Processazione tissutale e isolamento di fibroblasti primari dalla vagina umana

La ricerca sui disturbi che colpiscono principalmente le persone di genere femminile è poco studiata e poco finanziata. Il prolasso degli organi pelvici è il disturbo fortemente associato al genere femminile. Si verifica quando i muscoli e i legamenti si indeboliscono e causano l'abbassamento degli organi pelvici nel bacino, creando un rigonfiamento nella vagina.

Poco si sa sulle interazioni cellulari nel contesto di questa fisiopatologia, né su come i fattori a livello tissutale influenzino il successo degli interventi chirurgici. L'isolamento dei fibroblasti primari dalla vagina umana può essere utile per studiare i meccanismi biologici alla base del prolasso degli organi pelvici. Il prolasso degli organi pelvici colpisce comunemente gli individui più anziani o in postmenopausa.

Lo studio dell'isolamento e della proliferazione dei fibroblasti primari di questa condizione è impegnativo a causa della riduzione delle popolazioni cellulari e della capacità clonogenica dei donatori più anziani. La maggior parte degli articoli che utilizzano campioni vaginali umani utilizzano tessuti di individui in premenopausa con prolasso degli organi pelvici. Sebbene alcuni articoli abbiano riportato l'uso di campioni sia da individui in premenopausa che in postmenopausa, non hanno descritto in modo sufficientemente dettagliato il protocollo utilizzato per isolare con successo i fibroblasti da donatori anziani o in postmenopausa.

L'isolamento e la modellazione della malattia utilizzando fibroblasti da tessuto in postmenopausa possono essere essenziali per comprendere la fisiopatologia cellulare del prolasso degli organi pelvici poiché questa condizione ha la più alta prevalenza negli individui nel decennio successivo alla menopausa, Descriviamo un metodo per l'isolamento e la coltura di una sospensione di una singola cellula arricchita di fibroblasti da tessuto vaginale umano utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica ed enzimatica. Questo articolo descrive un protocollo affidabile su come acquisire fibroblasti vaginali umani in postmenopausa o in invecchiamento. I tessuti prelevati sono stati analizzati istologicamente per convalidare il protocollo.

Misurare e tagliare il tessuto alla dimensione di circa un centimetro quadrato. Garantire una misurazione precisa delle dimensioni della biopsia. Prepara due o tre biopsie vaginali aggiuntive, misurando un centimetro quadrato ciascuna da un singolo donatore e metti da parte le biopsie.

Dopo aver posizionato la biopsia vaginale in una capsula di Petri per colture cellulari, tritare il tessuto vaginale in piccoli frammenti, utilizzando due bisturi sterili. Assicurarsi che le punte delle lame siano perpendicolari alla superficie del tessuto. Applicare una pressione uguale e costante sulla superficie del tessuto, utilizzando due bisturi.

Eseguire un'azione di trazione alternata per tagliare i tessuti in pezzi molto piccoli. Ripetere questa tecnica di tritatura, utilizzando due bisturi, fino a quando il campione non è di consistenza uniforme con pezzi da uno a due millimetri. Aggiungere due o tre millilitri di terreno di coltura cellulare privo di siero alla piastra, sospendendo il tessuto tritato.

Pipettare la soluzione contenente frammenti di tessuto su e giù per rompere eventuali grumi. Trasferire la soluzione contenente frammenti di tessuto in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere ulteriori terreni di coltura cellulare privi di siero fino a quando il volume totale è di 10 millilitri.

Conservare Liberase in aliquote da 230 microlitri per l'uso. Aggiungere 230 microlitri di Liberace al tubo. Incubare le provette per tre ore a 37 gradi Celsius con agitazione costante e vigorosa, utilizzando un miscelatore di campioni.

Mantenere un'agitazione costante. Agitare le provette a intervalli di 30 minuti durante l'incubazione. Centrifugare i campioni per cinque minuti a 3000 g.Rimuovere ed eliminare il surnatante.

Risospendere il pellet in uno o due millilitri di terreno di coltura cellulare con il 10% di siero bovino fetale per diluire il Liberase. Pipettare energicamente fino a quando il pellet non è completamente risospeso. Filtrare la sospensione enzimatica tissutale pipettando delicatamente la soluzione sul colino cellulare.

Estrarre insieme le sospensioni cellulari da più biopsie tissutali dello stesso donatore. Con lo stantuffo di una siringa sterile da cinque millilitri, premere la sospensione enzimatica tissutale sopra il colino. Ripetere questo passaggio fino a quando i frammenti di tessuto rimanenti sembrano essere completamente premuti.

Sospensione cellulare prelevata da più biopsie vaginali dello stesso donatore su una singola piastra di Petri. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, osservare le cellule con un microscopio a contrasto di fase. Assicurarsi che la messa a fuoco del microscopio sia sul fondo della piastra.

Un piccolo numero di fibroblasti sarà attaccato al fondo. Ecco una rappresentazione schematica del protocollo, che evidenzia i passaggi chiave. La seconda figura mostra un'immagine a contrasto di fase delle cellule sospese il giorno zero.

La figura tre è un'immagine a contrasto di fase dei fibroblasti primari vaginali al 14° giorno di coltura con un ingrandimento di 100X da una sospensione tirata di tre biopsie di tessuto quadrato di un centimetro. La prima tabella mostra i risultati dell'utilizzo di altri protocolli per tentare l'isolamento dei fibroblasti vaginali in questo studio. I fibroblasti sono stati identificati mediante colorazione positiva del mentone.

L'analisi di immunofluorescenza è stata eseguita sui tessuti vaginali in premenopausa e postmenopausa mostrati qui. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 200X. I fibroblasti isolati sono stati anche colorati con alfa actina della muscolatura liscia e F actina in campioni di tessuto in premenopausa e postmenopausa.

Abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato e affidabile per l'isolamento dei fibroblasti primari dalla mucosa vaginale in donatori anziani. L'uso di protocolli precedentemente pubblicati per tessuti animali e umani per la dissociazione delle cellule primarie non è riuscito a estrarre alcun fibroblasto da campioni vaginali umani in questo studio. Ipotizziamo due probabili ragioni per le sfide della dissociazione cellulare dal tessuto vaginale umano.

Lo spessore dermico della mucosa è maggiore nei donatori più anziani e rispetto a quello del tessuto non mucoso, e la densità dei fibroblasti può essere notevolmente ridotta negli individui più anziani. Alcuni passaggi critici non devono essere modificati. L'implementazione di una digestione meccanica molto rigorosa, utilizzando la tecnica dei due bisturi, e l'unione delle sospensioni cellulari di tre o quattro biopsie a tutto spessore di un singolo donatore.

Il nostro protocollo ha un netto vantaggio. La digestione meccanica ed enzimatica porta a migliori rese per il tessuto in postmenopausa, ma non ha un impatto negativo sui campioni in premenopausa. Riconosciamo diverse limitazioni al nostro protocollo.

L'accesso al tessuto vaginale umano può essere difficile in situazioni in cui non viene eseguita la chirurgia del prolasso vaginale e anche la necessità di estrarre sospensioni cellulari di più campioni di biopsia tissutale può essere una limitazione. Questo protocollo per la richiesta di fibroblasti vaginali umani sarà uno strumento utile per future indagini sui disturbi del pavimento pelvico, in particolare negli individui in post-menopausa, nonché un'importante aggiunta alla ricerca sulla salute delle donne.