Name: Processazione tissutale e isolamento di fibroblasti primari dalla vagina umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per isolare fibroblasti primari da tessuto vaginale umano postmenopausale usando digestione meccanica ed enzimatica. Questo metodo migliora la resa cellulare per studi sul prolasso degli organi pelvici.

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<ol><li>Mirin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+disparity+in+the+funding+of+diseases+by+the+U.S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Gender disparity in the funding of diseases by the U.S.</a> J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).</li>
<li>MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+pelvic+floor+disorders+and+their+relationship+to+gender%2C+age%2C+parity%2C+and+mode+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery.</a> BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+show+differential+mechanoresponses+depending+on+surface+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Rorteau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+chronological+aging+features+in+culture+of+normal+human+dermal+fibroblasts+from+old+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors.</a> Cells. 11 (5), 858(2022).</li>
<li>Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+murine+vaginal+fibroblast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines.</a> MethodsX. 7, 101100(2020).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparative+characterization+of+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+and+without+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+fibroblastic+cells+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+produce+matrices+with+increased+stiffness+and+collagen+content%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content.</a> Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).</li>
<li>Khan, M., Gasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+fibroblast+cultures+from+mouse+ear+and+tail+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues.</a> J Vis Exp. (107), e53565(2016).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+mechanical+loading+influences+the+expression+of+extracellular+matrix+and+cell+adhesion+proteins+in+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).</li>
<li>Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+primary+vaginal+fibroblasts+to+absorbable+and+nonabsorbable+implant+materials+coated+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Female+Pelvic+Med+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma.</a> Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).</li>
<li>Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+predictors+of+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse.</a> Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Waise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+isolate+human+fibroblasts+from+tissue+for+ex+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis.</a> Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).</li>
<li>Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+primary+foreskin+fibroblasts+to+study+cellular+damage+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction.</a> Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).</li>
<li>Da Silva Lara, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+Leading+to+Increased+Vaginal+Wall+Thickness+in+Women+with+Genital+Prolapse%3A+Impact+on+Sexual+Response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response.</a> J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).</li>
<li>Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oral+epithelial+thickness+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography.</a> Diagnostics. 9 (3), 90(2019).</li>
<li>Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+fibroblastic+differon+of+the+dermis%3A+role+in+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Bio Techne</td><td>B23192</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (100 &mu; m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche (15 mL)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso in piuma n. 15</td><td>Socorex</td><td>FB.15</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NC1983075</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche ad alta chiarezza (50 mL)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Miscelatore per campioni</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina umana DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY1918-05</td><td></td></tr><tr><td>Umano Pro-Collagene I alfa 1 DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY6220-05</td><td></td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05 401 119 001</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri, polistirene (100 mm x 20 mm)</td>Pipette sierologiche <td>Millipore Sigma</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>(10 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe sterili (5 mL)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-458</td><td></td></tr></tbody></table>

processazione tissutale e isolamento di fibroblasti primari dalla vagina umana

Tissue Processing and Isolation of Primary Fibroblasts from the Human Vagina

Il tessuto vaginale è stato raccolto da 10 donatori indipendenti sottoposti a chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Utilizzando il protocollo descritto, le cellule sono state isolate dal tessuto vaginale umano. Le popolazioni cellulari avevano un caratteristico aspetto allungato, piatto e a forma di fuso. Come altri studi, abbiamo osservato capacità di raddoppio cellulare significativamente più lente e ridotta capacità clonogenica dei fibroblasti con l'aumentare dell'età del donatore. Queste differenze sono state marcate confrontando i fibroblasti isolati da individui più anziani (75-78 anni) con quelli isolati da individui giovani (35-47 anni). Le cellule di donatori di mezza età hanno mostrato un profilo intermedio (56-61 anni). I tassi di proliferazione cellulare sono stati inizialmente stimati mediante visualizzazione diretta utilizzando un microscopio a contrasto di fase con la stessa densità di semina nota.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo di dissociazione e isolamento. Seguendo questi passaggi, questo protocollo ha prodotto un tasso di successo del 90% di isolamento dei fibroblasti primari in nove donatori su dieci in un numero di cellule sufficiente per consentire la subcoltura delle cellule. L'età media dei donatori era di 59 anni.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Protocollo (Autore, anno)</td>
			<td>Tessuto donatore del protocollo originale</td>
			<td>Numero di donatori</td>
			<td>Età del donatore in anni</td>
			<td>Fibroblasti ottenuti</td>
			<td>Morfologia</td>
		</tr><tr><td>Ruiz-Zapata et al., 2013</td>
			<td>Vagina umana</td>
			<td>3</td>
			<td>56-78</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Khan et al., 2016</td>
			<td>Orecchio e coda del topo</td>
			<td>2</td>
			<td>48-65</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Waise et al., 2019</td>
			<td>Tessuto umano</td>
			<td>3</td>
			<td>56-75</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Nadalutti et al., 2020</td>
			<td>Prepuzio umano</td>
			<td>1</td>
			<td>65</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Corrente</td>
			<td>Vagina umana</td>
			<td>10</td>
			<td>35-79</td>
			<td>Sì</td>
			<td>A forma di fuso</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Confronto dei protocolli per il successo dell'isolamento dei fibroblasti vaginali umani. Confronto tra diversi protocolli esistenti con il nostro e testimoniato da risultati morfologici.
La Tabella 1 mostra i risultati dell'utilizzo di altri protocolli per tentare l'isolamento dei fibroblasti vaginali in questo studio. Abbiamo sviluppato un protocollo standard per l'isolamento dei fibroblasti primari dalla mucosa vaginale e da donatori anziani5.
Abbiamo testato diversi protocolli stabiliti, inclusi quelli elencati nella Tabella 1, e non abbiamo osservato alcun successo nell'isolamento cellulare utilizzando questi protocolli nel nostro studio. Proponiamo le seguenti ragioni per le loro limitazioni.
Il protocollo pubblicato da Ruiz et al.3 prevede la raschiatura della fascia e il taglio del tessuto in piccoli pezzi. Nella nostra esperienza, è difficile distinguere la fascia e i tentativi di raschiamento possono comportare una significativa riduzione della resa cellulare. Sebbene questo metodo sia semplice, manca di dettagli critici, il che ne limita la generalizzabilità. Inoltre, la digestione meccanica in questo protocollo sembra insufficiente per il tessuto in postmenopausa, che tende ad essere più denso.
I protocolli pubblicati da Khan et al.9 e Waise et al.13 impiegano forbici per la macinazione dei tessuti, che non introducono forze di taglio multidirezionali significative rispetto alla tecnica del bisturi. Nella nostra esperienza, anche il metodo delle forbici non ha funzionato in modo efficace.
Infine, il protocollo Nadalutti et al.14 , che utilizzava il metodo dell'espianto, non ha prodotto con successo fibroblasti nelle nostre mani. Questo metodo può essere meno efficace a causa della natura del tessuto postmenopausale, che può richiedere un'elaborazione meccanica ed enzimatica più aggressiva per dissociare con successo i fibroblasti.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig02.jpg"> Figura 2: Immagine a contrasto di fase delle cellule sospese il giorno 0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La Figura 2 mostra le celle sospese il giorno 0 utilizzando il nostro protocollo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig03.jpg"> Figura 3: Immagine a contrasto di fase di fibroblasti primari vaginali al 14° giorno di coltura con ingrandimento di 100x da una sospensione cellulare aggregata di tre biopsie tissutali da 1 cm2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
La Figura 3 mostra i fibroblasti primari con un ingrandimento di 100x da una sospensione cellulare aggregata di 3 biopsie tissutali di 1 cm² di dimensioni.
L'identità dei fibroblasti è stata studiata mediante tecniche di immunofluorescenza, come descritto in precedenza, con piccole modifiche. Per verificare l'origine cellulare delle cellule vaginali primarie, abbiamo utilizzato specifici biomarcatori di origine fibroblastica tramite colorazione immunofluorescente. Le cellule sono state identificate come fibroblasti sulla base della colorazione positiva di vimentina (Figura 4), F-actina e α-SMA da campioni di tessuto in premenopausa e postmenopausa (Figura 5). I fibroblasti sono stati coltivati fino all'espansione con un'elevata vitalità (&gt;90%) per l'uso negli esperimenti.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig04.jpg"> Figura 4: Colorazione positiva della vimentina dei fibroblasti vaginali. I fibroblasti primari isolati del tessuto premenopausale e postmenopausale sono stati sottoposti ad analisi IF e le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig05.jpg"> Figura 5: Colorazione positiva di F-actina e α-SMA di fibroblasti vaginali. I risultati dell'espressione proteica rispetto al controllo delle IgG. Le immagini sono state raccolte con un ingrandimento di 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Processazione tissutale e isolamento di fibroblasti primari dalla vagina umana

Pelvic organ prolapse is a disorder that seriously impacts the quality of life of women. It occurs when muscles and ligaments weaken and cause pelvic ...

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Biologia

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Pelle Punch Biopsia Espianto Cultura per la derivazione di fibroblasti umani primari

Riportiamo un metodo per isolare precursori pelle-derivato multipotenti (SKP) cellule naïve da colture primarie di fibroblasti umani. Abbiamo dimostrato che queste SKPs derivati ​​da colture di fibroblasti Share proprietà delle cellule staminali a quelle derivate direttamente da biopsie cutanee umane. Queste cellule esprimono il marcatore cresta neurale, nestin, oltre ai marcatori multipotenti quali OCT4 e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

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Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Qui, viene presentato un protocollo per isolare e stabilire colture primarie di fibroblasti/miofibroblasti (MF) da cellule gastriche, piccole cellule intestinali e di tessuto del colon congelate con un fenotipo MF. Queste cellule esprimono CD90, α-SMA e vimentina. Le MF possono essere utilizzate per una varietà di saggi funzionali, tra cui l'attività enzimatica e la produzione di citochine.

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