Name: Modello murino di espianto dellarto posteriore per lo studio della meccanobiologia del conflitto del tendine dAchille (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Esplora la meccanobiologia del conflitto del tendine d'Achille utilizzando un modello murino di espianto dell'arto posteriore. Questo metodo consente di studiare i pattern di deformazione meccanica multiasse e i meccanismi molecolari della formazione fibrocartilaginea.

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Gli autori sono grati per il supporto e l'assistenza forniti da Jeff Fox e Vidya Venkatramani del Centro per la ricerca muscoloscheletrica dell'Università di Rochester per l'istologia, la biochimica e l'imaging molecolare (HBMI) Core, finanziato in parte da P30AR06965. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare il Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) presso l'Università di Rochester Medical Center per l'assistenza con la microscopia multifotone. Questo studio è stato finanziato da R01 AR070765 e R01 AR070765-04S1, nonché da 1R35GM147054 e 1R01AR082349.

Comprensione dell'impingement tendineo - Modello di espianto murino per lo studio della meccanobiologia

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La piattaforma sperimentale di espianto dell'arto posteriore murino abbinata al protocollo di coltura tissutale descritto in questo studio fornisce un modello adatto per studiare la meccanobiologia della formazione di fibrocartilagine guidata dal conflitto all'inserzione del tendine d'Achille. L'utilità di questo modello di espianto è dimostrata dai risultati rappresentativi, che indicano il mantenimento della vitalità cellulare in concomitanza con un cambiamento significativo e spazialmente eterogeneo nella colorazione ...

Una moltitudine di tendini, tra cui il tendine d'Achille e i tendini della cuffia dei rotatori, subiscono un conflitto osseo a causa del normale posizionamento anatomico1,2,3,4. L'impingement tendineo genera una deformazione di compressione diretta trasversalmente all'asse longitudinale della fibra5,6,7. Le regioni di conflitto tendineo dimostrano un fenotipo unico della fibrocartilagine in cui le cellule rotonde e rimpicciolite (fibrocondrociti) sono incorporate all'interno di una rete di collagene disorganizzata con un contenuto di glicosaminoglicani (GAG) marcatamente aumentato2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Studi precedenti suggeriscono che il disparato ambiente meccanico prodotto dall'impingement tendineo sostiene questa matrice ricca di gag guidando la deposizione di grandi proteoglicani aggreganti, in particolare l'aggrecano, anche se i meccanismi sottostanti non sono chiari1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Mentre la fibrocartilagine è una caratteristica normale nelle regioni colpite dei tendini sani, il metabolismo aberrante dei proteoglicani associato all'eccessiva formazione di fibrocartilagine è una caratteristica distintiva della tendinopatia, una malattia comune e debilitante che emerge in modo sproporzionato nei tendini cronicamente impattati1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Di conseguenza, l'impingement tendineo è clinicamente riconosciuto come un importante fattore estrinseco alla base di molte delle tendinopatie più comuni, tra cui la malattia della cuffia dei rotatori e la tendinopatia inserzionale del tendine d'Achille (IAT)50,51,52. Attualmente, il trattamento della tendinopatia è inefficiente. Ad esempio, circa il 47% dei pazienti con IAT richiede un intervento chirurgico dopo una gestione conservativa fallita, con esiti postoperatori variabili53,54,55,56. Nonostante l'apparente relazione tra impingement e tendinopatia, i meccanismi meccanobiologici attraverso i quali le cellule nel tendine impattato percepiscono e rispondono al loro ambiente meccanico sono scarsamente descritti, il che oscura la comprensione della patogenesi della tendinopatia e si traduce in un trattamento inadeguato.
I modelli di espianto sono strumenti utili nello studio della meccanobiologia tendinea57,58. Come primo passo verso la comprensione della meccanobiologia dell'impingement tendineo, diversi studi precedenti hanno esplorato la risposta cellulare in seguito all'applicazione di una semplice compressione uniassiale alle cellule o agli espianti di tendiniasportati 27,29,30,31,32,33,34,39. Tuttavia, le cellule in vitro mancano di matrici extracellulari e pericellulari che facilitano il trasferimento di ceppi, sequestrano importanti fattori di crescita e citochine rilasciate dalla deformazione meccanica e forniscono substrato per complessi di adesione focale che svolgono un ruolo nella meccanotrasduzione57,59. Inoltre, sia gli studi in vitro che quelli con espianto asportato non riescono a ricapitolare l'ambiente di deformazione meccanica multiassiale generato dall'impingement tendineo in vivo, che dipende dalle caratteristiche anatomiche della regione impattata 5,6. Nel contesto dell'inserzione del tendine d'Achille impattata, ciò include i tessuti circostanti come la borsa retrocalcaneare e il cuscinetto adiposo 60,61,62,63 di Kager. Al contrario, i modelli in vivo di impingement tendineo 25,28,36,37,38,64,65,66 consentono un controllo minimo sull'entità e sulla frequenza del carico applicato direttamente al tendine, che è una limitazione ben nota dei modelli in vivo per lo studio della meccanobiologia tendinea 57,58,67,68,69,70. Date le sfide nella misurazione della deformazione tendinea in vivo, l'ambiente di deformazione interna generato all'interno di questi modelli è spesso scarsamente caratterizzato.
In questo manoscritto, presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata che ricrea l'impingement dell'inserzione del tendine d'Achille sul calcagno all'interno di espianti dell'arto posteriore murino intero che, se abbinato a questo protocollo di coltura tissutale, mantiene la vitalità per 7 giorni in coltura di espianto e consente lo studio delle sequele biologiche dell'impingement tendineo. La piattaforma è costruita su una base di acido polilattico (PLA) stampata in 3D che fornisce la base per il fissaggio delle impugnature e l'inserto di riduzione del volume in PLA stampato in 3D. Le impugnature vengono utilizzate per bloccare la parte superiore della gamba e il ginocchio prossimale alla giunzione miotendinea di Achille con l'aspetto caudale dell'arto posteriore rivolto verso l'alto, consentendo di visualizzare il tendine d'Achille dall'alto utilizzando una sonda a ultrasuoni o un microscopio invertito (Figura 1A). L'inserto di riduzione del volume scorre lungo un binario sulla base e riduce il volume richiesto dei terreni di coltura tissutale. Una linea intrecciata avvolta attorno alla zampa posteriore viene instradata fuori dalla piattaforma utilizzando il design della base e una clip in PLA stampata in 3D. Tirando la corda, la zampa posteriore viene dorsiflessa e l'inserzione del tendine d'Achille viene urtata contro il calcagno, con conseguente elevata deformazione di compressione trasversale 5,6 (Figura 1A). La piattaforma è contenuta all'interno di un bagno acrilico che mantiene gli espianti dell'arto posteriore immersi nei terreni di coltura tissutale. Fissando la corda tesa all'esterno della vasca con nastro adesivo si mantiene la flessione dorsale della caviglia per produrre un impatto statico dell'inserzione del tendine d'Achille. I file CAD per i componenti stampati in 3D sono forniti in più formati (File supplementare 1), consentendo l'importazione in una gamma di software CAD commerciali e gratuiti open source per la modifica in base alle esigenze sperimentali. Se l'accesso alle stampanti 3D non è disponibile per la fabbricazione, i file CAD possono essere forniti ai servizi di stampa 3D online che stamperanno e spediranno le parti a basso costo.
È importante sottolineare che il complesso muscolotendineo tricipite surale-achille si estende su entrambe le articolazioni del ginocchio e della caviglia 71,72,73. Di conseguenza, la tensione di trazione nel tendine d'Achille è influenzata dalla flessione del ginocchio. L'estensione del ginocchio mette in tensione il tendine d'Achille, mentre la flessione del ginocchio riduce la tensione. Estendendo prima il ginocchio e poi flettendo passivamente la caviglia, le deformazioni di compressione all'inserzione impattata possono essere sovrapposte alle deformazioni di trazione. Al contrario, flettendo passivamente la caviglia con il ginocchio flesso, la tensione di trazione si riduce e la tensione di compressione rimane. L'attuale protocollo esplora tre di queste condizioni. 1) Per l'impingement statico, il piede viene piegato dorsalmente a < 110° rispetto alla tibia per ostacolare l'inserimento, con il ginocchio flesso per ridurre la tensione. 2) Per il gruppo di tensione basale, la caviglia viene estesa oltre i 145° di flessione dorsale con il ginocchio esteso, generando una tensione di trazione prevalente all'inserzione. 3) Per il gruppo scarico, gli espianti vengono coltivati in una capsula di Petri con il ginocchio e la caviglia in posizione neutra in assenza di carico applicato esternamente. Gli angoli di cui sopra sono misurati fotograficamente rispetto a un sistema di coordinate in cui il piede e la tibia sono paralleli con un angolo di 180° e perpendicolari con un angolo di 90°.
Le fasi chiave del protocollo includono: 1) la dissezione degli espianti degli arti posteriori e l'attenta rimozione della cute e del tendine plantare; 2) coltura di espianto dopo un pretrattamento di 48 ore con desametasone; 3) sezionamento tissutale e colorazione istologica; e 4) analisi dell'immagine a colori per valutare la formazione di fibrocartilagine. Dopo la dissezione, ogni espianto dell'arto posteriore viene pretrattato per 48 ore in terreni di coltura integrati con desametasone74. Gli arti controlaterali di ciascun topo vengono assegnati a gruppi sperimentali separati per il confronto a coppie, che aiuta a controllare la variabilità biologica. Dopo il pretrattamento, gli espianti vengono posizionati su piattaforme come descritto sopra e coltivati per altri 7 giorni (Figura 1B). Ulteriori confronti vengono effettuati con un gruppo pretrattato (giorno 0) in cui gli espianti vengono rimossi immediatamente dopo il pretrattamento di 48 ore.
Dopo la coltura dell'espianto, gli arti posteriori vengono tagliati, fissati in formalina, decalcificati e incorporati in paraffina. Il sezionamento seriale in orientamento sagittale fornisce la visualizzazione del tendine d'Achille dalla giunzione miotendinea all'inserzione calcaneare, consentendo al contempo di monitorare la profondità della sezione attraverso l'intero tendine. La marcatura dUTP X-nick mediata dalla deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) (TUNEL) viene utilizzata per visualizzare il danno al DNA secondario all'apoptosi e valutare la vitalità. L'istologia del blu di toluidina e l'analisi dell'immagine a colori personalizzata vengono eseguite per quantificare i cambiamenti nella colorazione GAG. Le sezioni di tessuto colorate con blu di toluidina vengono quindi utilizzate per l'imaging SHG per caratterizzare le alterazioni nell'organizzazione delle fibre del collage (Figura 1B).
I risultati rappresentativi forniti suggeriscono un'alterata colorazione istologica della matrice ricca di gag e la disorganizzazione della rete di collagene extracellulare generata da 7 giorni di impingement statico all'interno del modello. Questo modello può essere utilizzato per esplorare i meccanismi molecolari alla base del cambiamento fibrocartilagineo guidato dall'impingement.

<table><tbody><tr><td>Sottocuscinetti assorbenti</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Per la dissezione da banco</td></tr><tr><td>Bagno acrilico</td><td>Fonte Uno</td><td>X001G46CB1</td><td>Contiene la piattaforma di espianto immersa in terreni di coltura</td></tr><tr><td>Contenitore per autoclave</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-361-20</td><td>Utilizzato come contenimento secondario, contiene due piattaforme</td></tr><tr><td>Base</td><td>-</td><td>-</td><td>Stampato in 3D da file CAD forniti come file supplementari</td></tr><tr><td>Linea intrecciata</td><td>KastKing</td><td>30lb test</td><td>Utilizzato per avvolgere la zampa e applicare la dorsiflessione della caviglia</td></tr><tr><td>Clip</td><td>-</td><td>-Stampato</td> <td>in 3D da file CAD forniti come file supplementari</td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-034</td><td>Rettangolare, n. 2, 50 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>VWR</td><td>8312-4</td><td>Mezzi di montaggio a base di xilene per il montaggio di vetrini Tessuto colorato di toluidina blu sezioni</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>MP Biomedical LLC</td><td>194561</td><td>CAS#50-02-2</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO), anidro</td><td>Invitrogen di ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>CAS#67-68-5, utilizzare per solubilizzare il desametasone in soluzioni madre concentrate</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>Scotch Brand</td><td>34-8724-5195-9</td><td>Per attaccare la carta vetrata alle piastre di presa</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td><td>Gibco di ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>glucosio alto, (-) piruvato, (+) glutammina</td></tr><tr><td>EDTA sale tetrasodico diidrato</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J15700. A1</td><td>CAS#10378-23-1, utilizzato per produrre una soluzione EDTA al 14% per la decalcificazione del campione</td></tr><tr><td>Etanolo, 200 proof</td><td>Thermo Scientific</td><td>T038181000</td><td>CAS#64-17-5, 1 L di alimentazione</td></tr><tr><td>Tamponi per biopsia in schiuma</td><td>Leica</td><td>3801000</td><td>Utilizzato con le cassette di lavorazione, aiuta a mantenere le articolazioni della caviglia nella posizione desiderata durante la fissazione e la decalcificazione</td></tr><tr><td>Pinze, #SS Standard Inox</td><td>Dumont</td><td>11203-23</td><td>Dritto, liscio, fine punte</td></tr><tr><td>Pinze, Micro-Adson 4.75"</td><td>Fisherbrand</td><td>13-820-073</td><td>Punte dritte e fini con denti seghettati</td></tr><tr><td>Carta vetrata granato, grana 50-D</td><td>Norton</td><td>M600060 01518</td><td>O altra carta vetrata a grana grossa</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td>CAS#64-19-7, per la regolazione del pH del tampone acetato di sodio utilizzato per l'istologia del blu di toluidina, nonché la soluzione di decalcificazione EDTA al 14%</td></tr><tr><td>Impugnature</td><td>ADMET</td><td>GV-100NT-A4</td><td>Le morse, le viti e le molle in acciaio inossidabile descritte nel protocollo sono incluse</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio adesivi Histobond</td><td>VWR</td><td>16005-108</td><td>Le sezioni sagittali degli espianti degli arti posteriori aderiscono in modo affidabile a questi vetrini attraverso tutti i protocolli di colorazione</td></tr> Kit di <tr><td>rilevamento della morte cellulare in situ, test TMR Red</td><td>Roche 12156792910</td><td></td><td>TUNEL</td></tr><tr><td>Nastro di etichettatura</td><td>Fisherbrand</td><td>15-959</td><td>O qualsiasi altro nastro di etichettatura di preferenza</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td>CAS#50-81-7, per la formulazione di terreni di coltura</td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra, 10%</td><td>Leica</td><td>3800600</td><td>Per la fissazione del campione, fornitura di 5 galloni</td></tr><tr><td>Nunc piastre di Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741-1CS</td><td>100 mm di diametro x 25 mm di altezza, mantenere gli espianti immersi in 70 mL di terreno di coltura come descritto nel protocollo</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (100X)</td><td>Gibco di ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Aggiungere 5 mL a 500 mL 1X DMEM per una concentrazione di lavoro dell'1% v/v (1X)</td></tr><tr><td>Filamento da 1,75 mm Acido polilattico (PLA)</td><td>Hatchbox-Scegli</td><td></td> <td>il diametro del filamento compatibile con l'estrusore della tua stampante 3D, nel colore a scelta.</td></tr><tr><td>Cassette di elaborazione</td><td>Leica</td><td>3802631</td><td>Per la fissazione, la decalcificazione e l'inclusione di paraffina</td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPI</td><td>Invitrogen di ThermoFisher</td><td>P36931</td><td>Terreno di montaggio per la rimozione di sezioni di tessuto vetrino dopo TUNEL</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1700-50</td><td>CAS#39450-01-6, utilizzato per il recupero dell'antigene nel protocollo TUNEL</td></tr><tr><td>Forbici, fine</td><td>FST</td><td>14094-11</td> Set per la colorazione di vetrini <td>dritti e affilati</td></tr><tr><td>, 12 posti</td><td>Mercedes Scientific&nbsp;</td><td>MER 1011</td><td>Rack con 12 piastre per macchie e dipper per istologia blu di toluidina</td></tr><tr><td>Acetato di sodio, anidro</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A1318430</td><td>CAS#127-09-3, utilizzato per fare tampone per istologia blu di toluidina</td></tr><tr><td>Lame per microtomo a basso profilo Tissue-Tek Accu-Edge</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td>Per il sezionamento di paraffina</td></tr><tr><td>Blu di toluidina O</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>348601000</td><td>CAS#92-31-9</td></tr><tr><td>Inserto di riduzione del volume</td><td>:</td><td></td> <td>stampato in 3D da file CAD forniti come file supplementari</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td>fornitura di 4 galloni per la colorazione istologica</td></tr></tbody></table>

modello murino di espianto dell'arto posteriore per lo studio della meccanobiologia del conflitto del tendine d'achille

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

L'impingement del tendine sull'osso genera un ambiente di deformazione meccanica multiassiale con deformazione compressiva trasversale marcatamente elevata, che suscita un fenotipo localizzato della fibrocartilagine caratterizzato dall'accumulo di matrice ricca di glicosaminoglicani (GAG) e dal rimodellamento della rete di collagene. Mentre la fibrocartilagine è una caratteristica normale nelle regioni colpite dei tendini sani, l'eccesso di deposizione di GAG e la disorganizzazione della rete di collagene sono caratteristiche distintive della tendinopatia. Di conseguenza, l'impingement è clinicamente riconosciuto come un importante fattore estrinseco nell'inizio e nella progressione della tendinopatia. Ciononostante, la meccanobiologia alla base dell'impingement tendineo rimane poco studiata. Gli sforzi precedenti per chiarire la risposta cellulare all'impingement tendineo hanno applicato la compressione uniassiale alle cellule e asportato espianti tendinei in vitro. Tuttavia, le cellule isolate mancano di un ambiente extracellulare tridimensionale cruciale per la meccanorisposta, e sia gli studi in vitro che quelli sull'espianto asportato non riescono a ricapitolare l'ambiente di deformazione multiassiale generato dall'impingement tendineo in vivo, che dipende dalle caratteristiche anatomiche della regione impattata. Inoltre, i modelli in vivo di impingement tendineo mancano di controllo sull'ambiente di deformazione meccanica. Per superare queste limitazioni, presentiamo un nuovo modello murino di espianto dell'arto posteriore adatto allo studio della meccanobiologia dell'impingement del tendine d'Achille. Questo modello mantiene il tendine d'Achille in situ per preservare l'anatomia locale e riproduce l'ambiente di deformazione multiassiale generato dall'impatto dell'inserzione del tendine d'Achille sul calcagno durante la flessione dorsale della caviglia applicata passivamente, mantenendo le cellule all'interno del loro ambiente nativo. Descriviamo un protocollo di coltura tissutale parte integrante di questo modello e presentiamo i dati che stabiliscono la vitalità dell'espianto sostenuta per 7 giorni. I risultati rappresentativi dimostrano una migliore colorazione istologica del GAG e una diminuzione dell'allineamento delle fibre di collagene secondarie al impingement, suggerendo un'elevata formazione di fibrocartilagine. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare diversi regimi di carico meccanico e consente la manipolazione di percorsi molecolari di interesse per identificare i meccanismi che mediano il cambiamento fenotipico nel tendine d'Achille in risposta all'impingement.

Le immagini rappresentative delle sezioni di tessuto colorate con TUNEL dimostrano nuclei apoptotici minimi all'interno del corpo del tendine d'Achille dopo 7 giorni di coltura di espianto in tutti i gruppi sperimentali (Figura 2A). La quantificazione di queste immagini fornisce la prova che il protocollo di coltura tissutale mantiene in media fino al 78% di vitalità all'interno del tendine d'Achille dopo 7 giorni di coltura di espianto in tutte le condizioni di carico (...

Presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata e un protocollo di coltura tissutale che ricrea il cambiamento fibrocartilagineo guidato dall'impingement dell'inserzione del tendine d'Achille in espianti murini dell'arto posteriore con vitalità cellulare sostenuta, fornendo un modello adatto per esplorare la meccanobiologia dell'impingement tendineo.

Modello murino di espianto dell'arto posteriore per lo studio della meccanobiologia del conflitto del tendine d'Achille

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Studiamo la meccanobiologia alla base dell'impingement tendineo e il processo attraverso il quale questa richiesta meccanica unica guida la formazione localizzata di cartilagine in fibra in salute e malattia. Qui cerchiamo di caratterizzare la matrice per la modellazione relativa a modelli spazialmente eterogenei di deformazione meccanica multiassiale, generati da impingement e di identificare i meccanismi molecolari che mediano questa risposta. I modelli in vitro per lo studio della meccanobiologia dell'impingement hanno applicato la compressione semplice a cellule tendinee isolate o la compressione uniassiale artificiale a espianti tendinei parziali e interi.Modelli animali consolidati di conflitto tendineo, manipolando la fonte esterna di conflitto tendineo in vivo il più delle volte chirurgicamente ed esplorando la biologia dopo la ripresa dell'attività fisica. I modelli in vitro presentano limitazioni significative in quanto le cellule isolate mancano del loro ambiente extracellulare tridimensionale, cruciale per la meccano-risposta. Mentre i modelli di espianto asportato aggirano questa limitazione, entrambi non riescono a ricreare modelli di deformazione multiassiale generat

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