Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci

Una delle terapie antitumorali mirate più efficaci si basa su anticorpi come l'anticorpo anti-HER2 trastuzumab. L'azione antitumorale del trastuzumab coinvolge la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente, ADCC, da parte di cellule natural killer o NK. La comprensione dei meccanismi che regolano la sensibilità delle cellule tumorali alla terapia con anticorpi anti-recettori del fattore di crescita, con particolare riguardo all'ADCC, potrebbe essere cruciale per lo sviluppo di nuove e più efficienti modalità di trattamento.

I modelli 3D come gli sferoidi delle cellule tumorali si sono dimostrati superiori nel predire le risposte immunitarie dei tumori a varie terapie antitumorali. Pertanto, abbiamo creato un modello di sferoide ADCC utilizzando la linea cellulare natural killer NK92, cellule di carcinoma mammario JIMT-1 che esprimono GFP e trastuzumab. Abbiamo impostato il sistema di dosaggio ADCC inducendo le cellule di carcinoma mammario JIMT-1 anti-HER2-positive a formare cluster tridimensionali chiamati sferoidi.

La linea cellulare JIMT-1 utilizzata negli esperimenti esprime stabilmente la proteina fluorescente verde. Iniziamo l'esperimento preparando la piastra a 96 pozzetti per la formazione di sferoidi. Per creare un fondo a forma di U e repellente alle cellule, rivestire la piastra a 96 pozzetti con una soluzione di agarosio allo 0,5% in PBS.

Incubare la piastra a temperatura ambiente per circa 30-45 minuti. Nel frattempo, tripsinizzazione e conteggio delle cellule JIMT-1 per la semina cellulare. Lavare le cellule con due millilitri di PBS sterile.

Aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA al pallone e rimettere il pallone in un incubatore a CO2 per 10 minuti. Dopo l'incubazione, picchiettare il pallone per verificare se le cellule JIMT-1 si sono staccate. Fermare la digestione con due millilitri di terreno JIMT-1 e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri.

Contare le cellule con Trypan Blue in una camera di Burker e regolare il numero di cellule a 20.000 cellule per ml. Seminare le cellule nella piastra a 96 pozzetti pipettando 100 microlitri di sospensione cellulare su ciascun pozzetto per la formazione di sferoidi. Lasciare che le cellule si aggreghino durante il tempo di incubazione di tre giorni a 37 gradi in un incubatore a CO2.

Controllare regolarmente le dimensioni e la forma degli sferoidi con un microscopio invertito. Il terzo giorno dopo l'induzione degli sferoidi, rivestire la piastra di screening ad alto contenuto a 96 pozzetti con una soluzione di Pluronic F-127 in DMSO. Il rivestimento è fondamentale per evitare l'attaccamento degli sferoidi JIMT-1 EGFP alla superficie del vetro o alla piastra.

Dopo un periodo di incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente, aspirare la soluzione di rivestimento e lavare due volte i pozzetti con il terreno privo di siero DMEM F12. Trasferire gli sferoidi sulla piastra di screening ad alto contenuto a 96 pozzetti in triplicati utilizzando una pipetta da un millilitro. Aggiungere sunitinib ai pozzetti alla concentrazione di 40 micromolari in 10 microlitri per pozzetto e pipettare terreni JIMT-1 freschi nei pozzetti di controllo per aumentare il volume.

Incubare la piastra per un'ora in un incubatore a CO2 a 37 gradi. Mentre è in corso l'incubazione degli sferoidi pretrattati, raccogliere le cellule NK92 dal pallone in una provetta da 15 millilitri. Conta le cellule con Trypan Blue in una camera di Burker e regola il numero di cellule per raggiungere un rapporto effettore-bersaglio di 20 a 1.

Colorare le cellule NK con una soluzione di 10 micromolari di CellTracker Blue e metterle in un incubatore a CO2 per un'ora a 37 gradi. Per lavare l'eccesso di colorante, centrifugare le celle NK due volte a 150 RCF per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere le cellule in un terreno JIMT-1 fresco.

Aggiungere le cellule NK colorate agli sferoidi EGFP JIMT-1 bersaglio pipettando 55 microlitri per pozzetto insieme all'anticorpo anti-HER2 trastuzumab. Diluire trastuzumab nel terreno JIMT-1 fino a raggiungere una concentrazione di 10 microgrammi per ml. Aggiungere i 110 microlitri di terreno JIMT-1 fresco ai pozzetti di controllo e incubare la piastra per 24 ore in un incubatore a CO2 a 37 gradi.

Di conseguenza, il volume totale di trattamento aggiunto per l'ADCC è di 110 microlitri e la concentrazione finale di sunitinib è di 20 micromoli per litro. Per rilevare e misurare la morte cellulare apoptotica dopo i trattamenti, colorare gli sferoidi con un coniugato di annessina V Alexa Fluor 647 per un'ora in terreno JIMT-1. Al termine delle fasi sperimentali, trasferire la piastra al dispositivo di analisi ad alto contenuto.

La piastra viene sottoposta a imaging 24 ore dopo l'aggiunta dei fattori NK alle cellule bersaglio. Per l'imaging, utilizziamo l'analizzatore ad alto contenuto e un software di analisi delle immagini. Selezionare il tipo di micropiastra dall'elenco delle piastre utilizzando l'opzione Tipo di piastra.

Utilizzare una piastra di screening ad alto contenuto a 96 pozzetti. Selezionare l'autofocus a due picchi come saggi eseguiti su lastre con obiettivo 10x con apertura numerica di 0,3, utilizzando rispettivamente le opzioni di messa a fuoco automatica e obiettivo. Scegliete la modalità Confocale con l'opzione OptiMode e applicate Binning 2 all'utilizzo dell'opzione Binning.

Per l'imaging degli sferoidi, selezionare i canali appropriati utilizzando l'opzione Selezione canale. Per rilevare le celle JIMT-1 trasfuse con EGFP, scegliere EGFP con tempo di integrazione di 200 millisecondi, potenza laser del 50%, altezza dello stack di due micrometri, eccitazione di 488 nanometri e lunghezze d'onda di emissione di 500, 550 nanometri. E per rilevare le cellule apoptotiche, usa Alexa 647 con tempo di integrazione di 100 millisecondi, potenza laser del 50%, altezza dello stack di 10 micrometri, eccitazione di 640 nanometri, lunghezze d'onda di emissione di 650, 760 nanometri.

Per visualizzare le cellule NK all'interno degli sferoidi, scegliere il seguente canale, DAPI con tempo di integrazione di 100 millisecondi, potenza laser del 50%, altezza della pila di due micrometri, eccitazione di 405 nanometri e lunghezza d'onda di emissione di 435, 418 nanometri. Nell'opzione Selezione layout, selezionare Pile Z poiché le cellule negli sferoidi tendono a trovarsi su piani focali diversi del microscopio. 10 piani con una distanza di 10 micrometri sono sufficienti per coprire l'intera regione sferoidale.

Impostare i valori del primo piano e dell'ultimo piano rispettivamente a 0 micrometri e 90 micrometri. Prima di iniziare la misurazione, è possibile acquisire immagini campione con la funzione Snapshot per verificare le impostazioni corrette. Impostare il numero di pozzetti e campi per l'imaging utilizzando l'opzione Layout definito.

Identifica gli sferoidi in base alla fluorescenza EGFP o alle cellule JIMT-1 utilizzando l'opzione Fine Texture Region e filtrali in base alle dimensioni. Rimuovere gli oggetti bordo utilizzando il modulo Seleziona popolazione. Poiché le cellule positive all'annessina compaiono sugli sferoidi periferici, misurare l'intensità dell'annessina nell'anello apoptotico.

Nel modulo Seleziona regione, impostare il bordo esterno su meno 90. Esprimere i valori di intensità dell'annessina come intensità media. Come indicato dalla colorazione con annessina V, l'aggiunta di cellule NK e trastuzumab alle cellule JIMT-1 ha causato la morte cellulare negli sferoidi tumorali.

Le cellule apoptotiche positive all'annessina sono emerse nella zona periferica degli sferoidi. In assenza di trastuzumab, tuttavia, le cellule NK non hanno innescato l'apoptosi delle cellule tumorali. Per distinguere tra gli effetti diretti o mediati dall'ADCC di trastuzumab, in questo studio è stato utilizzato trastuzumab-Fab2 privo di capacità di legame con la regione FC come controllo negativo.

Poiché trastuzumab-Fab2 è risultato inefficace in questo modello, è probabile che la morte delle cellule tumorali sia mediata dall'ADCC. Inoltre, il pretrattamento con sunitinib ha ridotto la colorazione dell'annessina V negli sferoidi, confermando la resistenza all'ADCC indotta da sunitinib e rivelando la prevenzione della morte cellulare apoptotica negli sferoidi JIMT-1 co-incubati con cellule NK e trastuzumab. Questi dati hanno confermato l'effetto citoprotettivo di sunitinib nel modello ADCC e invitano alla cautela riguardo alle potenziali combinazioni di immunoterapie basate su ADCC e sunitinib.

In sintesi, il nostro test HCS potrebbe essere adatto per l'identificazione di composti che stimolano l'ADCC.