Isolamento chimico basato sull'affinità di vescicole extracellulari da biofluidi per analisi proteomiche e fosfoproteomiche
27 ottobre 2023
Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento efficiente delle vescicole extracellulari urinarie utilizzando microsfere magnetiche funzionalizzate. Inoltre, comprende analisi successive, tra cui western blotting, proteomica e fosfoproteomica.
Stiamo lavorando alla scoperta di biomarcatori basati su vescicole extracellulari. Un passo importante è isolarli in modo efficiente e selettivo. EVtrap, che si basa sulla separazione a microsfere magnetiche, può davvero aiutarci fornendo un'elevata produttività, facile da usare, in particolare, facile da usare per applicazioni cliniche.
Abbiamo utilizzato questo protocollo per la scoperta delle proteine e dei biomarcatori fosfoproteici per diverse malattie come il cancro al seno, i tumori renali e il morbo di Parkinson. Questo biomarcatore è derivato dal biofluido. Le vescicole extracellulari possono essere potenzialmente utilizzate per le biopsie liquide, che possono migliorare ulteriormente la diagnosi clinica e il trattamento.
Attualmente, l'approccio più comunemente utilizzato per l'isolamento delle vescicole extracellulari è l'ultracentrifugazione e la precipitazione, ma questi metodi sono limitati al co-isolamento dei contaminanti e anche a bassa efficienza. Quindi il nostro metodo EVtrap fornirà un modo più efficace per isolare le vescicole extracellulari, che consentirà un metodo più riproducibile e sensibile e beneficerà anche dell'analisi a valle. Stiamo lavorando su due cose.
In primo luogo, stiamo continuando a sviluppare i metodi e i protocolli per l'isolamento delle vescicole extracellulari e un'analisi a valle, in particolare un'analisi basata su backup di massa. In secondo luogo, stiamo esplorando diverse applicazioni in campo clinico a causa del vantaggio dell'EVtrap.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'isolamento efficiente di vescicole extracellulari (EV) urinarie mediante l'utilizzo di microsferette magnetiche funzionalizzate. Inoltre, vengono dettagliati analisi successive come il western blotting, la proteomica e la fosfoproteomica, essenziali per la scoperta di biomarcatori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Scoperta di Biomarcatori
- Vescicole Extracellulari
Sfondo
- I vescicoli extracellulari sono importanti per le biopsie liquide.
- Possono fornire informazioni su varie malattie.
- L'isolamento efficiente è cruciale per le applicazioni cliniche.
- Le proteine e le fosfoproteine provenienti dai fluidi biologici sono potenziali biomarcatori.
Scopo dello studio
- Per accelerare la scoperta di biomarcatori.
- Per isolare in modo efficiente e selettivo le EV.
- Per migliorare la diagnosi e il trattamento clinico.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di vescicole extracellulari urinarie utilizzando microsferette magnetiche.
- Western blotting per l'analisi delle proteine.
- Proteomica e fosfoproteomica per l'identificazione di biomarcatori.
- Metodi ad alto rendimento per applicazioni cliniche.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di vescicole extracellulari (EV) da biofluidi.
- Identificazione di proteine e fosfoproteine associate a malattie.
- Potenziale dimostrato per applicazioni di biopsia liquida.
- Agevolata la scoperta di biomarcatori per i tumori e la malattia di Parkinson.
Conclusioni
- Il protocollo migliora l'efficienza dell'isolamento degli EV.
- Supporta la scoperta di biomarcatori clinicamente rilevanti.
- Potenzialità di migliorare le strategie diagnostiche e terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento efficiente e selettivo di vescicole extracellulari (EVs) dai fluidi biologici rappresenta un punto critico decisivo per la scoperta di biomarcatori guidata da proteomica nella ricerca e sviluppo del settore biofarmaceutico. Questo protocollo basato su perline magnetiche con affinità chimica consente un isolamento ad alto rendimento e riproducibile delle EVs, supportando direttamente analisi proteomiche e fosfoproteomiche quantitative essenziali per la rilevazione precoce delle malattie e la validazione di bersagli terapeutici. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nei percorsi di sviluppo traslazionale dei biomarcatori e favorisce l'avanzamento del portafoglio progettuale con valutazione del rischio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente un'analisi robusta delle firme proteiche e fosfoproteiche rilevanti per le malattie, ottenute da biofluidi derivati da pazienti.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi fornendo un carico di EV di alta qualità per studi meccanicistici successivi.
- Facilita la riduzione del rischio biologico mediante profilazione molecolare riproducibile e quantitativa.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce preparazioni standardizzate di EV ad alta purezza, adatte a flussi di lavoro di spettrometria di massa quantitativa.
- Migliora la riproducibilità e la sensibilità del saggio riducendo al minimo i contaminanti e massimizzando il rendimento di EV.
- Consente la preparazione scalabile di campioni di EV per analisi ad alto rendimento e riutilizzo della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori acquisendo istantanee molecolari in tempo reale da biofluidi clinici.
- Consente un approccio continuo dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo analisi coerenti del proteoma e del fosfoproteoma degli EV.
- Offre una riduzione del rischio meccanicistica per i biomarcatori candidati prima dello sviluppo clinico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di isolamento di EV integra il punto di intersezione tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca traslazionale, collegando la preparazione del campione all'analisi quantitativa di proteomica e fosfoproteomica.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi permettendo l'accesso al carico molecolare derivato dagli EV.
- Screening: Fornisce campioni di EV riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi successivi e la valutazione di composti.
- Analisi: Supporta la misurazione ad alto rendimento e statisticamente robusta dell'abbondanza di proteine e fosfoproteine in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento e la continuità dei biomarcatori dai campioni dei pazienti ai modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità standardizzata e scalabile di isolamento degli EV per diversi programmi di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella scoperta di biomarcatori.
- Valore operativo: Fornisce un isolamento standardizzato, riproducibile e scalabile di vescicole extracellulari per flussi di lavoro di proteomica.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo un profilo molecolare robusto.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di candidati biomarcatori e terapeutici con adeguamento del rischio.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in proteomica, fosfoproteomica e biologia degli EV per un'esecuzione ottimale e l'interpretazione dei dati.
- Richiede l'accesso a sistemi di separazione basati su microsferette magnetiche e piattaforme di spettrometria di massa ad alta risoluzione.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nelle procedure di gestione dei campioni e nei protocolli analitici per garantire la riproducibilità.
- È adattabile a diversi tipi di biofluidi, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per matrici differenti.
- La riproducibilità quantitativa e la sensibilità dipendono da un rigoroso rispetto del protocollo e da una corretta calibrazione analitica.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
