Name: Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Impara a isolare fibre muscolari scheletriche di diverse lunghezze da sei muscoli degli arti posteriori di topi mediante dissociazione enzimatica. Questo metodo consente studi avanzati sul meccanismo di accoppiamento eccitazione-contrazione.

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Gli autori esprimono la loro gratitudine al professor Robinson Ramírez di UdeA per l'aiuto con gli animali e alcune foto e a Carolina Palacios per il supporto tecnico. Johan Pineda di Kaika ci ha aiutato a configurare le telecamere a colori e a fluorescenza. Shyuan Ngo, dell'Università del Queensland, ha gentilmente corretto il manoscritto. Questo studio è stato finanziato dal CODI-UdeA (2020-34909 dal 22 febbraio 2021 e 2021-40170 dal 31 marzo 2022, SIU) e dall'Ufficio dipianificazione-UdeA (E01708-K e ES03180101), Medellín, Colombia, al JCC. I finanziatori non hanno partecipato alla raccolta e all'analisi dei dati, alla stesura o alla presentazione dei manoscritti.

Isolamento enzimatico e caratterizzazione di fibre muscolari di topo a lunghezza variabile

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

A complemento dei modelli disponibili per lo studio della biologia del muscolo scheletrico maturo, qui dimostriamo la dissociazione enzimatica di successo di una serie di muscoli di topo con fibre corte, intermedie e lunghe. Queste fibre permettono di dimostrare la generalizzabilità della cinetica MT-II dei transienti Ca2+ nel muscolo scheletrico. Inoltre, sono stati classificati i tipi di fibre nei muscoli intatti e interi. Dato che l'FDB è il muscolo più utilizzato per gli esperimenti fisiologici, sono stati...

Il muscolo scheletrico maturo dei mammiferi è un tessuto multifunzionale. Regola pesantemente il metabolismo, è la principale fonte di produzione di calore e le sue proprietà dinamiche gli conferiscono un ruolo chiave nella respirazione, nel movimento dei segmenti corporei o nello spostamento da un punto all'altro 1,2,3. Il muscolo scheletrico è anche rilevante per la fisiopatologia di molte malattie, comprese le condizioni ereditarie e croniche, come miopatie, distrofie o sarcopenia, nonché molte condizioni croniche non muscolari, come le malattie cardiometaboliche 3,4,5,6,7,8.
Lo studio ex vivo delle proprietà strutturali e funzionali del muscolo scheletrico maturo in un contesto di salute e malattia è stato possibile principalmente attraverso due modelli sperimentali: il muscolo intero e le fibre isolate. Nel 20° secolo, i ricercatori hanno sfruttato le proprietà dell'intero muscolo estensore lungo delle dita (EDL), del soleo, del tibiale anteriore e del gastrocnemio di diverse piccole specie come modelli cardine per conoscere le unità motorie, i tipi di fibre e le proprietà dinamiche come la forza e la cinetica di contrazione e rilassamento 9,10,11,12,13,14,15,16. Tuttavia, l'avvento di studi di biologia cellulare più raffinati ha spostato l'area verso lo studio delle singole fibre muscolari. Il lavoro pionieristico ha quindi permesso l'isolamento delle fibre flessori brevi delle dita intatte (FDB) dei ratti mediante dissociazione enzimatica per la successiva caratterizzazione 17,18,19. Sebbene le fibre FDB possano essere ottenute anche mediante dissezione manuale20, la facilità e l'elevata produttività della dissociazione enzimatica dei muscoli murini, oltre alla loro idoneità per una varietà di approcci sperimentali, hanno reso quest'ultimo modello ampiamente utilizzato negli ultimi due decenni.
Le fibre corte FDB sono adatte per studi elettrofisiologici e altri studi biofisici, analisi biochimiche, metaboliche e farmacologiche, esperimenti di microscopia elettronica e fluorescenza, trasfezione per approcci di biologia cellulare o come fonte di cellule staminali negli studi di miogenesi 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Tuttavia, l'utilizzo di sole fibre FDB negli esperimenti muscolari restringe l'ambito della ricerca che si occupa dei tipi di fibre e limita la quantità di materiale biologico disponibile per alcune tecniche metodologiche o per ottenere maggiori informazioni da un animale. Queste limitazioni ostacolano una chiara correlazione dei fenomeni fisiologici cellulari con precedenti studi biochimici e dinamici eseguiti in diversi muscoli interi, intatti (ad esempio, EDL, soleo, peronei).
Superando queste limitazioni, alcuni gruppi sono riusciti a dissociare i muscoli EDL e soleo più lunghi 24,33,34,35,36,37,38,39,40, aprendo la porta ad un'ulteriore estensione del metodo ad altri muscoli rilevanti. Tuttavia, l'uso di EDL e fibre soleo è ancora scarso, probabilmente a causa della mancanza di dettagli metodologici per ottenerle come fibre intatte. Qui descriviamo in dettaglio come isolare fibre di diverse lunghezze e tipi da sei muscoli: tre di essi già descritti (FDB, EDL e soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce [EHL], peroneo lungo [PL] e peroneo delle dita quarti [PDQA]). I risultati del presente lavoro confermano che il modello di fibre enzimaticamente dissociate è adatto per un'ampia gamma di studi e future correlazioni con dati precedentemente pubblicati, aumentando così la disponibilità di modelli per studi sul muscolo scheletrico maturo.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti miosina I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anticorpo anti miosina II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8421</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anticorpo anti miosina IIA American</td><td>Type Culture Collection</td><td>SC-71</td><td>Anticorpo primario. Derivato dall'ibridoma HB-277</td></tr><tr><td>Anticorpo anti miosina IIB</td><td>Studi sullo sviluppo Banca dell'ibridoma</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>Anticorpi primari</td></tr><tr><td>Bis-acrilammide</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Merck</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Carlo Erba</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di calcio</td><td>Merck</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>Dicloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo 2</td><td>Worthington</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Console Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blu brillante R 250&nbsp;</td><td>Merck</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>Acido edetico (EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1423291211</tr><tr><td>Glycine</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Thermo Scientific</td><td>6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4, AM</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>Preparato solo in DMSO. L'acido pluronico non è necessario e non deve essere utilizzato per evitare il deterioramento delle fibre.</td></tr><tr><td>Mercaptoetanolo</td><td>Applichem</td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Protokimica</td><td>MP10043</td><td></td></tr><tr><td>Topi</td><td>Diversi</td><td>Diversi</td><td>Per questo manoscritto, abbiamo usato solo topi C57BL/6. Tuttavia, alcuni risultati preliminari hanno dimostrato che il protocollo funziona bene per i topi Webster svizzeri della stessa età e peso.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletano-1,2-diammina (TEMED)</td><td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-benzil-p-toluene sulfonamide (BTS)</td><td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Composto da taglio ottimale (OCT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>Anticorpo secondario adsorbito incrociato IgG (H+L) anti-topo di capra, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1323631209</tr><tr><td>TRIS 0,5 M, pH 6,8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>Tris(Idrossimetil)amminometano</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>MaterialiCamera di</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>dissezione</td><td>Vetrini caricati su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Erie Scientific</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Camera da bagno sperimentale</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27NE2</td><td>Camera da bagno stretta con stimolazione di campo, assemblata su una piattaforma riscaldata PH-6</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>World Precision Instruments</td><td>Vannas Forbici 501778</td><td></td></tr><tr><td>pipette in vetro Pasteur</td><td>Diverse</td><td></td><td>punte</td></tr> <tr><td>lucidate a fuocoFiale di vetro con tappo</td><td>Diverse</td><td></td> forbici operatorie <td>da 2-3 mL di volume</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>La fotocamera digitale</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s e Axio 305</td><td>Axio 305, accoppiata allo stereoscopio Stemi 508, è stata utilizzata per scattare foto durante la dissezione; mentre Erc 5s o Axio 208, accoppiati al microscopio Axio Observer A1, sono stati utilizzati per acquisire immagini delle fibre isolate e dei saggi di immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>1550A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis chamber</td><td>Bio Rad</td><td>Mini-Protean IV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito accoppiato a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer A1</td><td>Accoppiato a una sorgente di luce appropriata, filtri e obiettivi per fluorescenza</td></tr><tr><td>Fotomoltiplicatore</td><td>Horiba</td><td>R928 tubo, Hamamatsu, in un fotometro D104, Horiba</td><td>Accoppiato alla porta laterale del microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore&nbsp;</td><td>Strumenti per erba&nbsp;</td><td>S6</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNE-22</td><td></td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>808691</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software gratuito per analisi elettroforesi</td><td>Università del Kentucky</td><td>GelBandFitter v1.7</td><td>http://www.gelbandfitter.org</td></tr><tr><td>Software gratuito per l'analisi delle immagini e la morfometria</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ v1.54</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Software concesso in licenza per l'acquisizione e l'analisi dei segnali Ca2+</td><td>Molecular Devices</td><td>pCLAMP v10.05</td><td>https://www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>Software concesso in licenza per analisi statistiche e grafici</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2019</td><td>https://www.originlab.com/</td></tr></tbody></table>

fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Le fibre muscolari scheletriche ottenute dalla dissociazione enzimatica dei muscoli del topo sono un modello utile per esperimenti fisiologici. Tuttavia, la maggior parte degli articoli si occupa delle fibre corte del flessore breve delle dita (FDB), il che limita la portata dei risultati relativi ai tipi di fibre, limita la quantità di materiale biologico disponibile e impedisce una chiara connessione tra i fenomeni fisiologici cellulari e le precedenti conoscenze biochimiche e dinamiche ottenute in altri muscoli.
Questo articolo descrive come ottenere fibre intatte da sei muscoli con diversi profili e lunghezze di tipo di fibra. Utilizzando topi adulti C57BL/6, mostriamo il protocollo di dissezione muscolare e isolamento delle fibre e dimostriamo l'idoneità delle fibre per studi transitori di Ca2+ e la loro caratterizzazione morfometrica. Viene anche presentata la composizione del tipo di fibra dei muscoli. Quando sono stati dissociati, tutti i muscoli sono diventati intatti, fibre vive che si contraggono rapidamente per più di 24 ore. FDB ha dato fibre corte (<1 mm), peroneo dita quarti (PDQA) e peroneo lungo (PL) intermedio (1-3 mm), mentre estensore lungo delle dita (EDL), estensore lungo dell'alluce (EHL) e muscolo soleo hanno rilasciato fibre lunghe (3-6 mm).
Quando sono stati registrati con il colorante veloce Mag-Fluo-4, i transienti di Ca2+ delle fibre PDQA, PL ed EHL hanno mostrato una cinetica veloce e stretta che ricorda la morfologia di tipo II (MT-II), nota per corrispondere alle fibre di tipo IIX e IIB. Ciò è coerente con il fatto che questi muscoli hanno oltre il 90% di fibre di tipo II rispetto a FDB (~80%) e soleo (~65%). Andando oltre l'FDB, dimostriamo per la prima volta la dissociazione di diversi muscoli, che rendono le fibre che coprono una gamma di lunghezze comprese tra 1 e 6 mm. Queste fibre sono vitali e danno transienti veloci di Ca2+ , indicando che l'MT-II può essere generalizzato alle fibre veloci IIX e IIB, indipendentemente dalla loro fonte muscolare. Questi risultati aumentano la disponibilità di modelli per gli studi sul muscolo scheletrico maturo.

Concentrazione sarcoplasmatica di Ca2+ durante una contrazione Per dimostrare la fattibilità di esperimenti fisiologici nell'insieme delle fibre dissociate e per estendere i nostri precedenti risultati sull'accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) e sui tipi di fibre, i transitori di Ca2+ sono stati acquisiti nelle fibre di tutti i muscoli. In primo luogo, FDB (n = 5) e EDL (n = 7) hanno mostrato una cinetica di Ca2+ nota come morfologia di tipo II (MT-II). Si tratt...

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

In questo studio, descriviamo un metodo per isolare fibre di diverse lunghezze e tipi da sei muscoli degli arti posteriori dei topi. Inoltre, abbiamo testato l'idoneità delle fibre per esperimenti fisiologici riguardanti lo studio del meccanismo di accoppiamento eccitazione-contrazione. Per anni, ottenere fibre muscolari lunghe è stata una sfida, limitando la portata di molti studi sul campo.Ora mostriamo che è possibile ottenere fibre magre con flessori, estensori ed evertori di topo con lunghezze fino a sei millimetri. Ad esempio, l'ottenimento di fibre da sei diversi muscoli ci ha permesso di dimostrare che la cinetica transitoria del calcio, nota come morfologia di tipo II, può essere generalizzata al tipo IIB e IIX indipendentemente dalla posizione o dalla funzione della loro fonte muscolare. Riteniamo che il modello di fibre enzimaticamente isolate sia adatto a una varietà di approcci sperimentali con diversi tipi di tecnologie che ci consentono di rispondere a domande meccanicistiche nell'ambito della biochimica, della fisiologia, della biofisica, della biologia cellulare e della biologia molecolare.

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Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per isolare e arricchire mioblasti primari da muscoli scheletrici di topo adulti e neonati attraverso dissociazione tissutale, filtrazione sequenziale, preplaccatura e condizioni di coltura definite, consentendo l'istituzione e il mantenimento di colture mioblastiche derivate da cellule satellitari per applicazioni sperimentali a valle.

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Impara a isolare fibre muscolari scheletriche di diverse lunghezze da sei muscoli degli arti posteriori di topi mediante dissociazione enzimatica. Questo metodo consente studi avanzati sul meccanismo di accoppiamento eccitazione-contrazione.

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita (Video) | JoVE Journal

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