Name: Sviluppo e caratterizzazione di idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Scopri come sviluppare idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata per modelli organotipici del tessuto polmonare. Questo metodo ottimizza le proprietà meccaniche e biochimiche per l'ingegneria tissutale.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio per la ricerca scientifica e tecnologica della Turchia (TÜBİTAK) (sovvenzione n. 118C238). L'intera responsabilità della pubblicazione/articolo appartiene al proprietario della pubblicazione. Il sostegno finanziario ricevuto da TÜBİTAK non significa che il contenuto della pubblicazione sia approvato in senso scientifico da TÜBİTAK. Gli autori riconoscono con gratitudine l'uso dei servizi e delle strutture del Centro di ricerca per la medicina traslazionale dell'Università di Koç (KUTTAM). La Figura 1 e la Figura 2a sono state create utilizzando Biorender.com.

I polmoni autoctoni freschi di giovani (1-2 anni) donatori bovini sono stati ottenuti da un macello locale e trasportati in un contenitore di plastica sigillato su ghiaccio al laboratorio. Il sacrificio animale viene eseguito per il consumo generale di carne (polmoni scartati come rifiuti) e non è correlato o dovuto allo studio. Confermiamo che il macello è conforme alle leggi e ai regolamenti nazionali in materia di sacrifici animali. Inoltre, confermiamo di aver utilizzato solo materiale di scarto e che il progetto di ricerca non ha influito sul numero di animali sacrificati.
1. Prelievo di organi e preparazione dei tessuti
<ol><li>Conservare i tessuti polmonari bovini appena ottenuti a -80 °C fino all'esperimento.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, attendere che i tessuti polmonari congelati si scongelino a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sezionare i tessuti con bisturi sterili e forbici per rimuovere la trachea e le vie aeree cartilaginee e tritare ulteriormente in piccoli pezzi (5 mm3).</li>
	<li>Lavare accuratamente con acqua ultrapura contenente il 2% di penicillina/streptomicina (P/S) almeno 3 volte.</li>
</ol>2. Decellularizzazione dei tessuti
NOTA: I tessuti polmonari bovini nativi sono stati decellularizzati utilizzando due protocolli distinti.
<ol><li>Metodo di congelamento-scongelamento<ol><li>Preparare i campioni di tessuto in base al passaggio 1. Immergere i fazzoletti tritati in una soluzione di iodio al 2% in acqua distillata sterile (dH2O) per 1 min. Eseguire due lavaggi consecutivi in dH2O sterile.</li>
		<li>Trasferire i pezzi di tessuto tritato in una provetta da 50 mL fino al livello di 15 mL e implementare cinque cicli manuali di congelamento-scongelamento utilizzando un contenitore portatile di azoto liquido. Riempire le provette fino all'orlo con dH2O sterili e congelare le provette per 2 minuti in azoto liquido. Dopo 2 minuti, trasferirli immediatamente a bagnomaria a 37 °C per 10 minuti. Si tratta di 1 ciclo di gelo-disgelo.</li>
		<li>Incubare i campioni con 30 mL di soluzione di DNasi (10 U/mL) in tampone 10 mM MgCl2 (pH 7,5) per 1 ora a 37 °C sotto agitazione costante a 100 giri/min.</li>
		<li>Continuare con un lavaggio prolungato con dH2O sterile per 3 giorni agitando costantemente a 100 giri/min, con reintegro della soluzione ogni 24 ore.</li>
		<li>Eseguire la liofilizzazione e la criomacinazione come segue20: Congelare i campioni dECM umidi a -80 °C per 24 ore. Trasferire i campioni congelati in un liofilizzatore e operare in modalità di essiccazione sotto vuoto per 3 o 4 giorni fino a completa essiccazione. Al termine della liofilizzazione, eseguire la macinazione dei campioni in una forma di polvere fine utilizzando un apparecchio di macinazione e ghiaccio secco. NOTA: Questo stato di polvere fine è ritenuto necessario a causa delle sue proprietà di solubilità migliorate durante le fasi successive del processo di digestione.</li>
	</ol></li>
	<li>Metodo Triton-X-100<ol><li>Preparare i campioni di tessuto in base al passaggio 1. Trattare i tessuti polmonari con Triton-X-100 all'1% per 3 giorni in leggera rotazione a 4 °C. Sostituzione della soluzione ogni 24 ore.</li>
		<li>Incubare i campioni con soluzione di DNasi (10U/mL) in tampone 10 mM MgCl2 (pH 7,5) per 1 ora a 37 °C sotto agitazione costante.</li>
		<li>Proseguire con un lavaggio approfondito con dH2O sterile per 3 giorni a rotazione delicata, con reintegro della soluzione ogni 24 ore.</li>
		<li>Eseguire la liofilizzazione seguita dalla crio-macinazione come descritto al punto 2.1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Digestione della pepsina
<ol><li>Digerire campioni di dECM in polvere a una concentrazione di 15 mg/mL (p/v) in soluzione di pepsina (1 mg/mL di pepsina in HCl 0,01 M, pH 2). Eseguire il processo di digestione del campione a temperatura ambiente agitando costantemente per 48 ore e mantenere frequentemente il pH della soluzione per una digestione efficace.</li>
	<li>Trasferire i digestati in una provetta e centrifugare a 5000 x g per 10 min.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante e neutralizzarlo e tamponarlo in condizioni fisiologiche (pH 7, 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS)) attraverso l'aggiunta di 5M NaOH e 10x PBS. NOTA: Si consiglia di utilizzare soluzioni alcaline concentrate per la regolazione del pH del digestato acido, in quanto questo approccio evita un'espansione di volume indesiderata che potrebbe influire negativamente sulla gelificazione nelle fasi successive.</li>
	<li>Conservare i digestati pre-gel a −20 °C per ulteriori studi.</li>
</ol>4. Colorazione istologica
<ol><li>Fissare una piccola porzione (5mm3) di campione di tessuto decellularizzato in 1 mL di soluzione di formaldeide al 3,7% a 4 °C per una notte.</li>
	<li>Incubare i tessuti in provette contenenti 1 ml di soluzione di saccarosio al 30% in PBS per 12 ore a 4 °C su roccia stabile.</li>
	<li>Per incorporare i tessuti nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), versare 1 mL di OCT in un criostampo, posizionare il tessuto al centro del criostampo, quindi versare 2 ml di OCT sopra il tessuto.</li>
	<li>Posizionare i criostampi contenenti tessuti su ghiaccio secco e congelare a scatto utilizzando azoto liquido. I campioni sono pronti quando l'OCT diventa tutto bianco, il che di solito richiede 3 minuti. Conservare i fazzoletti OCT a -20 °C fino all'uso.</li>
	<li>Ottenere sezioni di 10 μm nel criostato a -25 °C su un vetrino rivestito di poli-L-lisina e trasferire il vetrino a temperatura ambiente per consentire alla sezione di tessuto di fondersi sul vetrino. Conservare i vetrini a -20 °C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Per confermare l'assenza di nuclei dopo la decellularizzazione, eseguire una colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) come descritto di seguito.<ol><li>Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 10 min. Immergere i vetrini in PBS e colorarli con 50 ml di soluzione di ematossilina pronta all'uso in un barattolo colorante per 3 minuti, seguita da un lavaggio di 3 minuti con acqua di rubinetto.</li>
		<li>Immergere i vetrini in etanolo al 95% e colorare con 50 ml di soluzione alcolica di eosina allo 0,5% in un barattolo colorante per 45 secondi.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la colorazione rosso Sirius per mostrare la ritenzione del contenuto di collagene dopo la decellularizzazione.<ol><li>Idratare i vetrini con PBS e immergerli in 50 ml di rosso Sirio allo 0,1% in una soluzione acquosa satura di acido picrico in un barattolo colorante per 1 ora.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini in una soluzione di acido acetico allo 0,5% per 5 secondi e disidratare tutti i vetrini immergendoli in etanolo al 70%, 95% e 100% in sequenza per 1 minuto ciascuno.</li>
	</ol></li>
	<li>Per analizzare il contenuto di sGAG nei campioni di tessuto, eseguire la colorazione blu Alcian come descritto di seguito.<ol><li>Immergere i vetrini in 50 ml di blu di Alcian all'1% in una soluzione di acido acetico al 3% (pH 2,5) in un barattolo colorante per 30 minuti. Lavare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 2 min.</li>
		<li>Disidratare tutti i vetrini immergendoli in etanolo al 70%, 95% e 100% in sequenza per 1 minuto ciascuno.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 0,1 mL di terreno di montaggio sopra i campioni e visualizzare utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 10x.</li>
</ol>5. Caratterizzazione meccanica
<ol><li>Implementare misure reologiche oscillatorie utilizzando un reometro con geometria a piastre parallele.</li>
	<li>Versare 250 μL di soluzione pre-gel mantenuta in ghiaccio su una piastra inferiore preraffreddata (4 °C) per evitare una rapida gelificazione.</li>
	<li>Abbassare la piastra parallela di 20 mm fino a quando la soluzione pre-gel forma un disco con una distanza di 1 mm tra le due piastre.</li>
	<li>Avviare immediatamente la misurazione. Misurare i moduli di stoccaggio e perdita nel tempo con una frequenza e una deformazione fisse mentre si riscalda la piastra inferiore a 37 °C per 30 minuti per osservare la cinetica di gelificazione. Utilizzare una frequenza fissa di 0,5 Hz e una deformazione dello 0,1%.</li>
	<li>Eseguire un test di recupero dello scorrimento dopo che il valore del modulo di memorizzazione smette di aumentare e raggiunge un plateau.</li>
	<li>Applicare una sollecitazione di taglio di 1 Pa all'idrogel per 15 minuti, misurare la deformazione, scaricare il campione dalla sollecitazione e registrare la variazione del valore di deformazione per 15 minuti.</li>
	<li>Disegna un grafico della tensione in funzione del tempo per mostrare il comportamento di rilassamento dello stress. Ripetere le misurazioni per tre diversi digest dECM come repliche.</li>
</ol>

Studio comparativo delle tecniche di decellularizzazione per idrogel ECM polmonari bovini

<ol><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+micropattern+arrays+fabricated+by+lung-derived+dECM+hydrogels+for+chemotherapeutic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening.</a> Mater Today Bio. 15, 100274(2022).</li>
<li>Ulldemolins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels-derived+vesicles+contribute+to+epithelial+lung+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair.</a> Polymers. 14 (22), 4907(2022).</li>
<li>Biehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+standardized+multi-tissue+decellularization+protocol+for+the+derivation+of+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials.</a> Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cartilage+in+human+knee+osteoarthritis+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells+and+autologous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix.</a> Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).</li>
<li>Spang, M. T., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22In+vivo+applications+and+development.Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel therapies.</a> In vivo applications and development.Acta Biomater. 68, 1-14 (2018).</li>
<li>Schwartz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomaterial+screening+approach+reveals+microenvironmental+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance.</a> Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).</li>
<li>Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+3D+in+vitro+tumor+models+for+screening+cell+aggregation+mediated+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response.</a> Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).</li>
<li>Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+extracellular+matrix+accumulated+by+mesenchymal+stem+cells+during+in+vitro+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion.</a> Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).</li>
<li>Bual, R. P., Ijima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+extracellular+matrix+component+promotes+maintenance+of+liver-specific+functions+and+larger+aggregates+formation+of+primary+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes.</a> Regen Ther. 11, 258-268 (2019).</li>
<li>Jhala, D., Vasita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+extracellular+matrix+mimicking+strategies+for+an+artificial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Poly+Rev%22%5BJournal%5D)">A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche.</a> Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).</li>
<li>Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+detergent+type+on+the+performance+of+liver+decellularized+extracellular+matrix-based+bio-inks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks.</a> J Tissue Eng. 12, 2041731421997091(2021).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+printing+scaffold+with+porcine+skin+decellularized+bio-ink+for+soft+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering.</a> Materials. 13 (16), 3522(2020).</li>
<li>Won, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+dermal+substitute+using+decellularized+dermis+extracellular+matrix+derived+bio-ink%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink.</a> Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogel+microspheres+fabricated+using+a+temperature-controlling+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).</li>
<li>Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinvasive+extracellular+matrix+remodeling+for+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression.</a> Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+extracellular+matrix+and+its+molecular+and+cellular+regulators+in+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity.</a> Front Oncol. 8, 431(2018).</li>
<li>Takeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+system+using+three-dimensional+cardiac+tissues+containing+multiple+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types.</a> Sci Rep. 11 (1), 5654(2021).</li>
<li>Jensen, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific%2C+fibroblast-derived+matrix+as+a+tool+for+studying+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3331(2021).</li>
<li>Kuşoğlu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decellularization+methods+in+bovine+lung+tissue+reveals+distinct+biochemical+composition%2C+stiffness%2C+and+viscoelasticity+in+reconstituted+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).</li>
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<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+tunable+stress+relaxation+regulate+stem+cell+fate+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Gli idrogel derivati da organi sono diventati modelli promettenti che ricapitolano l'ECM tissutale nativa e imitano la funzione cellulare organotipica. Sebbene l'ECM polmonare decellularizzata sia stata spesso utilizzata nell'ingegneria tissutale, una caratterizzazione approfondita della composizione del biomateriale e delle proprietà meccaniche favorirà una migliore comprensione di come le interazioni cellula-ECM possono essere modulate per modellare i processi biologici durante l'omeostasi o la malattia. In particolare...

Le condizioni convenzionali di coltura monostrato non offrono una rappresentazione fedele dei microambienti tissutali nativi e non sono in grado di fornire un'impalcatura tridimensionale (3D) con ligandi istruttivi che consentano le interazioni cellula-matrice e cellula-cellula1. La composizione della matrice extracellulare (ECM) e le proprietà meccaniche sono altamente tessuto-specifiche, tempo-dipendenti e subiscono alterazioni in condizioni patologiche. Pertanto, c'è bisogno di modelli tissutali 3D biomimetici che consentano la sintonizzabilità di tali caratteristiche, la modulazione del comportamento cellulare e il raggiungimento della funzionalità tissutale desiderata. I biomateriali nativi derivati dall'ECM attirano molta attenzione nell'ingegneria tissutale con la possibilità di utilizzare direttamente l'ECM 1,2,3,4,5 tessuto-specifico. I vettori basati su ECM sono stati utilizzati in molte applicazioni che vanno dalla rigenerazione tissutale allo sviluppo di modelli di malattia. Sono utilizzati come scaffold di biomateriali iniettabili o impiantabili 4,5, in applicazioni di screening farmacologico 6,7, nello sviluppo di materiali che inducono la crescita cellulare 8,9,10, come bio-inchiostri 11,12,13, in microfluidica 14 e in modelli di tessuto tumorale 15,16,17,18,19.
La decellularizzazione di tessuti e organi è un approccio popolare per la generazione di scaffold che imitano l'ECM tessuto-specifica. La ricostituzione di tessuti e organi decellularizzati in idrogel consente l'inclusione di cellule in modelli tissutali biomimetici3D 20. Le tecniche di decellularizzazione si concentrano principalmente sull'eliminazione dei componenti cellulari mantenendo la composizione dell'ECM. Metodi fisici come i cicli di gelo-disgelo o processi chimici come il trattamento Triton-X-100 sono comunemente applicati per decellularizzare i tessuti. Inoltre, il trattamento con DNasi è preferito per la rimozione del DNA residuo per ridurre al minimo le risposte immunologiche all'inclusione cellulare. È fondamentale ottenere la massima rimozione cellulare e la minima compromissione dell'ECM per ottimizzare le procedure di decellularizzazione21. Oltre a questi aspetti, la caratterizzazione delle proprietà biochimiche e meccaniche degli scaffold ricostituiti, tra cui la viscoelasticità e la rigidità, è fondamentale per migliorare i modelli tissutali 3D ingegnerizzati derivati da matrici native20.
L'ECM organo-specifica nell'ingegneria del tessuto polmonare consente di imitare il microambiente polmonare per modellare processi di sviluppo, omeostatici o patologici in vitro e testare terapie in un ambiente fisio-mimetico 20,22,23. Studi precedenti hanno dimostrato la decellularizzazione del tessuto polmonare di diverse specie, come ratti, suini ed esseri umani, ma questi metodi devono ancora essere adattati a specie meno utilizzate come i bovini. Una migliore comprensione dei parametri del processo di decellularizzazione e di come influenzano gli scaffold ECM ricostituiti risultanti per quanto riguarda la composizione biochimica e le proprietà meccaniche consentirà una migliore messa a punto di tali aspetti e aprirà la strada a modelli tissutali più affidabili in salute e malattia. In questo studio, la decellularizzazione del polmone bovino con due metodi distinti, cicli di gelo-disgelo e trattamento con Triton-X-100, è esplicitamente descritta e seguita da analisi biochimiche e meccaniche di idrogel ECM polmonari decellularizzati (dECM). I risultati rivelano che entrambi i metodi producono un'efficace decellularizzazione e ritenzione dei ligandi ECM. In particolare, la scelta del metodo altera significativamente la rigidità e la viscoelasticità risultanti degli idrogel ricostituiti. Gli idrogel derivati dalla dECM bovina dimostrano notevoli analogie biochimiche con la matrice extracellulare del polmone umano e presentano caratteristiche di gelificazione termica affidabili20. Come descritto in precedenza, entrambi i metodi sono adatti per la coltura 3D di cellule tumorali polmonari, cellule epiteliali bronchiali sane e organoidi polmonari derivati da pazienti20.

<table><tbody><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>ISOLAB</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>ISOLAB</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu alciano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8438</td><td></td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi I da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Reometro Discovery HR-2</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di eosina</td><td>Bright-slide</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr>Scienze della <td>microscopia elettronica</td> della<td>formaldeide</td><td>50-980-485</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Iodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante per ematossilina di Mayer</td><td>Merck</td><td>2.BS01-103-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>compound Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina da mucosa gastrica suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Acido picrico</td><td>Polysciences</td><td>88-89-1</td><td></td></tr><tr><td>Rosso</td> <td>SirioPolysciences</td><td>09400-25</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Merck</td><td>112298</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo e caratterizzazione di idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

L'uso di idrogel derivati dalla matrice extracellulare (ECM) nell'ingegneria tissutale è diventato sempre più popolare, in quanto possono imitare l'ambiente naturale delle cellule in vitro. Tuttavia, mantenere il contenuto biochimico nativo dell'ECM, raggiungere la stabilità meccanica e comprendere l'impatto del processo di decellularizzazione sulle proprietà meccaniche degli idrogel dell'ECM sono impegnativi. In questo studio, sono stati descritti una pipeline per la decellularizzazione del tessuto polmonare bovino utilizzando due diversi protocolli, la caratterizzazione a valle dell'efficacia della decellularizzazione, la fabbricazione di idrogel ECM polmonari decellularizzati ricostituiti e la valutazione delle loro proprietà meccaniche e di citocompatibilità. La decellularizzazione del polmone bovino è stata perseguita utilizzando un metodo fisico (cicli di gelo-disgelo) o chimico (a base di detergenti). La colorazione con ematossilina ed eosina è stata eseguita per convalidare la decellularizzazione e la ritenzione dei principali componenti dell'ECM. Per la valutazione del contenuto residuo di collagene e glicosaminoglicani solfatati (sGAG) all'interno dei campioni decellularizzati, sono state impiegate rispettivamente le tecniche di colorazione del rosso Sirio e del blu Alciano. Le proprietà meccaniche degli idrogel ECM polmonari decellularizzati sono state caratterizzate dalla reologia oscillatoria. I risultati suggeriscono che gli idrogel polmonari bovini decellularizzati possono fornire un'alternativa organotipica<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> affidabile ai prodotti ECM commerciali, conservando la maggior parte dei componenti nativi dell'ECM. Inoltre, questi risultati rivelano che il metodo di decellularizzazione scelto influisce in modo significativo sulla cinetica di gelificazione, nonché sulla rigidità e sulle proprietà viscoelastiche degli idrogel risultanti.

Decellularizzazione La decellularizzazione del tessuto polmonare bovino per produrre idrogel dECM che ricapitolerebbero il microambiente polmonare nativo è stata ottenuta sia con metodi fisici (congelamento-disgelo) che chimici (Triton-X-100). Dopo la dissezione, i pezzi di tessuto sono stati lavati in antibiotici contenenti dH2O per rimuovere gli agenti patogeni che possono successivamente influenzare la sterilità degli idrogel dECM. Un totale di cinque cicli alternati tra azoto liquido e ...

Il protocollo chiarisce due distinte metodologie di decellularizzazione applicate ai tessuti polmonari bovini nativi, fornendo un resoconto completo delle rispettive caratterizzazioni.

Sviluppo e caratterizzazione di idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...

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Abbiamo sviluppato una matrice extracellulare del polmone decellularized e bioreattore romanzo biomimetici che può essere utilizzato per generare il tessuto funzionale del polmone. Con la semina delle cellule e nella matrice coltura nel bioreattore, generiamo tessuto che dimostra efficace scambio di gas quando trapiantate in vivo per brevi periodi di tempo.

Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

Questo video descrive una tecnica di derivazione di idrogel di matrice extracellulare decellularizzando cuscinetti adiposi mammari murini a seguito di irradiazione ex vivo per studi in vitro. Questo idrogel aiuta a imitare l'ambiente del tessuto mammario in vivo dopo il trattamento con radiazioni per studiare il comportamento delle cellule tumorali.

Decellularizzazione dei cuscinetti adiposi mammari: derivazione di idrogel di matrice extracellulare dai cuscinetti adiposi mammari

Questo protocollo dirige in modo efficiente topo staminali embrionali derivato dalle cellule endoderma definitivo per maturare delle vie aeree cellule epiteliali. Questa tecnica utilizza differenziazione 3-dimensionale impalcature polmone decellularized di indirizzare specifiche lignaggio del polmone, in un ambiente culturale privo di siero definito.

Generazione di cellule di topo Airway epiteliali ESC-derivati ​​dall&#39;uso di decellularized Lung Ponteggi

Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

La matrice extracellulare tessuto-specifico (ECM) è un mediatore chiave della funzione delle cellule. Questo articolo descrive metodi per sintetizzare schiume e microcarriers che sono stabili in coltura senza la necessità di reticolazione chimica per applicazioni in 3D avanzata in colture di cellule in vitro o come bioscaffolds pro-rigenerativi ECM-derivato puri.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Questo protocollo descrive la completa decellularizzazione di miocardio umano pur conservando le sue componenti della matrice extracellulare. Ulteriore elaborazione dei risultati nella produzione di microparticelle e un idrogel autoassemblanti cytoprotective matrice extracellulare.

Lavorazione di tessuto cardiaco umano verso la matrice extracellulare autoassemblanti idrogel per In Vitro e In Vivo applicazioni

Qui presentiamo un protocollo per fabbricare un rene corteccia extracellulare derivata matrice idrogel per mantenere la composizione strutturale e biochimica del rene nativo di matrice extracellulare (ECM). Il processo di fabbricazione e le sue applicazioni sono descritte. Infine, una prospettiva sull'utilizzo questo idrogel per supportare la bioingegneria e la rigenerazione cellulare e tessutale del rene-specifici è discussa.

Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel di cuscinetti di grasso mammari a seguito di irradiazione ex vivo.

Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare

Questo protocollo descrive un metodo per generare tessuti polmonari ingegnerizzati riproducibili su piccola scala, ripopolando fette polmonari decellularizzate tagliate con precisione con cellule epiteliali alveolari di tipo 2, fibroblasti e cellule endoteliali.

Tessuti polmonari ingegnerizzati preparati da fette di polmone decellularizzate

Questo articolo introduce un nuovo metodo per la sintesi di idrogel di matrice extracellulare di cartilagine decellularizzata (DC-ECM). Gli idrogel DC-ECM hanno un'eccellente biocompatibilità e forniscono un microambiente superiore per la crescita cellulare. Pertanto, possono essere scaffold cellulari ideali e sistemi di rilascio biologico.

Sintesi di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata

Presentato qui è un protocollo per l'isolamento del tessuto polmonare decellularizzato regionale. Questo protocollo fornisce un potente strumento per studiare le complessità nella matrice extracellulare e nelle interazioni cellula-matrice.

Dissezione e isolamento del tessuto polmonare decellularizzato specifico per regione

Scopri come sviluppare idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata per modelli organotipici del tessuto polmonare. Questo metodo ottimizza le proprietà meccaniche e biochimiche per l'ingegneria tissutale.

Sviluppo e caratterizzazione di idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata

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