Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità
1 dicembre 2023
Il protocollo qui presentato consente l'identificazione e l'analisi ad alta dimensionalità delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici mediante citometria di massa a singola cellula e la loro purificazione mediante FACS per studi approfonditi della loro funzione. Questo approccio può essere applicato per studiare le dinamiche di rigenerazione in modelli di malattia e testare l'efficacia degli interventi farmacologici.
La nostra ricerca indaga i meccanismi molecolari alla base della disfunzione delle cellule staminali nell'invecchiamento e nella malattia. Il nostro obiettivo è capire come le cellule staminali muscolari e le cellule progenitrici interagiscono con altre cellule nel microambiente muscolare per ottenere una rigenerazione efficace. Stiamo anche studiando se una comunicazione cellulare sterile influisce sulla funzione delle cellule staminali muscolari nell'invecchiamento e nella malattia.
Uno dei principali ostacoli allo studio della comunicazione cellula-cellula all'interno della nicchia delle cellule staminali è stata la mancanza di tecnologie che forniscano la risoluzione di una singola cellula. La citometria di massa a singola cellula consente l'analisi quantitativa simultanea ad alto rendimento su più tipi di cellule e fenotipi molecolari in tessuti complessi. Il nostro protocollo consente la purificazione e la profilazione profonda delle cellule staminali rare e della progenie durante la rigenerazione muscolare utilizzando anticorpi contro i marcatori della superficie cellulare e i fattori di trascrizione miogenici.
Lo studio di queste cellule ci aiuta a capire come viene controllato il destino delle cellule staminali muscolari e a scoprire le reti che guidano le transizioni di stato cellulare effettuando una rigenerazione efficace. Misurare fino a 50 proteine della superficie cellulare e intracellulari contemporaneamente a livello di singola cellula è un approccio prezioso per studiare la funzione cellulare nel tessuto muscolare. Questa tecnica può identificare firme molecolari uniche e rivelare nuovi meccanismi di disfunzione delle cellule staminali muscolari nell'invecchiamento e nella malattia.
Questo protocollo consente di studiare come la transizione dello stato cellulare influisce sulla rigenerazione tissutale in salute e malattia. La firma delle cellule staminali attivate che presentiamo qui consente studi sulla quiescenza delle cellule staminali. In precedenza non erano possibili.
Ora possiamo purificare le cellule staminali attivate, CD98 High, CD44 High, basandoci esclusivamente sul marcatore della superficie cellulare, e studiare per la prima volta come tornano alla quiescenza.
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Panoramica
Questa ricerca indaga i meccanismi molecolari alla base della disfunzione delle cellule staminali e progenitrici muscolari nell'invecchiamento e nelle malattie. Attraverso l'applicazione della citometria di massa a singola cellula e della FACS, lo studio si concentra su come queste cellule interagiscono all'interno del microambiente muscolare e sui loro ruoli nella dinamica della rigenerazione, fornendo spunti per possibili interventi terapeutici.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia muscolare
- Funzione delle cellule staminali
- Dinamiche di rigenerazione
Sfondo
- La disfunzione delle cellule staminali compromette la rigenerazione dei tessuti nell'invecchiamento e nelle malattie.
- Una comunicazione efficace tra cellule è fondamentale all'interno della nicchia delle cellule staminali.
- Le tecnologie precedenti non disponevano di risoluzione a singola cellula per uno studio dettagliato.
Metodi Utilizzati
- Citometria di massa a singola cellula per l'analisi ad alta dimensione.
- FACS (sorting cellulare attivato da fluorescenza) per la purificazione delle cellule.
- Modelli murini in vivo per studi sulla rigenerazione.
Risultati principali
- Identificazione di firme molecolari uniche nelle cellule staminali muscolari.
- Conoscenze sullo stato di quiescenza e sulla riattivazione delle cellule staminali.
- Caratterizzazione delle transizioni di stato cellulare fondamentali per una rigenerazione efficace.
Conclusioni
- Questo studio dimostra l'utilità di tecniche avanzate di citometria per comprendere la biologia delle cellule staminali muscolari.
- I risultati sono rilevanti per lo sviluppo di strategie terapeutiche contro la degenerazione muscolare legata all'età.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La citometria di massa ad alta dimensione a livello di singola cellula consente l'identificazione precisa e il profilo dei progenitori miogenici e delle cellule staminali durante un danno acuto al muscolo scheletrico, colmando una lacuna fondamentale nella comprensione della dinamica rigenerativa. Questa capacità aumenta la sicurezza predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico per i portafogli dedicati alle malattie muscolari e alla medicina rigenerativa. L'approccio supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio fornendo informazioni cellulari quantitative e riproducibili, rilevanti per la scoperta precoce e la ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche risolvendo la dinamica cellulare e molecolare durante la rigenerazione muscolare.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli mediante l'identificazione degli stati attivati delle cellule staminali e progenitrici attraverso marcatori multiplex.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico rivelando le transizioni tra stati cellulari e le firme di disfunzione nei modelli di malattia.
- Migliora l'affidabilità predittiva per la selezione del portafoglio quantificando popolazioni cellulari rare e il loro stato di attivazione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, isolando popolazioni definite di cellule staminali e progenitrici mediante FACS.
- Consente la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso misurazioni quantitative di proteine ad alta dimensione con risoluzione a singola cellula.
- Supporta la prontezza per analisi su larga scala permettendo l'analisi simultanea di fino a 50 marcatori per cellula.
- Fornisce output quantitativi affidabili per la valutazione di composti in sistemi rilevanti per le malattie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea ai modelli rilevanti per la malattia consentendo l'analisi in vivo della dinamica delle cellule staminali e progenitrici dopo un danno o un intervento farmacologico.
- Supporta la scoperta di biomarcatori traslazionali collegando le firme molecolari agli esiti rigenerativi.
- Facilita la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica permettendo studi funzionali su popolazioni cellulari isolate.
- Riduce i rischi nell'avanzamento preclinico fornendo informazioni meccanicistiche sul malfunzionamento delle cellule staminali nell'invecchiamento e nelle malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo integra le fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti e alla ricerca preclinica, sostenendo la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi metabolici e la riduzione dei rischi biologici negli studi sulla rigenerazione muscolare.
- Biologia della scoperta: Il profiling quantitativo di cellule staminali e progenitrici chiarisce le vie rigenerative e le decisioni del destino cellulare.
- Screening: L'analisi ad alta dimensionalità dei marcatori garantisce prontezza del saggio e riproducibilità per applicazioni successive.
- Analisi: Misurazioni multiplex di proteine e algoritmi di clustering permettono confronti robusti tra stati e condizioni cellulari.
- Ricerca traslazionale: L'applicazione in vivo in modelli di malattia supporta l'allineamento dei biomarcatori e la continuità traslazionale.
- Riutilizzo aziendale: La piattaforma è adattabile per diversi studi su modelli rigenerativi e di malattia, favorendo un ampio riutilizzo in ambito R&D.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle target.
- Valore operativo: Fornisce analisi standardizzate, riproducibili e scalabili a livello di singola cellula per popolazioni cellulari rare.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e una gestione efficiente del portafoglio finanziario quantificando la dinamica delle cellule rigenerative.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la promozione di programmi rigenerativi e modificanti la malattia, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in citometria a singola cellula, FACS e analisi di dati ad alta dimensione.
- Richiede accesso a strumentazione per citometria a massa e a infrastrutture computazionali avanzate.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i pannelli di anticorpi e le strategie di gating, al fine di garantire riproducibilità.
- L'adattamento a diversi modelli di danno muscolare o di malattia potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei pannelli di marcatori.
- La capacità di elaborazione e la sensibilità sono limitate dalla capacità dello strumento e dall'abbondanza delle cellule rare.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:59
Induction of Acute Injury by Notexin Injection in the Mouse Skeletal Muscle
3:36
Dissection of the Mouse Skeletal Muscle After Notexin Injury and Cell Dissociation Procedure for Single‐Cell Analysis
5:17
Live/Dead Staining of Skeletal Muscle Cells,Isolated from Notexin‐Injured Mice,with Cisplatin and Paraformaldehyde Fixation
7:38
Skeletal Muscle Cells Preparation for Loading into Mass Cytometer and CyTOF Data Analysis
