Induzione della plasticità a lungo termine dell'eccitabilità neuronale intrinseca nei neuroni del nucleo genicolato laterale dorsale
20 settembre 2024
Qui, descriviamo un protocollo per indurre la plasticità a lungo termine dell'eccitabilità intrinseca neuronale nei neuroni relè dal nucleo genicolato laterale dorsale mantenuto in fette di cervello ex vivo.
La nostra ricerca si concentra sul ruolo dei canali ionici nella plasticità funzionale dei disturbi cerebrali. In particolare, studiamo qui se i neuroni del talamo visivo possono subire plasticità di eccitabilità neuronale intrinseca. Abbiamo stabilito per la prima volta che i neuroni del nucleo genicolato laterale esprimono la plasticità dell'eccitabilità neurale intrinseca in seguito a deprivazione monoculare o in seguito a stimolazione di input regionali.
Forniamo un modo semplice per indurre una plasticità duratura dell'eccitabilità neuronale nei neuroni talamici visivi del ratto in vitro. A questo scopo, utilizziamo registrazioni elettrofisiche patch-clamp e strumenti farmacologici su tessuto cerebrale ex vivo. I nostri risultati sollevano la possibilità di esplorare la plasticità intrinseca di altri nuclei visivi sottocorticali del cervello.
Per iniziare, prepara gli strumenti di dissezione e due piattaforme di ghiaccio. Mettere il ghiaccio nel serbatoio esterno e riempire la camera di affettatura del vibratomo con una soluzione di taglio ghiacciata. Posiziona la testa del ratto soppresso sulla prima piattaforma ghiacciata e, usando piccole forbici, taglia il cuoio capelluto in direzione caudale, seguito dal cranio bilateralmente.
Con una pinza smussata e una spatola, apri il cranio, estrai rapidamente il cervello dal cranio e posizionalo sulla seconda piattaforma di ghiaccio. Praticare un'incisione sul piano frontale per rimuovere la corteccia anteriore e i bulbi olfattivi, seguita da un secondo taglio a livello del collicolo inferiore per rimuovere la corteccia posteriore e il cervelletto. Attacca il blocco cerebrale sulla piastra del vibratomo con il lato rostrale rivolto verso l'alto.
Innaffiare regolarmente il cervello durante la procedura fino a quando non è completamente immerso nella camera di affettatura. Usando il vibratomo, tagliare fette di 350 micrometri contenenti il nucleo genicolato laterale dorsale. Quindi, con una matita, rimuovere delicatamente la corteccia e l'ippocampo dal mesencefalo.
Per iniziare, prendi la fetta di cervello di ratto contenente il nucleo genicolato laterale dorsale, o dLGN, e montala in una camera sommersa su un microscopio verticale. Posizionare il filo di platino a forma di U sulla fetta. Utilizzando la microscopia video a infrarossi con contrasto di interferenza differenziale, identificare un neurone sano nel dLGN per la registrazione patch-clamp.
Utilizzando il micromanipolatore, posizionare la pipetta patch sul neurone selezionato con una pressione positiva costante. Impostare l'amplificatore in modalità VC e iniettare un passo di tensione di 10 millivolt. Impostare la tensione a meno 65 millivolt.
Quindi, imposta l'amplificatore in modalità CC, bilancia il ponte per compensare la resistenza di accesso e mantieni il neurone a meno 65 millivolt. Per l'acquisizione dei dati, impostare un periodo di controllo di circa 10 minuti con un impulso positivo di corrente alla frequenza di 0,1 hertz e monitorare l'eccitabilità neuronale. Quindi, osservare la resistenza di input del neurone con un breve impulso negativo di corrente.
Dopo il periodo di controllo, suscitare treni di 15 picchi evocati da 15 brevi passi da due a cinque millisecondi di corrente depolarizzante, erogati a 40 hertz per 10 minuti. Scegliere l'ampiezza dell'impulso di corrente per suscitare ogni volta un singolo potenziale d'azione. Infine, testare l'eccitabilità neuronale dopo il protocollo di induzione.
I neuroni dLGN sono stati registrati in configurazione cellulare intera e LTP-IE è stato indotto dall'attivazione del potenziale d'azione a 40 hertz per 10 minuti in presenza di glutammato ionotropico e antagonisti del recettore GABA. Un aumento di tre volte del numero di potenziali d'azione è stato osservato da 20 a 30 minuti dopo l'induzione di LTP-IE senza alcun cambiamento nella resistenza di ingresso.
Panoramica
Questo studio delinea un protocollo per indurre una plasticità a lungo termine dell'eccitabilità neuronale intrinseca nei neuroni di rilè del nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN) utilizzando fette cerebrali es vivo. La domanda principale indaga se i neuroni del dLGN possano mostrare cambiamenti nell'eccitabilità intrinseca in seguito a stimolazione o deprivazione. I risultati suggeriscono un significativo aumento dell'eccitabilità neuronale dopo l'induzione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Plasticità neuronale
Sfondo
- Comprendere la plasticità intrinseca è essenziale per ottenere informazioni sul funzionamento cerebrale e sui disturbi neurologici.
- Neuroni di relevo nel talamo visivo potrebbero svolgere un ruolo nell'elaborazione sensoriale e nella plasticità.
- Studi precedenti hanno dimostrato che l'eccitabilità neuronale può essere modificata da fattori ambientali.
- Il dLGN è fondamentale per il trasferimento delle informazioni visive, rendendolo un obiettivo pertinente per lo studio della plasticità.
Scopo dello studio
- Esplorare la plasticità dell'eccitabilità neuronale intrinseca nei neuroni talamici visivi.
- Stabilire un metodo affidabile per indurre e misurare questa plasticità.
- Permettere ulteriori studi su nuclei visivi sottocorticali correlati.
Metodi Utilizzati
- Utilizzati preparati di tessuto cerebrale espiantato da ratto, con specifico targeting del dLGN.
- Applicata l'elettrofisiologia con tecnica del patch-clamp per valutare le proprietà neuronali.
- L'induzione della plasticità a lungo termine ha impiegato potenziali d'azione ad alta frequenza.
- I passaggi critici hanno incluso la preparazione del tessuto e le registrazioni elettrofisiologiche in condizioni controllate.
Risultati principali
- È stato dimostrato un aumento triplo dei potenziali d'azione a seguito del protocollo di induzione.
- Non è stata osservata alcuna variazione nella resistenza di ingresso, indicando una specifica alterazione dell'eccitabilità.
- I risultati supportano l'ipotesi che i neuroni del dLGN siano capaci di plasticità intrinseca.
- Le modifiche elettrofisiologiche suggeriscono possibili percorsi per ulteriori indagini.
Conclusioni
- Questo studio convalida un metodo per indurre e misurare i cambiamenti nell'eccitabilità intrinseca dei neuroni del dLGN.
- I risultati forniscono importanti approfondimenti sui meccanismi neuronali della plasticità, con implicazioni per la comprensione dell'elaborazione visiva e potenziali bersagli terapeutici.
- Ricerche future potrebbero estendere questi metodi ad altre regioni sottocorticali per esplorare la plasticità.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La plasticità dell'eccitabilità neuronale intrinseca nel nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN) rappresenta un punto critico per comprendere l'elaborazione sensoriale e i circuiti neurali adattativi. L'induzione e la quantificazione affidabili della potenziamento a lungo termine dell'eccitabilità intrinseca (LTP-IE) nei neuroni di rilè del dLGN permettono la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi per la scoperta precoce di farmaci per il sistema nervoso centrale. Questa capacità sostiene la fiducia predittiva nei portafogli di neuroscienze traslazionali incentrati sulla modulazione delle vie visive e talamiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette l'analisi della funzione dei canali ionici neuronali e dei meccanismi di plasticità nei neuroni di rilè talamici.
- Supporta la riduzione del rischio biologico isolando le variazioni dell'eccitabilità intrinseca indipendenti dall'input sinaptico.
- Facilita la validazione funzionale di bersagli per vie del sistema nervoso centrale coinvolte nell'adattamento sensoriale e nella plasticità.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema es vivo validato per la quantificazione delle variazioni dell'eccitabilità neuronale mediante elettrofisiologia con tecnica del patch-clamp.
- Stabilisce protocolli di induzione riproducibili per la PTL-IE, favorendo la standardizzazione dei saggi e la comparabilità tra laboratori.
- Consente la misurazione quantitativa dell'output di potenziali d'azione come parametro di screening per modulatori della plasticità intrinseca.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia riguardanti l'elaborazione sensoriale e la disfunzione talamica.
- Permette una continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica di bersagli del sistema nervoso centrale che influenzano l'eccitabilità neuronale.
- Fornisce una piattaforma per la valutazione di biomarcatori traslazionali di plasticità intrinseca nei percorsi visivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo colloca gli studi sulla plasticità della eccitabilità intrinseca all'incrocio tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica del sistema nervoso centrale, collegando la validazione meccanicistica dei bersagli allo sviluppo di modelli traslazionali.
- Biologia della Scoperta: Permette la verifica di ipotesi sui meccanismi dei canali ionici e sulla plasticità neuronale nelle cellule di rilè talamici.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili dell'eccitabilità adatte alla valutazione di composti.
- Analisi: Offre la frequenza del potenziale d'azione e la resistenza di ingresso come parametri robusti e confrontabili per la valutazione delle condizioni.
- Ricerca Translazionale: Collega i risultati sulla plasticità intrinseca a modelli sensoriali e talamici rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma di saggio ex vivo riutilizzabile per l'analisi di bersagli e percorsi del sistema nervoso centrale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi del sistema nervoso centrale e nella riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Standardizza l'induzione e la misurazione della plasticità dell'eccitabilità neuronale per flussi di lavoro di R&S scalabili.
- Valore strategico: Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione di programmi sul sistema nervoso centrale mirati a vie talamiche e sensoriali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per il rischio di asset scoperta e preclinici nel campo del sistema nervoso centrale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in elettrofisiologia con tecnica del patch-clamp e preparazione di fettine cerebrali ex vivo.
- Necessita di accesso a microscopia avanzata e a infrastrutture per la registrazione elettrofisiologica.
- Richiede una rigorosa standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di induzione e l'analisi dei dati.
- L'adattamento ad altre regioni cerebrali o specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- L'interpretazione è limitata alle condizioni ex vivo e potrebbe non cogliere appieno la complessità in vivo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:09
Obtaining Acute Slices of Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus for Intrinsic Plasticity Studies
2:34
Whole-Cell Patch-Clamp Electrophysiology for Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability Induction in Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus
4:25
Representative Results
