Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV
10 novembre 2023
Presentiamo due kit RT-qPCR one-step basati su sonde per i virus respiratori comuni. Il primo test è per SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 e H3N2) e influenza B. Il secondo è per SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Questi saggi possono essere implementati con successo in qualsiasi laboratorio specializzato.
L'obiettivo generale di questo test è quello di somministrare un approccio multiplex per la rilevazione simultanea di virus respiratori comunemente circolanti come SARS-CoV-2, MERS, influenza A e influenza B.Le tecnologie prevalenti che guidano i progressi nel nostro campo includono CRISPR, saggi amminometrici a flusso laterale, sensori biomolecolari basati su carta, test Sherlock in un vaso, aptameri del DNA e multiplex RT-qPCR integrato con amplificazione isotermica mediata da loop, LAMPADA. Tuttavia, la RT-qPCR multiplex è la più sensibile, comune ed è il gold standard per la diagnosi di vari virus. L'attuale sfida sperimentale è quella di stabilire un protocollo che possa essere utilizzato per rilevare copie di RNA a partire da 10 copie.
Per il test abbiamo utilizzato il kit RT-qPCR interno, che è efficiente in termini di tempo e costi. Per iniziare, preparare il tampone 2x per RT-qPCR in acqua priva di DNA/RNA Conservare il tampone a meno 20 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Quindi, mescolare i primer e le sonde in un tubo da 1,5 millilitri.
Prelevare il volume con il tampone di eluizione, quindi conservare la provetta a meno 20 gradi Celsius. Preparare una miscela enzimatica con taq polimerasi e MMLV-RT in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio. Compensare il volume con il tampone di conservazione della polimerasi taq.
Ora risospendere gli RNA sintetici virali in provette separate con 100 microlitri di tampone Tris-EDTA per ottenere scorte da 10 a un sesto di copie di RNA per microlitro. Per mescolare le scorte di virus, aggiungere cinque microlitri ciascuno di SARS-CoV-2, influenza A e B a 50 microlitri di tampone Tris-EDTA. Allo stesso modo, mescolare SARS-CoV-2 e MERS-CoV per ottenere una seconda miscela virale.
Diluire entrambe le miscele dieci volte per ottenere una diluizione finale di 10 copie di RNA per microlitro. In ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, pipettare 2 tamponi, primer, enzima, acqua priva di DNA/RNA e le corrispondenti miscele di RNA. Sigillare la piastra con un sigillo adesivo per piastre.
Quindi centrifugare la piastra per un minuto per raccogliere il liquido sul fondo del pozzetto. Successivamente, programmare la macchina PCR in modo che accetti il tipo di blocco veloce a 96 pozzetti con il tipo sperimentale impostato sulla curva standard. Impostare i reagenti su Reagenti TaqMan e selezionare le proprietà di esecuzione standard.
Definire i bersagli genetici e il colorante reporter. Quindi definisci i nomi dei campioni per ogni reazione da testare e assegna target e campioni al layout della piastra. Inserire ora il programma del ciclo nello strumento.
Trasferire la piastra alla macchina QPCR in tempo reale con l'orientamento corretto e premere Esegui per avviare il ciclo. Scegli la posizione del file per salvare i dati sperimentali. Quindi esaminare i grafici di amplificazione forniti dal programma QPCR.
I due kit sviluppati sono stati in grado di amplificare con successo tutti e tre i geni bersaglio contemporaneamente, con un minimo di 10 copie di RNA per reazione. L'efficienza di amplificazione per tutte le titolazioni virali è stata superiore al 99%
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Panoramica
Questo studio presenta lo sviluppo di due kit basati su sonde per RT-qPCR in un unico passaggio, progettati per la rilevazione simultanea di virus respiratori comuni, inclusi SARS-CoV-2, MERS e diverse ceppi di Influenza. Questi kit potenziano le capacità diagnostiche dei laboratori specializzati attraverso un approccio economico ed efficiente in termini di tempo.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Rilevamento di virus respiratori
- Tecnica RT-qPCR
- Sviluppo di saggi multiplex
Sfondo
- La necessità di una diagnosi rapida e sensibile dei virus respiratori.
- I limiti delle attuali tecnologie di rilevamento.
- L'importanza di un approccio multiplex per il rilevamento simultaneo.
Metodi Utilizzati
- Kit RT-qPCR sviluppati internamente
- Rilevamento di RNA virale
- RT-qPCR multiplex combinata con sonde specifiche
Risultati principali
- Rilevamento con successo di SARS-CoV-2 e MERS insieme all'influenza A e B.
- Amplificazione ottenuta con quantità di RNA pari a sole 10 copie per reazione.
- Elevate efficienze di amplificazione, superiori al 99%, per i geni bersaglio dimostrate.
Conclusioni
- I kit RT-qPCR sviluppati sono efficaci per la rilevazione multiplex di virus respiratori.
- Questo studio contribuisce a migliorare le strategie diagnostiche nella ricerca virologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I saggi multiplex di RT-qPCR in tempo reale per SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV rispondono all'esigenza fondamentale di una rapida, sensibile e specifica rilevazione di virus respiratori co-circolanti nella ricerca di scoperta e traslazionale. Questi saggi permettono una differenziazione ad alta affidabilità dei bersagli virali, sostenendo una valida conferma dei bersagli e riducendo l'ambiguità nello sviluppo diagnostico in fase iniziale. La loro integrazione migliora l'affidabilità predittiva e l'efficienza operativa in portafogli di ricerca e sviluppo focalizzati su minacce di malattie infettive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi precisa dei bersagli virali per la validazione funzionale in modelli di malattie respiratorie.
- Consente la riduzione del rischio biologico distinguendo patogeni virali strettamente correlati in campioni complessi.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione e nel triage dei bersagli per programmi diagnostici e terapeutici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di saggio multiplex validati per lo screening successivo di composti antivirali o diagnostici.
- Fornisce output standardizzati, riproducibili e quantitativi per il confronto e l'ottimizzazione dei saggi.
- Consente la predisposizione a screening scalabili ad alto rendimento per la valutazione rapida di interventi candidati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo il rilevamento simultaneo di più virus respiratori.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo un rilevamento virale robusto e quantitativo.
- Riduce il rischio nel progresso dei candidati assicurando un'identificazione accurata dei patogeni in sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
I saggi RT-qPCR multiplex rientrano nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, sostenendo la verifica iniziale delle ipotesi, lo sviluppo dei saggi e la ricerca traslazionale nei programmi sulle malattie infettive.
- Biologia della scoperta: Fornisce un rilevamento ad alta sensibilità per la validazione di bersagli virali guidata da ipotesi.
- Screening: Offre output riproducibili e quantitativi per la standardizzazione dei saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Fornisce dati di amplificazione robusti e metriche di specificità per l'analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento dei biomarcatori e la continuità tra le diverse fasi della ricerca.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile e adattabile per il rilevamento multiplex di virus in diversi contesti di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nel rilevamento virale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro diagnostici.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avvio/non avvio e l'efficienza del capitale consentendo una differenziazione precoce e accurata dei patogeni.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la promozione basate sull'adeguamento del rischio dei programmi sulle malattie infettive.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in virologia molecolare e progettazione di saggi di PCR quantitativa.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per PCR in tempo reale e a infrastrutture software per l'analisi dei dati.
- Richiede standardizzazione tra diversi gruppi di lavoro per l'allestimento del saggio, l'interpretazione dei dati e il controllo di qualità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi di campioni o varianti virali emergenti.
- Le prestazioni dipendono dalla specificità di primer/sonda e dalla qualità dell'RNA, come indicato dalla fonte.
