ematopoietiche o endoteliali.

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Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs)...

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Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

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Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.

Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

Coltura primaria di cellule staminali della polpa dentale

Le cellule staminali perivascolari (PSC) sono una nuova classe di cellule staminali per la rigenerazione tissutale scheletrico simili alle cellule staminali mesenchimali (MSC). CSP possono essere isolati mediante FACS (fluorescenza selezione cellulare attivata) da tessuto adiposo prelevati durante le normali procedure di liposuzione, poi combinato con un osteoinduttiva impalcatura per ottenere la formazione...

L&#39;uso di cellule staminali per la rigenerazione ossea perivascolari

Questo protocollo descrive lo sviluppo, l'espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Vi presentiamo un protocollo per studiare i biomarcatori di espressione di mRNA di cellule derivanti dal periostio (PDC) indotte da vitamina C (vitamina C) e 1,25-diidrossi-vitamina D [1,252D-3]. Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Impara l'isolamento e la coltura di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale umana mediante digestione enzimatica. Questo metodo consente la differenziazione in osteoblasti, adipociti e condrociti per applicazioni in medicina rigenerativa.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani

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