Name: Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri l'isolamento di astrociti e microglia dal midollo spinale di topo adulto mediante dissociazione enzimatica e separazione cellulare. Questo protocollo consente studi in vitro e analisi trascrittomiche sulle patologie spinali.

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Ringraziamo Castle Raley del George Washington University Genomics Core per le analisi dell'RNA e Q2 Lab Solutions per le analisi di sequenziamento dell'RNA. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke [sovvenzione numero F31NS117085] e dal Vivian Gill Research Endowment al Dr. Robert H. Miller. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali sono state condotte a seguito dell'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Lo studio ha utilizzato topi maschi e femmine C57BL/6J wild-type (WT) di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, provenienti da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e ospitati presso la George Washington University. Nella Figura 1 viene presentata una panoramica del flusso di lavoro del protocollo.
1. Preparazione del midollo spinale
<ol><li>Anestetizzare gli animali utilizzando Avertin (12,5 mg/mL di 2,2,2-tribromoetanolo e 2,5% di 2-metil-2-butanolo in acqua sterile) (vedi Tabella dei materiali). Confermare l'assenza di una risposta ai pizzicotti delle dita dei piedi e della coda nei topi.</li>
	<li>Eseguire la perfusione cardiaca con 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) per rimuovere le cellule mononucleate del sangue periferico.<ol><li>Posizionare l'animale su un vassoio poco profondo e praticare un'incisione laterale per esporre la cavità pleurica. Inserire un ago di perfusione da 23 G collegato a una pompa peristaltica (vedere Tabella dei materiali) nel ventricolo sinistro e attivare la pompa. Una volta che il DPBS freddo scorre attraverso il cuore, crea una piccola incisione nell'atrio destro. NOTA: In questa fase è preferibile una velocità di perfusione più rapida per migliorare la vitalità cellulare. Il sangue deve essere eliminato in meno di 1 minuto. La pulizia del fegato indica una perfusione riuscita.</li>
	</ol></li>
	<li>Decapitare l'animale con delle grosse forbici e rimuovere la colonna vertebrale14. Immergerlo in 1x DPBS freddo con Ca2+/Mg2+/0,2% di glucosio in una capsula di Petri su ghiaccio per il risciacquo dei tessuti.</li>
	<li>A partire da ora, assicurarsi che tutte le fasi siano eseguite in un ambiente sterile. Utilizzare l'estrusione idraulica14 per isolare l'intero midollo spinale. Utilizzare un ago da 18 G e una siringa da 10 mL riempita con 1x DPBS freddo con Ca2+/Mg2+/0,2% di glucosio. Trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri posta su impacchi di ghiaccio contenenti una quantità sufficiente di DPBS freddo 1x con Ca2+/Mg2+/0,2% di glucosio per immergere l'intero tessuto.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le meningi al microscopio all'interno di una cappa a flusso laminare. Trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri vuota su impacchi di ghiaccio e, utilizzando un bisturi chirurgico a lama n. 10, tagliare l'intero midollo spinale in sezioni di 2-3 mm.</li>
</ol>2. Dissociazione enzimatica cellulare
<ol><li>Aggiungere la miscela enzimatica 1 e la miscela enzimatica 2 dal kit per la dissociazione cerebrale per adulti disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Agitare più volte gli enzimi nella capsula per garantire un rivestimento uniforme del midollo spinale, quindi incubare a 37 °C per 30 minuti. Ogni 5 minuti, agitare delicatamente il piatto per evitare la formazione di grumi di tessuto e facilitare la distribuzione uniforme dei reagenti.</li>
	<li>Rimuovere la capsula dall'incubatore e aggiungere 350 μL di DNAsi I 0,46 mg/mL in terreno essenziale minimo (MEM) (vedere Tabella dei materiali). Mescolare agitando delicatamente.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di DMEM/0,5% di siero fetale bovino (FBS) freddo e mescolare agitando delicatamente. Trasferire immediatamente l'intero contenuto in una provetta da 5 ml.</li>
</ol>3. Dissociazione meccanica delle cellule
<ol><li>Utilizzando una pipetta P1000, triturare delicatamente il tessuto tre volte, assicurandosi che ogni volta vengano prelevati i pezzi di tessuto per dissociare ulteriormente il tessuto. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur in vetro da 9" tappata, triturare delicatamente altre cinque volte, assicurandosi che non si generino bolle durante il processo.</li>
	<li>Posizionare la provetta da 5 ml in posizione verticale e lasciare che il tessuto si depositi sul fondo per 30 secondi. Una volta che il tessuto si è stabilizzato, prelevare il surnatante utilizzando una pipetta P1000 e farlo passare attraverso un filtro da 30 μm in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Alla stessa provetta da 5 mL con il tessuto rimanente, aggiungere 1 mL di DMEM/0,5% FBS freddo. Utilizzando una pipetta Pasteur, triturare delicatamente tre volte.</li>
	<li>Lasciare che il tessuto si depositi sul fondo per 30 secondi, quindi passare il surnatante attraverso un filtro da 30 μm e raccoglierlo nella stessa provetta da 15 mL di prima. Ripetere ancora una volta i passaggi 3.3 e 3.4.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere con cautela e scartare il surnatante risultante utilizzando un aspiratore sottovuoto.</li>
</ol>4. Rimozione della mielina
<ol><li>Rimuovere la mielina utilizzando la soluzione per la rimozione dei detriti (DRS) fornita nel kit di dissociazione cerebrale per adulti seguendo il protocollo del produttore. Dopo la rimozione dei detriti, aggiungere 5 mL di DMEM/0,5% FBS freddo al pellet cellulare e capovolgere delicatamente la provetta tre volte. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). NOTA: Se le cellule saranno utilizzate per studi in vitro e rimarranno in coltura, è necessario utilizzare DMEM/FBS allo 0,5% preriscaldato.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DPBS/0,5% FBS (a freddo per gli studi sull'RNA e a caldo per i saggi in vitro ). Conta le cellule e valuta la vitalità usando Trypan Blue. NOTA: Le sospensioni cellulari di più animali possono essere combinate per aumentare la concentrazione cellulare.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo DPBS/0,5% FBS fino a un volume totale di 5 mL. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.</li>
</ol>5. Isolamento della microglia e degli astrociti
<ol><li>Etichettare le cellule con microsfere anti-CD11b o anti-ACSA-2 seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Ordinare le celle in base alla selezione positiva utilizzando le colonne MS secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Dopo la cernita, centrifugare le cellule selezionate a 300 x g per 10 minuti e scartare il surnatante.</li>
</ol>6. Cellule di placcatura per saggi in vitro
NOTA: Se le cellule non verranno placcate e verranno utilizzate immediatamente per l'analisi dell'RNA, procedere al passaggio 8.
<ol><li>Risospendere le cellule in 1 mL di DMEM/0,5% FBS caldo. Contare le cellule e valutarne la vitalità utilizzando un ematotometro (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Regolare la concentrazione cellulare a 75.000 cellule per 50 μL. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare a ciascun vetrino coprioggetto rivestito di poli-L-lisina11 in una piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 2 ore per consentire alle cellule di aderire al vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Aggiungere con cautela 450 μL di DMEM/5% FBS/Penicillina-Streptomicina (Pen-Strep, vedere la Tabella dei Materiali) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Dopo 3 giorni, sostituire metà del terreno con 250 μL di DMEM/5% FBS/Pen-Strep caldo. Per la manutenzione, sostituire completamente il terreno con 500 μL di DMEM/5% FBS/Pen-Strep caldo ogni 4-5 giorni.</li>
</ol>7. Immunoistochimica
NOTA: È meglio eseguire le analisi immunoistochimiche dopo almeno 3 giorni quando il terreno è stato sostituito almeno una volta. Ciò garantisce che i detriti siano stati rimossi e che le celle abbiano aderito completamente al vetrino coprioggetto.
<ol><li>Rimuovere il terreno ed etichettare le cellule con anticorpi monoclonali O4 (1:100) (vedere la tabella dei materiali) in DMEM/5% FBS/10% siero di capra normale (NGS) caldo per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) o a 37 °C. NOTA: Saltare questo passaggio e procedere al passaggio 7.3 se le celle non saranno etichettate con O4.</li>
	<li>Sciacquare delicatamente i vetrini coprioggetti immergendoli tre volte in DMEM/5% FBS caldo. Aggiungere 594 IgM anti-topo di capra (1: 300) (vedere la tabella dei materiali) in DMEM/5% FBS/10% NGS caldo e incubare a RT per 15 minuti al buio. Risciacquare delicatamente tre volte in DMEM/5% FBS tiepido.</li>
	<li>Fissare le celle con acido acetico/metanolo freddo al 5% per 15 minuti a 4 °C. Lavare tre volte con 1x PBS, quindi etichettare con l'anticorpo appropriato: GFAP anti-coniglio (1:500), GFAP anti-topo (1:500) o Iba1 anti-coniglio (1:500) in Triton-X100/10% NGS in 1x DPBS (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 1 ora a RT. NOTA: Tenere i vetrini coprioggetti al buio se sono già stati macchiati con O4.</li>
	<li>Risciacquare delicatamente tre volte con PBS. Etichetta con l'anticorpo secondario appropriato: anti-topo 594 IgG (1:500), anti-coniglio 488 IgG (1:500) (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a RT al buio.</li>
	<li>Risciacquare delicatamente tre volte con PBS. Colorante di contrasto con DAPI (1: 1000) per 1 minuto a RT. Risciacquare tre volte con PBS, aggiungere il mezzo di montaggio (vedere la tabella dei materiali) e montare i vetrini coprioggetti sui vetrini.</li>
</ol>8. Estrazione dell'RNA
NOTA: Idealmente, dovrebbero esserci almeno 100.000 cellule per estrarre RNA sufficiente per l'analisi. Se necessario, le cellule di 2-3 midollo spinale possono essere combinate.
<ol><li>Estrarre l'RNA utilizzando un kit di isolamento dell'RNA disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Per ogni fase di lavaggio con il tampone di lavaggio RW1 fornito nel kit, lasciare le celle nel tampone di lavaggio per altri 2 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il DNA genomico rimanente utilizzando DNasi I secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Incubare con DNasi a RT per 15 minuti, quindi lavare con tampone RW1.</li>
	<li>Per aumentare la resa di RNA, prima dell'eluizione, incubare i campioni in acqua priva di RNAsi a RT per 10 minuti. Valutare l'integrità e la quantità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore15 (vedi Tabella dei materiali).</li>
</ol>

Estrazione efficiente di astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto

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<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li>
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<li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).</li>
<li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li>
</ol>

Nessuno

L'isolamento di cellule primarie pure e vitali è fondamentale per studiare la struttura e la funzione di specifici tipi di cellule. Nel topo adulto, in particolare nel midollo spinale, questo compito pone sfide significative, poiché i protocolli esistenti spesso non sono adattati al midollo spinale adulto10,17. Questo protocollo presenta un metodo efficiente ed economico applicabile a varie applicazioni a valle, tra cui colture cellulari, citometria a flusso, ist...

Gli astrociti e le microglia sono cellule gliali versatili che svolgono ruoli vitali nel sistema nervoso centrale (SNC), comprendendo responsabilità come la regolazione della funzione neuronale, contribuendo allo sviluppo del SNC, mantenendo la barriera emato-encefalica e partecipando ad altri processi critici 1,2,3,4 . Oltre al loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi, queste cellule gliali svolgono anche un ruolo fondamentale nei meccanismi di lesione e riparazione. Le microglia sono ben note per le loro capacità fagocitarie, infiammatorie e migratorie in seguito a insulti o lesioni 5,6,7. Le risposte degli astrociti nella malattia sono ugualmente diverse, comprendendo i contributi all'infiammazione, alla formazione di cicatrici gliali e alla compromissione della barriera emato-encefalica 8,9. Sebbene la nostra comprensione dei ruoli dannosi e riparativi della microglia e degli astrociti nel sistema nervoso centrale sia cresciuta, l'eterogeneità intrinseca sia nella loro struttura che nella loro funzione richiede strumenti robusti per studiarli in vari contesti.
Ottenere ulteriori informazioni sul ruolo della microglia e degli astrociti nella salute e nella malattia richiede un approccio combinato di indagini in vivo e in vitro . Le tecniche in vivo sfruttano l'intricato crosstalk tra cellule gliali e neuroni all'interno del sistema nervoso centrale, mentre le metodologie in vitro si rivelano preziose quando si valutano le funzioni o le risposte di singole cellule sotto stimoli specifici. Ogni metodo offre vantaggi unici; Gli studi in vitro sono essenziali per comprendere i ruoli specifici di questi tipi di cellule senza input diretto o indiretto da parte delle cellule vicine. Inoltre, i saggi in vitro che utilizzano linee cellulari immortali presentano alcuni vantaggi, tra cui la capacità di proliferare indefinitamente, l'efficienza dei costi e la facilità di manutenzione. Tuttavia, è importante notare che le cellule primarie imitano più da vicino le normali risposte fisiologiche rispetto alle linee cellulari. Questa rilevanza fisiologica è cruciale nei saggi funzionali e nelle analisi trascrittomiche.
Una delle sfide nell'ottenere cellule primarie, in particolare dal midollo spinale del topo adulto, risiede nella quantità e nella vitalità dei campioni. Il midollo spinale adulto, essendo più piccolo del cervello e contenente una quantità significativa di mielina, pone difficoltà uniche. Sebbene esistano diversi protocolli pubblicati che descrivono in dettaglio l'isolamento di cellule gliali pure e vitali da animali neonatali o dal cervello di topo adulto 10,11,12,13, queste metodologie potrebbero non essere adatte per lo studio di malattie e lesioni specifiche del midollo spinale. In questo protocollo, offriamo una procedura completa per isolare in modo efficiente microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le applicazioni a valle nelle colture cellulari e nelle analisi trascrittomiche. Questo protocollo è stato impiegato con successo per isolare queste cellule da topi adulti di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, dimostrando la sua utilità in vari contesti, tra cui studi che coinvolgono topi knockout condizionali, risposte ai farmaci, ricerca sullo sviluppo e modelli legati all'età.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Avantor</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-2-butanolo, 98%</td><td>Thermo Fisher</td><td>A18304-0F</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Soluzione di glucosio al 45%</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td></td></tr><tr><td>Provette con tappo da 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122305</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione cerebrale adulta</td><td>Miltenyi</td><td>103-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Kit di microsfere Anti-ACSA2</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-679</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Tecnologie</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>topi C57BL/6J wild-type (WT)&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 30 &micro; m filtro</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio (ematocitometro)</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I da pancreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-40KU</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>TMO</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DNasi per la purificazione dell'RNA</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>A5209401</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GFAP (topo)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo GFAP (coniglio)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-topo di capra 594 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11032</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Capra anti-topo 594 IgM</td><td>Invitrogen</td><td>a21044</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio 488 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Iba1 anticorpo (coniglio)</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td>1:500</td></tr><tr><td>MACS Separatore</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L Pump System</td><td>Thermo Fisher</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>O4 Anticorpo</td><td>R & D</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta pasteur in vetro da 9" VWR</td><td></td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Royal-tek Lama per bisturi chirurgico n. 10</td><td>Fisher scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>Set per infusione di piccole vene, 23 G x 19 mm</td><td>Kawasumi</td><td>D3K2-23G</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Gli astrociti e le microglia svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del sistema nervoso centrale, nelle risposte alle lesioni e nelle malattie neurodegenerative. Queste cellule altamente dinamiche mostrano risposte rapide ai cambiamenti ambientali e mostrano una significativa eterogeneità in termini di morfologia, profili trascrizionali e funzioni. Mentre la nostra comprensione delle funzioni delle cellule gliali nella salute e nella malattia è progredita notevolmente, rimane la necessità di analisi in vitro, specifiche per cellule, condotte nel contesto di insulti o lesioni per caratterizzare in modo completo popolazioni cellulari distinte. L'isolamento delle cellule dal topo adulto offre diversi vantaggi rispetto alle linee cellulari o agli animali neonatali, in quanto consente l'analisi delle cellule in condizioni patologiche e in punti temporali specifici. Inoltre, concentrandosi sull'isolamento specifico del midollo spinale, escludendo il coinvolgimento cerebrale, consente la ricerca sulle patologie del midollo spinale, tra cui l'encefalomielite autoimmune sperimentale, la lesione del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica. Questo protocollo presenta un metodo efficiente per isolare astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto, facilitando l'analisi immediata o futura con potenziali applicazioni in studi funzionali, molecolari o proteomici a valle.

I metodi delineati in questo protocollo consentono l'isolamento di microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando varie applicazioni a valle, tra cui saggi funzionali o istologici in vitro e analisi dell'RNA.
Un isolamento di successo per gli studi in vitro si tradurrà in una proliferazione cellulare continua per diversi giorni. Le cellule adulte mostrano un tasso di proliferazione più lento rispetto alle cellule isolate da animali neonat...

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

La nostra ricerca mira a caratterizzare specifiche popolazioni cellulari nel sistema nervoso centrale, in particolare nel midollo spinale, utilizzando modelli preclinici di malattia. E stiamo cercando di determinare come queste cellule sono influenzate in condizioni patologiche e in diversi punti temporali. Può essere difficile analizzare le cellule, soprattutto nel sistema nervoso centrale perché le cellule del cervello e del midollo spinale formano una matrice altamente complessa e tutto è strettamente collegato, quindi può essere difficile isolare queste cellule senza danneggiare il sistema.Il nostro protocollo affronta i limiti dei metodi esistenti per lo studio delle malattie del midollo spinale isolando in modo efficiente gli astrociti vitali della microglia dal piccolo midollo spinale di topo adulto ricco di mielina. Ciò consente la ricerca in vitro sulle malattie correlate al midollo spinale nell'analisi a valle, colmando una lacuna cruciale della ricerca. Questo protocollo presenta diversi vantaggi, come l'analisi di astrociti e microglia in condizioni patologiche e in punti temporali specifici.Si concentra anche unicamente sull'isolamento delle cellule gliali da questo solo midollo spinale adulto, escludendo il coinvolgimento del cervello. Ciò consente ai ricercatori di studiare le patologie del midollo spinale a livello cellulare.

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In questo video, descriviamo il metodo per ottenere una preparazione pura di astrociti da topi appena nati.

Isolamento degli astrociti: un metodo per ottenere una preparazione pura di astrociti corticali di topo

Il video dimostra una tecnica per isolare la microglia dalla corteccia del cervello di un topo adulto. In primo luogo, la corteccia subisce la segmentazione e l'omogeneizzazione per rimuovere i neuroni e altre cellule gliali, preservando la microglia. Successivamente, la sospensione cellulare viene esposta a microsfere magnetiche anti-mielina e a un campo magnetico, separando efficacemente le microglia e le cellule mieloidi dai detriti di mielina e dalle cellule contenenti mielina.

Isolamento della microglia dalla corteccia di un cervello di topo adulto

Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per generare colture altamente arricchite di astrociti derivati da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi postnatali e la loro conversione diretta in neuroni funzionali mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione.

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Le microglia sono considerate alcune delle cellule più versatili del corpo, capaci di adattamento morfologico e funzionale. La loro eterogeneità e multifunzionalità consente il mantenimento dell'omeostasi cerebrale, pur essendo legata a diverse patologie neurologiche. Qui viene descritta una tecnica per purificare la microglia del midollo spinale.

Arricchimento rapido ed efficiente della microglia del midollo spinale del topo

Scopri l'isolamento di astrociti e microglia dal midollo spinale di topo adulto mediante dissociazione enzimatica e separazione cellulare. Questo protocollo consente studi in vitro e analisi trascrittomiche sulle patologie spinali.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

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