Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane
1 dicembre 2023
Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).
Lo scopo della nostra ricerca è quello di purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane, utilizzando senza modificazioni genetiche. Ci proponiamo di affrontare il problema del rischio tumorigenico associato alle cellule indifferenziate, tra quelle differenziate dalle cellule iPS umane. Una delle attuali sfide sperimentali è la bassa purezza delle celle, dovuta allo stoccaggio meccanico della cernita.
Stiamo sviluppando un nuovo metodo di purificazione, che utilizza le caratteristiche uniche del metabolismo degli epatociti, per una purificazione su larga scala. Un metodo di selezione non cellulare per le cellule progenitrici epatiche non può ottenere epatociti puri. Un altro per gli epatociti maturi può trattare solo una piccola frazione di epatociti, a causa della limitata espressione della proteina marcatrice.
Al contrario, il nostro approccio può ottenere epatociti a diversi livelli di maturazione con un'età più alta. Gli epatociti derivati da cellule iPS umane sono estremamente immaturi e mostrano un'espressione più ridotta delle macro epatocitarie dopo la purificazione. Il nostro obiettivo futuro è quello di migliorare la modulazione degli epatociti utilizzando la tecnologia organoidale e i progressi quotidiani verso la medicina rigenerativa e la scoperta di farmaci.
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Panoramica
Questo studio affronta la purificazione di epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane mediante un nuovo metodo di selezione cellulare, evitando modificazioni genetiche. La ricerca sottolinea la necessità di superare sfide come la bassa vitalità cellulare durante la selezione e mira a ottenere un rendimento maggiore di epatociti maturi per applicazioni nella medicina rigenerativa e nella scoperta di farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia delle cellule staminali
- Differenziamento delle cellule epatiche
- Tecnologie di separazione cellulare
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti hanno un potenziale nella medicina rigenerativa.
- Le cellule indifferenziate residue rappresentano rischi di tumorigenesi.
- I metodi attuali presentano carenze di efficienza nel ottenere epatociti puri.
Metodi Utilizzati
- Sorta cellulare attivata da fluorescenza (FACS)
- Cellule staminali pluripotenti indotte umane
- Tecniche di vitalità cellulare e colorazione
Risultati principali
- Il metodo ha permesso di ottenere epatociti maturi con elevata purezza (97%).
- La vitalità cellulare è stata migliorata, risolvendo i problemi legati allo stress meccanico associato al sorting.
- Popolazioni pure di cellule simili a epatociti hanno dimostrato una morfologia caratteristica.
Conclusioni
- Questo studio dimostra l'efficacia di un nuovo metodo di selezione per ottenere epatociti puri da cellule staminali.
- I risultati sono rilevanti per migliorare le strategie di medicina rigenerativa e gli sforzi di scoperta di farmaci.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La purificazione degli epatociti derivati da iPSC umane rappresenta un punto critico sia per la medicina rigenerativa che per la scoperta preclinica di farmaci, poiché le cellule indifferenziate residue comportano rischi di tumorigenesi. Il protocollo descritto basato su FACS sfrutta la colorazione mitocondriale e la selezione del marcatore superficiale ALCAM per ottenere popolazioni di epatociti ad alta purezza, senza modificazioni genetiche. Ciò consente applicazioni successive più sicure e supporta una maggiore affidabilità nella modellizzazione delle malattie e nella valutazione di composti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la validazione funzionale della differenziazione degli epatociti da cellule staminali pluripotenti.
- Riduce l'ambiguità biologica isolando popolazioni di epatociti maturi per studi meccanicistici.
- Permette una maggiore affidabilità predittiva nell'analisi dell'interazione con il bersaglio e delle vie metaboliche mediante l'uso di cellule purificate.
Screening e sviluppo di saggi
- Fornisce popolazioni standardizzate di epatociti ad alta purezza per lo sviluppo di saggi riproducibili.
- Permette la valutazione quantitativa di marcatori specifici degli epatociti, come l'espressione dell'albumina.
- Consente uno screening affidabile di composti riducendo al minimo la contaminazione da cellule indifferenziate o non epatocitarie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Migliora la modellizzazione rilevante per le malattie fornendo epatociti funzionalmente validati per studi di tossicità e metabolismo.
- Permette l'allineamento traslazionale dei biomarcatori attraverso un'espressione costante del fenotipo cellulare e dei marcatori.
- Riduce il rischio nell'avanzamento preclinico garantendo purezza della popolazione cellulare e maturità funzionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di purificazione basato sulla FACS si integra nel percorso di scoperta, dalla differenziazione delle cellule staminali all'identificazione del composto guida e alla validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico isolando epatociti maturi da colture eterogenee.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari pronte per i saggi e riproducibili per la valutazione di composti successivi.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa dell'albumina e di altri marcatori degli epatociti per confrontare le condizioni di differenziazione.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità per studi preclinici che richiedono epatociti umani validati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro scalabile e non genetico adattabile ad altre linee cellulari derivate da cellule staminali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi basati su epatociti.
- Valore operativo: Standardizza la purificazione, migliora la riproducibilità e favorisce la scalabilità per studi di maggiori dimensioni.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei percorsi di rigenerazione e scoperta di farmaci.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio fornendo popolazioni cellulari ad alta purezza e funzionalmente validate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nell'uso del FACS e nell'analisi dell'immunomarcatura.
- Richiede l'accesso a strumentazione avanzata per il sorting cellulare e a infrastrutture analitiche adeguate.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le strategie di gating e la validazione dei marcatori.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse linee di iPSC o protocolli di differenziazione.
- La vitalità cellulare può essere compromessa dallo stress meccanico durante il sorting e deve essere ottimizzata.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Introduction
1:34
Hepatic Differentiation of Human‐Induced Pluripotent Stem Cells in 2D Cultures
3:52
Cell Preparation for Purification of Human‐Induced Pluripotent Stem Cells‐Derived Hepatocytes
6:44
Fluorescence&‐Activated Cell Sorting of Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells
