Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X
25 agosto 2023
Questo protocollo descrive una configurazione per la cristallizzazione del trasportatore di steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 viene ricostituito in bicelle per la cristallizzazione a goccia sospesa. Il protocollo non richiede materiali o substrati specializzati, il che lo rende accessibile e facile da adattare in qualsiasi laboratorio per determinare la struttura della proteina attraverso la cristallografia a raggi X.
Ciao, il mio team studia il tipo di perdita di proteine attraverso la membrana cellulare e stiamo esaminando la relazione con la medicina e la biologia. In particolare, stiamo esaminando una particolare proteina che richiederebbe ATP per guidare la sua funzione, e quindi, il nome è chiamato ATP binding cassette transporter. In particolare, stiamo esaminando la loro relazione struttura-funzione fondamentale, e quindi la usiamo per comprendere molte malattie croniche, in particolare le malattie cardiovascolari.
A causa della complessità della purificazione delle proteine di membrana e della loro stabilità a temperature native, l'ottenimento di cristalli proteici 3D è la sfida principale nel campo e limita anche le applicazioni di scoperta di farmaci. Il nostro team ha stabilito metodi in crio-EM e cristallografia a raggi X per gli studi strutturali delle proteine trasportatrici di membrana. E in precedenza il nostro laboratorio ha anche risolto la struttura cristallina del primo eterodimero obbligato umano ABCG5/G8, sia negli stati apo che in quelli legati al colesterolo.
I nostri risultati possono fornire una svolta nella scoperta di farmaci a piccole molecole o nel riposizionamento di farmaci. L'ottenimento di cristalli proteici 3D può anche consentire esperimenti di ammollo per la cocristallizzazione di complessi proteici e ligandi. Il nostro laboratorio si propone di determinare le basi molecolari del riconoscimento e della traslocazione dei lipidi da parte di proteine trasportatrici lipidiche ATP dipendenti.
E miriamo anche a stabilire nuovi metodi nello sviluppo di farmaci per studiare la dinamica molecolare e gli aspetti strutturali dei trasportatori ABC.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la cristallizzazione del trasportatore di steroli ABCG5/G8, utilizzando bicelle per la cristallizzazione in goccia sospesa. L'approccio è stato progettato per essere semplice e adattabile a diverse condizioni di laboratorio, facilitando la determinazione della struttura proteica mediante cristallografia a raggi X.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Strutturale
- Proteine di Trasporto di Membrana
Sfondo
- ABCG5/G8 è un trasportatore della famiglia delle cassette leganti l'ATP coinvolto nel trasporto dei lipidi.
- Comprendere la sua struttura è fondamentale per ottenere informazioni sulle malattie croniche, in particolare quelle cardiovascolari.
- Le difficoltà nella purificazione delle proteine di membrana ostacolano gli sforzi di scoperta di farmaci.
- Studi precedenti hanno chiarito la struttura cristallina di ABCG5/G8 in diversi stati.
Scopo dello studio
- Studiare le basi strutturali del riconoscimento e del trasloco dei lipidi da parte dei trasportatori ABC.
- Sviluppare nuove metodologie per la scoperta di farmaci legate alle proteine di trasporto della membrana.
- Permettere esperimenti di cocrystalizzazione per lo studio delle interazioni proteina-ligando.
Metodi Utilizzati
- Modifica chimica delle frazioni proteiche mediante metilazione riduttiva.
- Utilizzo di colonne al nichel NTA per la purificazione delle proteine.
- Preparazione della soluzione madre di cellule B per la cristallizzazione.
- Metodo di diffusione del vapore con goccia sospesa per l’allestimento della cristallizzazione.
Risultati principali
- La cristallizzazione riuscita di ABCG5/G8 osservata entro una o due settimane.
- I cristalli adatti alla raccolta dei dati tipicamente misuravano 50 micron per 100 micron per 2 micron.
- La metodologia consente ulteriori studi sulle interazioni lipidiche e lo sviluppo di farmaci.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della relazione struttura-funzione dei trasportatori ABC.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio della struttura di ABCG5/G8.
- I risultati potrebbero facilitare progressi nella scoperta di farmaci per malattie correlate.
- I futuri studi si concentreranno sull'esplorazione della dinamica dei meccanismi di trasporto dei lipidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La chiarificazione strutturale ad alta risoluzione di ABCG5/G8 in un ambiente di bicelle lipidiche affronta un collo di bottiglia critico nella scoperta di farmaci per le proteine di membrana. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio e supporta la riduzione del rischio meccanicistica per portafogli mirati ai trasportatori. Una cristallizzazione affidabile degli ABC trasportatori permette la progettazione di ligandi guidata dalla struttura e accelera le decisioni di screening nelle fasi iniziali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei meccanismi dei trasportatori lipidici dipendenti dall'ATP a risoluzione atomica.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio mantenendo la conformazione nativa in ambienti di bicelle.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico per i trasportatori coinvolti nelle malattie croniche.
- Fornisce modelli strutturali per la selezione delle linee di ricerca basata su ipotesi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce cristalli proteici validati adatti a studi di diffusione del ligando e co-cristallizzazione.
- Standardizza la preparazione delle proteine di membrana per flussi di lavoro di screening riproducibili a valle.
- Permette la valutazione quantitativa delle interazioni proteina-ligando mediante cristallografia a raggi X.
- Supporta lo sviluppo di saggi scalabili per librerie di composti mirati ai trasportatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le informazioni strutturali alla funzione dei trasportatori rilevante per le malattie nella ricerca cardiovascolare.
- Fornisce continuità dalla scoperta molecolare alla validazione preclinica dei modulatori dei trasportatori.
- Riduce il rischio di traduzione clinica informando studi su biomarcatori e meccanismi d'azione.
- Permette la progettazione razionale di modelli preclinici basata sulle relazioni struttura-funzione dei trasportatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di cristallizzazione basato su bicelle si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale del bersaglio fino all'identificazione del composto attivo e alla ricerca preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi funzionali dei trasportatori ABC.
- Screening: Fornisce cristalli riproducibili e di alta qualità per lo screening basato sulla struttura e la valutazione dei ligandi.
- Analisi: Permette letture strutturali quantitative per confrontare stati legati ai ligandi e stati aperti.
- Ricerca traslazionale: Collega la struttura molecolare all'attività del trasportatore rilevante per le malattie e all'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la cristallizzazione di diversi proteine di membrana nei processi di scoperta di farmaci.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi del trasportatore.
- Valore operativo: Standardizza la cristallizzazione delle proteine di membrana per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale nei programmi incentrati sui trasportatori.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei target di trasportatori aggiustata per il rischio e la promozione di asset guidati dalla struttura.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nelle tecniche di purificazione e cristallizzazione delle proteine di membrana.
- Richiede l'accesso a infrastrutture analitiche per la diffrazione a raggi X e la caratterizzazione delle proteine.
- Necessita della standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei bicelle e dei protocolli di cristallizzazione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse famiglie di trasportatori o composizioni lipidiche.
- La stabilità e il rendimento della proteina possono limitare la produttività e la scalabilità in alcuni sistemi.
