Name: Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Scopri l'analisi dei progenitori miogenici in vivo durante la rigenerazione muscolare mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità. Questo metodo identifica firme molecolari uniche nelle cellule staminali muscolari.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisi CyTOF a cellula singola di progenitori miogenici nella rigenerazione muscolare

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>ago da 20 G</td><td>KDM</td><td>KD-fine 900123</td><td></td></tr><tr><td>siringa da insulina da 28 g, 0,5 mL&nbsp;</td><td>Siringa da</td> insulina BD <td>329461</td><td></td></tr><tr><td>29 G, 0,3 mL</td><td>324702</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 3 mL Terumo</td><td>medical</td><td>MDSS03SE</td><td></td></tr><tr><td>40 &; filtri cellulari m</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587522</td><td></td></tr><tr><td>provette in polipropilene da 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene da 5 mL con 35 &micro; filtro per cellule m</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 5 mL</td><td>Terumo medical</td><td>SS05LE1</td><td></td></tr><tr><td>provetta da centrifuga da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2-deossiuridina (IdU)</td><td>Merck</td><td>I7125-5g</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)</td><td>Biolegend</td><td>123605</td><td>Stock = 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD11b APC-Cy7 (clone: M1/70Biolegend</td><td></td> <td>101226</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)</td><td>Biolegend</td><td>102440</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD9 APC (clone: KMC8)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0091-82</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108126</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-&alfa; 7 integrina PE (clone: R2F2))</td><td>UBC AbLab</td><td>67-0010-05</td><td>Stock = 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III (4 laser) strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>405, 488, 561 e 633 nm</td></tr><tr><td>laser Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td></td><td>Ceva Vnr 054594</td><td></td></tr><tr><td>CD104 (clone: 346-11A)</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td>Dy162; </td></tr><tr><td>CD106/VCAM-1 coniugato in-house (clone: 429 MVCAM. A)</td><td>Biolegend</td><td>105701</td><td>Er170; CD11b coniugato in-house</td></tr><tr><td>(clone: M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td>Nd148; </td></tr><tr><td>CD29/Integrina e beta coniugati internamente; 1 (clone: 9EG7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553715</td><td>Tm169; CD31 coniugato in-house</td></tr><tr><td>(clone: MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td>Sm154; CD34 coniugato in-house</td></tr><tr><td>(clone: RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>551387</td><td>Lu175; CD44 coniugato in-house</td></tr><tr><td>(clone: IM7)</td><td>BD Biosciences</td><td>550538</td><td>Yb171; CD45 coniugato in-house</td></tr><tr><td>(clone: MEC 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td>Sm147; CD9 coniugato in-house</td></tr><tr><td>(Clone: KMC8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0091-85</td><td>Yb174; </td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 coniugato in-house (clone: 30-H12)</td><td>BD Biosciences</td><td>553009</td><td>Nd144; CD98 coniugato in-house</td></tr><tr><td>(clone: H202-141)</td><td>BD Biosciences</td><td>557479</td><td>Pr141; Soluzione di acquisizione cellulare coniugata in-house</td></tr><tr><td>/Maxpar tampone CAS</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td></td></tr><tr><td>Cell-ID Intercalator-Iridium</td><td>Standard Biotools</td><td>201192B</td><td>Intercalatore di acido nucleico cationico</td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td>Pt195</td></tr><tr><td>Cisplatino (cis-Diamminplatinum(II) dichloride)</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>Trasparente 1,5 mL tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Tipo II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio</td><td>Merck</td><td>BR718620-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )</td><td>BD Biosciences</td><td>551852</td><td>Gd158; Coniugato in-house</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg/mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Scuro Tubo da 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15386548</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific 17105041</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (a basso contenuto di glucosio, con piruvato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico)</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>Na2EDTA-2H20</td></tr><tr><td>EQ Perle di calibrazione a quattro elementi (perle EQ)</td><td>Standard Biotools</td><td>201078</td><td>Perle di calibrazione</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, origine brasiliana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5SF</td><td>fine Strumenti scientifici</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #7</td><td>Hounisen.com</td><td>1606.3350</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Helios CyTOF</td><td>Standard Biotools</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo, inattivato termicamente, origine neozelandese</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-050-088</td><td></td></tr><tr><td>IdU</td><td>Merck</td><td>I7125</td><td>I127</td></tr><tr><td>Iridio-Intercalatore</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td>Ir191/193</td></tr><tr><td>Isoflurano/Attano Vet</td><td>ScanVet</td><td>Vnr 055226</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/3900/17</td><td></td></tr><tr><td>Myf5 (clone: C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-302</td><td>Yb173; MyoD coniugato interno</td></tr><tr><td>(clone: 5.8A)</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td>Dy164; MyoG coniugato interno</td></tr><tr><td>(clone: F5D)</td><td>BD Biosciences</td><td>556358</td><td>Gd160; Flacone</td></tr><tr><td>monouso sterile Nalgene coniugato in-house 0,20 &mu; M PES Filtri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>595-4520</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>Latoxan</td><td>L8104</td><td>Risospensione a 50 &micro; g/ml in PBS sterile. Mantieni le scorte (es. 50 &micro; l) a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Miscela di nutrienti F-10 (Ham's)</td><td>Thermo Fisher Scientific 31550031</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAkt (Clone: D9E)</td><td>Standard Biotools</td><td>3152005A</td><td>Sm152</td></tr><tr><td>Pax7 (Clone: PAX7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-81648</td><td>Eu153; </td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina coniugata in-house (10.000 U/mL) (Pen/Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti PES 0,20 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa PES</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di</td><td>Petri Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>grado EM MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, monobasico,&nbsp; anidro (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific 10573181</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRb (clone: J112-906)</td><td>Standard Biotools</td><td>3166011A</td><td>Er166</td></tr><tr><td>pS6 chinasi (clone: N7-548)</td><td>Standard Biotools</td><td>3172008A</td><td>Yb172</td></tr><tr><td>Sca-1 (clone: E13-161.7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553333</td><td>Nd142; Sodio azide coniugato</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553515</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, bibasico, eptaidrato (Na2HPO4-6H2O)</td><td>Merck</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile 0,9%</td><td>Fresenius</td><td>B306414/02</td><td></td></tr><tr><td>&alfa; 7 integrina (clone: 3C12)</td><td>MBL international</td><td>K0046-3</td><td>Ho165; Coniugato internamente</td></tr></tbody></table>

identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

Qui presentiamo una panoramica della configurazione sperimentale per l'utilizzo di questo approccio combinato che include (i) l'analisi CyTOF ad alta dimensionalità di un decorso temporale di lesione acuta mediante iniezione di notexin per studiare la dinamica cellulare e molecolare delle cellule staminali e progenitrici nel muscolo scheletrico (Figura 1, schema in alto); e (ii) FACS di cellule staminali e progenitrici utilizzando due marcatori di superficie cellulare, CD9 e CD104, per isola...

Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...

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Metodo per la dissociazione enzimatica, l'etichettatura e la purificazione della superficie mediante citometria a flusso di fibro / adipogenico e progenitori miogenici da topo muscolo scheletrico.

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

I principali tipi di cellule aderenti derivati dal muscolo umano sono le cellule miogeniche e i fibroblasti. Qui, le popolazioni cellulari vengono arricchite utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente basato sull'antigene CD56. La successiva immunomarcatura con anticorpi specifici e l'uso di tecniche di analisi delle immagini consentono la quantificazione delle caratteristiche citoplasmatiche e nucleari nelle singole cellule.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per indurre rigenerazione muscolare acuta nei topi adulti e successive manipolazioni dei muscoli, come dissezione, gelati, taglio, colorazione di routine, e myofiber analisi sezione trasversale.

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

L'autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l'attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Qui descriviamo una metodologia per ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal tessuto muscolare adulto. Queste cellule sono utilizzate per studiare la differenziazione muscolare scheletrica in vitro e, in particolare, per studiare le proteine ​​coinvolte nella segnalazione Ca 2+ .

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell&#39;entrata del calcio a livello di deposito

Differenziazione del muscolo scheletrico è un processo altamente dinamico, che in particolare si basa sul posizionamento nucleare. Qui, descriviamo un metodo per tracciare i movimenti di nuclei da formazione immagine di tensione delle cellule durante la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti ed effettuare una caratterizzazione quantitativa delle dinamiche di nuclei di estrazione di informazioni da inseguimento automatico.

Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica.  Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

Descriviamo un metodo in vivo per studiare la perdita funzionale di un gene specifico nelle cellule satellitari utilizzando una combinazione di lesione mediata dalla cardiotossina del muscolo scheletrico e l'iniezione di un siRNA auto-disporsi.

Analisi della funzione cellulare satellitare durante la rigenerazione muscolare scheletrica mediante lesione cardiotossina e iniezione di siRNA auto-consegnante In Vivo

Questo protocollo delinea un metodo per isolare i progenitori fibro-adipogeni (FAP) e i progenitori miogeni (MP) dal muscolo scheletrico del ratto. L'utilizzo del ratto nei modelli di lesione muscolare fornisce una maggiore disponibilità di tessuto dal muscolo atrofico per l'analisi e un repertorio più ampio di metodi convalidati per valutare la forza muscolare e l'andatura negli animali in movimento libero.

Identificazione, isolamento e caratterizzazione di progenitori fibro-adipogeni (FAPs) e progenitori miogeni (MP) nel muscolo scheletrico nel ratto

In questo protocollo viene descritto un metodo di coltivazione e analisi funzionale in vitro per le cellule staminali muscolari, che conserva la maggior parte delle loro interazioni con la loro nicchia endogena.

Test di coltura di una singola miofibra per la valutazione della funzionalità delle cellule staminali muscolari adulte Ex Vivo

L'identificazione precisa delle cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e delle cellule staminali muscolari (MuSC) è fondamentale per studiare la loro funzione biologica in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo fornisce linee guida per l'isolamento, la purificazione e la coltura di FAP e MuSC da muscoli di topo adulti.

FACS-isolamento e coltura di progenitori fibro-adipogeni e cellule staminali muscolari da muscolo scheletrico di topo imperturbato e ferito

Scopri l'analisi dei progenitori miogenici in vivo durante la rigenerazione muscolare mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità. Questo metodo identifica firme molecolari uniche nelle cellule staminali muscolari.

Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità (Video) | JoVE Journal

Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità

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