Isolamento chimico basato sull'affinità di vescicole extracellulari da biofluidi per analisi proteomiche e fosfoproteomiche
October 27th, 2023
Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento efficiente delle vescicole extracellulari urinarie utilizzando microsfere magnetiche funzionalizzate. Inoltre, comprende analisi successive, tra cui western blotting, proteomica e fosfoproteomica.
Stiamo lavorando alla scoperta di biomarcatori basati su vescicole extracellulari. Un passo importante è isolarli in modo efficiente e selettivo. EVtrap, che si basa sulla separazione a microsfere magnetiche, può davvero aiutarci fornendo un'elevata produttività, facile da usare, in particolare, facile da usare per applicazioni cliniche.
Abbiamo utilizzato questo protocollo per la scoperta delle proteine e dei biomarcatori fosfoproteici per diverse malattie come il cancro al seno, i tumori renali e il morbo di Parkinson. Questo biomarcatore è derivato dal biofluido. Le vescicole extracellulari possono essere potenzialmente utilizzate per le biopsie liquide, che possono migliorare ulteriormente la diagnosi clinica e il trattamento.
Attualmente, l'approccio più comunemente utilizzato per l'isolamento delle vescicole extracellulari è l'ultracentrifugazione e la precipitazione, ma questi metodi sono limitati al co-isolamento dei contaminanti e anche a bassa efficienza. Quindi il nostro metodo EVtrap fornirà un modo più efficace per isolare le vescicole extracellulari, che consentirà un metodo più riproducibile e sensibile e beneficerà anche dell'analisi a valle. Stiamo lavorando su due cose.
In primo luogo, stiamo continuando a sviluppare i metodi e i protocolli per l'isolamento delle vescicole extracellulari e un'analisi a valle, in particolare un'analisi basata su backup di massa. In secondo luogo, stiamo esplorando diverse applicazioni in campo clinico a causa del vantaggio dell'EVtrap.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'isolamento efficiente di vescicole extracellulari urinarie (EV) utilizzando perle magnetiche funzionalizzate. Dettaglia anche le analisi successive come western blotting, proteomica e fosfoproteomica, che sono essenziali per la scoperta di biomarcatori.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Scopritura di biomarcatori
- Vesciccole extracellulari
Sfondo
- Le vescicole extracellulari sono importanti per le biopsie liquide.
- Possono fornire informazioni su varie malattie.
- L'isolamento efficiente è cruciale per le applicazioni cliniche.
- Le proteine e le fosfoproteine dai biofluidi sono potenziali biomarcatori.
Scopo dello studio
- Accelerare la scoperta di biomarcatori.
- Isolare le EV in modo efficiente e selettivo.
- Migliorare la diagnosi e il trattamento clinico.
Metodi utilizzati
- Isolamento di vescicole extracellulari urinarie utilizzando perle magnetiche.
- Western blotting per l'analisi delle proteine.
- Proteomica e fosfoproteomica per l'identificazione dei biomarcatori.
- Metodi ad alto rendimento per applicazioni cliniche.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di EV dai biofluidi.
- Identificazione di proteine e fosfoproteine collegate alle malattie.
- Potenziale dimostrato per applicazioni di biopsia liquida.
- Facilitazione della scoperta di biomarcatori per i tumori e la malattia di Parkinson.
Conclusioni
- Il protocollo migliora l'efficienza dell'isolamento di EV.
- Supporta la scoperta di biomarcatori clinicamente rilevanti.
- Potenziale di migliorare le strategie diagnostiche e terapeutiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient and selective isolation of extracellular vesicles (EVs) from biofluids is a critical inflection point for proteomics-driven biomarker discovery in biopharma R&D. This chemical affinity-based magnetic bead protocol enables high-yield, reproducible EV isolation, directly supporting quantitative proteomic and phosphoproteomic analyses essential for early disease detection and target validation. The method enhances predictive confidence in translational biomarker pipelines and supports risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of disease-relevant protein and phosphoprotein signatures from patient-derived biofluids.
- Supports functional target validation by providing high-quality EV cargo for downstream mechanistic studies.
- Facilitates biological de-risking through reproducible and quantitative molecular profiling.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-purity EV preparations suitable for quantitative mass spectrometry workflows.
- Improves assay reproducibility and sensitivity by minimizing contaminants and maximizing EV yield.
- Enables scalable preparation of EV samples for high-throughput screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by capturing real-time molecular snapshots from clinical biofluids.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent EV proteome and phosphoproteome analysis.
- Provides mechanistic de-risking for candidate biomarkers prior to clinical development.
Pipeline & Workflow Integration
This EV isolation protocol integrates at the interface of early discovery and translational research, bridging sample preparation with quantitative proteomics and phosphoproteomics analysis.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling access to EV-derived molecular cargo.
- Screening: Provides reproducible, quantitative EV samples for downstream assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports high-throughput, statistically robust measurement of protein and phosphoprotein abundance across conditions.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity from patient samples to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable EV isolation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable EV isolation for proteomics workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust molecular profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, phosphoproteomics, and EV biology for optimal execution and data interpretation.
- Demands access to magnetic bead-based separation systems and high-resolution mass spectrometry platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and analytical protocols for reproducibility.
- Adaptable to various biofluid types but may require optimization for different matrices.
- Quantitative reproducibility and sensitivity are dependent on rigorous protocol adherence and analytical calibration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
