Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello dopo emorragia subaracnoidea
18 agosto 2023
L'indagine preliminare conferma che l'emorragia subaracnoidea (SAH) provoca la morte dei periciti cerebrali. La valutazione della contrattilità dei periciti post-SAH richiede la differenziazione tra periciti cerebrali vitali e non vitali. Pertanto, è stata sviluppata una procedura per etichettare i periciti cerebrali vitali e non vitali contemporaneamente nelle sezioni cerebrali, facilitando l'osservazione utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione.
Il nostro studio ha mostrato un aumento significativo dei decessi per periciti. Quindi, a partire da un cavallo malato dopo la SAH, ha dimostrato una correlazione positiva tra il numero di parassiti a bassa vitalità e il tempo trascorso dopo la SAH. L'imaging dei parassiti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello seguendo la SAH e le tecniche di isolamento dei parassiti, hanno fatto progredire la ricerca nel mio campo.
Attualmente, è abbastanza difficile distinguere completamente tra parassiti morti e cellule endoteliali morte. Il nostro studio trova l'apoptosi dipendente dalla contrazione nei parassiti dopo SAH. Abbiamo sviluppato un protocollo molto affidabile, che consente la marcatura fluorescente, sia funzionale che non funzionale di un parassita cerebrale nelle sezioni cerebrali, e allo stesso tempo.
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Panoramica
Questo studio analizza gli effetti dell'emorragia subaracnoidea (SAH) sui periciti cerebrali, mettendo in evidenza i meccanismi di morte cellulare e contrattilità dei periciti. È stato sviluppato un modello che utilizza fette di cervello di ratto per differenziare tra periciti vitali e non vitali. Questo approccio consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per valutare la vitalità dei periciti dopo l'SAH.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Microscopia a immunofluorescenza
Sfondo
- Si sa che l'ematoma subaracnoideo (SAH) induce la morte dei periciti cerebrali.
- Comprendere la vitalità dei periciti dopo l'SAH è fondamentale per chiarire i meccanismi del danno neurovascolare.
- I metodi attuali hanno difficoltà a distinguere in modo adeguato tra periciti vitali e non vitali.
- Sono necessarie nuove tecniche di imaging per osservare le alterazioni dei periciti nell'SAH.
Scopo dello studio
- Valutare la contrattilità dei periciti e la vitalità cellulare dopo emorragia subaracnoidea (SAH).
- Sviluppare un protocollo affidabile per l'etichettatura simultanea di periciti vitali e non vitali.
- Migliorare le tecniche di imaging per osservare in modo più accurato il comportamento dei periciti in sezioni cerebrali.
Metodi Utilizzati
- Le fette di cervello di ratto sono state utilizzate come modello ex vivo per lo studio dei periciti.
- L’emorragia subaracnoidea è stata indotta iniettando sangue autologo nella cisterna soprasellare di ratti anestetizzati.
- Lo studio ha utilizzato tecniche di immunofluorescenza per etichettare i periciti e valutarne la vitalità.
- I passaggi principali hanno incluso incubazioni con coloranti fluorescenti e analisi di imaging mediante microscopia confocale.
- I tempi per la valutazione della vitalità dei periciti sono stati monitorati a diverse ore dopo l’emorragia subaracnoidea.
Risultati principali
- Lo studio ha riscontrato un aumento significativo della morte dei periciti a partire da sei ore dopo l’emorragia subaracnoidea (SAH).
- È stata osservata una correlazione positiva tra il numero di periciti non vitali e il tempo trascorso dalla SAH.
- Da un punto di vista meccanicistico, è stata osservata apoptosi dipendente dalla contrazione nei periciti dopo la SAH.
- I periciti vitali sono stati identificati accanto alle varianti non vitali mediante tecniche di marcatura fluorescente.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo affidabile per differenziare tra periciti vitali e non vitali dopo l’emorragia subaracnoidea (SAH).
- I risultati migliorano la comprensione della dinamica dei periciti nelle risposte neurovascolari al danno tissutale.
- Le implicazioni riguardano anche la comprensione del danno neurovascolare in varie patologie cerebrali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La differenziazione affidabile tra periciti cerebrali vitali e non vitali in sezioni cerebrali acute dopo emorragia subaracnoidea (SAH) risponde a un'importante lacuna nella validazione degli obiettivi neurovascolari. Questo protocollo consente una valutazione quantitativa ad alta risoluzione della contrattilità e vitalità dei periciti, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase di scoperta. L'approccio migliora la fiducia predittiva nella selezione precoce di bersagli neurovascolari e nel triage del portafoglio nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette la visualizzazione diretta e la quantificazione della vitalità dei periciti dopo un danno, per una validazione solida dei bersagli.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico correlando la contrattilità dei periciti con le alterazioni microvascolari dopo emorragia subaracnoidea (SAH).
- Facilita l'identificazione di bersagli neurovascolari con valore predittivo traslazionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema validato ex vivo per la valutazione riproducibile della funzione e vitalità dei periciti.
- Fornisce output quantitativi di imaging adatti alla standardizzazione dei saggi e ai flussi di lavoro per lo screening successivo.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulla contrattilità e sopravvivenza dei periciti in un contesto tissutale rilevante per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le misurazioni della vitalità e della contrattilità dei periciti ai biomarcatori traslazionali del danno neurovascolare.
- Supporta la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica nei modelli vascolari del sistema nervoso centrale.
- Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento terapie neurovascolari corrette in base al rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nella fase iniziale del passaggio dalla scoperta alla preclinica per i bersagli neurovascolari, collegando studi meccanicistici e validazione di modelli traslazionali.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sulla disfunzione microcircolatoria mediata dai periciti dopo emorragia subaracnoidea (SAH).
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e la selezione di composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico della vitalità e della contrattilità dei periciti in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti ex vivo a modelli in vivo di danno neurovascolare per l'allineamento di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per l'imaging e la marcatura nell'ambito delle ricerche vascolari del sistema nervoso centrale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi neurovascolari e riduce l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizza la valutazione della vitalità dei periciti e l'acquisizione di immagini per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale, consentendo una riduzione precoce dei rischi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei programmi neurovascolari in base a dati robusti sulla vitalità, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine confocale e nella manipolazione di tessuti neurovascolari.
- Richiede l'accesso a microscopi a fluorescenza avanzati e a software analitici.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi dei protocolli di marcatura e di acquisizione delle immagini.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi modelli di malattie del sistema nervoso centrale o per specie diverse.
- L'interpretazione potrebbe essere limitata dalla specificità del colorante e dal suo sovraffollamento con la marcatura delle cellule endoteliali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:06
Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging
2:05
Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging
3:40
Confocal Imaging of Vital and Non‐Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices
