Name: Analisi qualitativa e quantitativa della produzione di siderofori da Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Scopri un protocollo semplificato per quantificare siderofori, pioverdina e piochelino in Pseudomonas aeruginosa mediante analisi spettrofotometrica. Questo metodo facilita lo studio dei fattori di virulenza batterica.

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Gli autori riconoscono il finanziamento da parte di DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program e FIST. MR ringrazia la borsa di studio ricevuta da SHODH. HP ringrazia la borsa di studio ricevuta dal CSIR.

Tutti gli isolati batterici di P. aeruginosa sono stati ottenuti da laboratori di microbiologia medica di Vadodara e Jaipur, in India. Tutti gli isolati clinici selezionati sono stati manipolati in un gabinetto di biosicurezza (BSL2) e durante gli esperimenti è stata prestata la massima attenzione durante la manipolazione degli isolati batterici. I dettagli commerciali di tutti i reagenti/soluzioni sono forniti nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione del colorante Chrome Azurol Sulfonate (CAS) e dei terreni di agar
<ol><li>Preparare il colorante CAS (100 mL) con la seguente composizione:<ol><li>Sciogliere 60 mg di CAS in 50 mL di acqua distillata (Soluzione 1).</li>
		<li>Sciogliere 2,7 mg di FeCl3·6H2O in 10 mL di HCl 10 mM (soluzione 2).</li>
		<li>Sciogliere 73 mg di bromuro di cetrimonio (HDTMA) in 40 ml di acqua distillata (soluzione 3).</li>
		<li>Mescola con cura la soluzione 1, la soluzione 2 e la soluzione 3. Conservalo in una bottiglia di vetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare l'agar CAS seguendo i passaggi seguenti:<ol><li>Aggiungere 100 mL di soluzione salina MM9 a 750 mL di acqua distillata.</li>
		<li>Sciogliere 32,24 g di acido libero piperazina-N,N'-bis(acido 2-etanesolfonico) (PIPES).</li>
		<li>Aggiungere 15 g di agar agar. Sterilizzare in autoclave e lasciar raffreddare.</li>
		<li>Aggiungere alla miscela 30 mL di soluzione sterile di Casaminoacido e 10 mL di soluzione sterile di glucosio al 20%.</li>
		<li>Aggiungere 100 mL di colorante CAS, mescolare e versare in condizioni asettiche. NOTA: La preparazione del terreno MM9, della soluzione di casaminoacido e dell'8-idrossichinolina è fornita nel file supplementare 1. Il tampone PIPES è sensibile al pH. Non si dissolverà fino a quando non verrà raggiunto il pH 5,6. Assicurarsi che il pH sia costantemente monitorato perché quando PIPES inizia a dissolversi in acqua, abbasserà ulteriormente il pH. Estrarre Casaminoacido con lo stesso volume di 8-idrossichinolina al 3% disciolto in cloroformio. Lasciare la soluzione immiscibile a 4 °C per circa 20 minuti e raccogliere con cura la fase superiore della soluzione senza disturbare la fase inferiore.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analisi qualitativa della produzione di siderofori
<ol><li>Impostare l'OD600 nm su 0,2 per colture coltivate di 24 ore di P. aeruginosa.</li>
	<li>Utilizzando un anello di filo sterile, strisciare la coltura batterica su una piastra di agar CAS.</li>
	<li>Incubare a 30 °C per 24 ore. NOTA: Per diluire la coltura batterica è possibile utilizzare un terreno con acqua peptonica o soluzione salina normale allo 0,8%. Se non si osserva alcuna crescita batterica a 24 ore, incubare le piastre CAS per 48-72 ore.</li>
</ol>3. Stima quantitativa dei siderofori totali
<ol><li>Re-inoculare colture di P. aeruginosa cresciute per 24 ore in terreno acquoso peptonico dopo aver regolato OD600 nm a 0,25 e incubare a 30 °C per 48 ore.</li>
	<li>Dopo 48 ore, centrifugare la coltura batterica a 4650 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aggiungere 100 μL di surnatante privo di cellule a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti e aggiungervi 100 μL di colorante CAS.</li>
	<li>Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, effettuare letture spettrofotometriche a 630 nm.</li>
	<li>Calcolare i risultati ottenuti per la quantificazione dei siderofori totali come unità siderofora percentuale (PSU). NOTA: L'alimentatore può essere calcolato come: [(Ar - As)/Ar] x 100 dove, Ar = assorbanza del riferimento a 630 nm, As = assorbanza del surnatante libero da cellule del campione. Per riferimento, il colorante CAS deve essere aggiunto a terreni acquosi peptonici non inoculati. Riempire tutta la vetreria, come provette, palloni, ecc., con 6 M HCl per 2 ore e sciacquarla due volte con acqua distillata per rimuovere ogni traccia di ferro su di essa.</li>
</ol>4. Stima quantitativa della pioverdina
<ol><li>Re-inoculare colture di P. aeruginosa coltivate per 24 ore in terreno acquoso Peptone dopo aver regolato OD600 nm a 0,25 e incubare a 30 °C per 48 ore.</li>
	<li>Dopo 48 ore, misurare l'OD600 nm della crescita batterica prima di procedere ulteriormente.</li>
	<li>Centrifugare la coltura batterica a 4650 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aggiungere 100 μL di surnatante privo di cellule a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti e aggiungervi 100 μL di Tris-HCl da 50 mM (pH 8,0).</li>
	<li>Effettuare letture spettrofotometriche a OD405 nm.</li>
</ol>5. Estrazione della piochelina e spettrofotometria
<ol><li>Re-inoculare colture di P. aeruginosa coltivate per 24 ore nel terreno King's B (File supplementare 1) dopo aver regolato OD600 nm a 0,25 e incubare a 30 °C per 24 ore.</li>
	<li>Dopo 24 ore, prelevare 100 ml di coltura e centrifugare a 4650 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aggiungere 5 mL di acido citrico 1 M al surnatante. Estrarre due volte con 50 ml di acetato di etile.</li>
	<li>Filtrare la fase organica con solfato di magnesio attraverso un filtro a siringa. Conservare la fase organica filtrata a -20 °C.</li>
	<li>Effettuare letture spettrofotometriche a 320 nm. NOTA: Poiché la piochelina è un composto altamente instabile a temperatura ambiente, eseguire il processo di estrazione su ghiaccio. Utilizzare una siringa sterile da 50 ml per la separazione del filtro. Posizionare del cotone sulla punta della siringa e aggiungere 1 g di solfato di magnesio. Fissare un filtro per siringa sterile sulla punta della siringa e raccogliere il filtrato in una provetta sterile.</li>
</ol>

Valutazione della produzione di siderofori da isolati di Pseudomonas aeruginosa

<ol><li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li>
<li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li>
<li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores%3A+Pyoverdine%2C+pyochelin+and+pseudopaline%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711(2022).</li>
<li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li>
<li>Dingemans, P., Cornelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li>
<li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudomonas+quinolone+signal+%28pqs%29%3A+Not+just+for+quorum+sensing+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li>
<li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermicrobial+interaction%3A+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li>
<li>Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+From+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li>
<li>Geum-Jae-Jeong,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li>
<li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).</li>
<li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isochorismate+synthase+%28pcha%29%2C+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li>
<li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+microplate+method+%28biolog+mt2%29+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance%2Fsensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li>
<li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+pyoverdines%2C+pseudomonas+primary+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li>
<li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li>
<li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa%3A+Physicochemical+characterization+of+the+iron%28iii%29%2C+copper+%28ii%29+and+zinc+%28ii%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li>
<li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li>
<li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li>
<li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+sensitive+LC%2FMS%2FMS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).</li>
<li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li>
<li>Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+and+syntheses+of+siderophores%2C+microbial+iron+chelators%2C+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo consente ai ricercatori di quantificare i siderofori totali e due diversi siderofori di P. aeruginosa, vale a dire la pioverdina e la piochelina, dal surnatante batterico privo di cellule. Nel saggio su piastre di agar CAS, il colorante CAS e gli ioni Fe3+ formano un complesso. Quando i batteri producono siderofori, estinguono gli ioni Fe3+ dal complesso CAS-Fe3+, portando a un cambiamento di colore intorno alla crescita batterica. Questo cambiamento si traduce in un chiaro alone arancione intorno alla crescita batterica14,15. Mentre i batteri possono essere striati direttamente sulle piastre di agar CAS, i risultati complessivi possono essere influenzati. La striatura di un numero elevato di cellule batteriche potrebbe creare un ampio alone arancione intorno alla crescita batterica, mentre l'utilizzo di un minor numero di cellule batteriche potrebbe comportare una zona chiara e ristretta. Per risolvere questo problema, abbiamo striato un numero uniforme di cellule batteriche regolando l'OD600. I batteri esigenti possono mostrare risultati in 24 ore, mentre i batteri a crescita lenta potrebbero impiegare più di 72 ore per dimostrare la produzione di siderofori.
Per la determinazione quantitativa dei siderofori totali, è stata inizialmente impiegata la spettroscopia classica, che richiede un volume significativo di surnatante per la rilevazione dei siderofori, rendendola poco pratica. La quantificazione dei siderofori totali viene ora condotta utilizzando una piastra a 96 pozzetti con un saggio CAS modificato. Questo approccio ha portato a una riduzione dell'uso di reagenti, surnatante batterico, tempo e maggiore accuratezza rispetto ai metodi spettroscopici tradizionali16. Altri studi hanno anche riportato l'uso di piastre per microtitolazione come metodo più efficiente e che consente di risparmiare tempo17. La quantificazione dei siderofori totali mediante una piastra per microtitolazione si è dimostrata un approccio efficiente. In questo studio, sono state selezionate per l'esame colture batteriche di 48 ore coltivate in terreni privi di ferro. È stato inoltre condotto uno studio comparativo per valutare la produzione di siderofori in diversi mezzi di crescita, come il brodo di Luria, il brodo di Luria (estratto con il 3% di 8-idrossichinolina), il terreno King's B (estratto con il 3% di 8-idrossichinolina) e il mezzo di acqua peptonica (estratto con il 3% di 8-idrossichinolina). È stato osservato che il mezzo di acqua peptone ha mostrato la più alta quantità di produzione di siderofori e, quindi, è stato selezionato per ulteriori esperimenti. Un grafico che illustra la produzione di siderofori in diversi mezzi di crescita è incluso nella Figura 1 supplementare.
La pioverdina può essere rilevata e quantificata utilizzando letture spettrofluorimetriche, ma solo la pioverdina è nota per mostrare fluorescenza. La pioverdina in complesso con ioni Fe3+ non presenta fluorescenza18,19. Per il rilevamento e la quantificazione delle pioverdine, sono state selezionate colture batteriche vecchie di 48 ore. P. aeruginosa è noto per produrre piochelina in condizioni iniziali di carenza di ferro e passa alla produzione di pioverdina dopo l'esposizione a gravi condizioni di stress da ferro. È stato dimostrato che la pioverdina può chelare altri cationi metallici, come l'alluminio, il gallio, il manganese e il cromo, ma solo il ferro viene trasportato con successo alla membrana cellulare19.
Analogamente ai siderofori totali e alla pioverdina, la piochelina non può essere quantificata direttamente dal surnatante privo di cellule e deve essere estratta utilizzando il diclorometano20. Il diclorometano è immiscibile con il surnatante privo di cellule e forma uno strato separato nella parte inferiore. In questo studio, sono stati testati vari mezzi nutritivi, tra cui il brodo di Luria, l'acqua peptonica e i terreni di casaminoacido, ma una quantità significativa di piochelina è stata ottenuta dal terreno B di King. Mentre Hoegy et al. avevano utilizzato terreni CAA nel loro protocollo, noi li abbiamo modificati con terreni King's B, poiché i terreni CAA non supportavano la crescita batterica21. Il metodo è stato ulteriormente modificato estraendo il mezzo nutritivo con 8-idrossichinolina per rimuovere eventuali residui di ferro dal terreno, creando un terreno carente di ferro. Inoltre, è stato riscontrato che il tempo di incubazione influisce in modo significativo sulla produzione di piochelina. Dumas et al. hanno dimostrato che P. aeruginosa passa dalla produzione di piochelina a quella di pioverdina in condizioni di grave limitazione del ferro12. In questo studio, l'estrazione e il rilevamento della piochelina sono stati eseguiti da colture batteriche di 24 ore, poiché la piochelina non è stata rilevata in colture di 48 ore. Il volume del surnatante influisce anche sul rilevamento della piochelina e, pertanto, per l'estrazione sono stati utilizzati 100 mL di surnatante privo di cellule. Inoltre, la produzione di piochelina era significativamente più alta negli isolati MR1, TL7 e J3, probabilmente a causa di ceppi batterici che non sono in grado di produrre pioverdina nonostante abbiano potenti chelanti del ferro22.
Ji et al. hanno introdotto un approccio nuovo e sensibile per la quantificazione della piochelina, convalidandolo utilizzando LC/MS/MS. Tuttavia, questo metodo si applicava solo agli isolati di P. aeruginosa dall'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica. LC/MS/MS, essendo una configurazione costosa, potrebbe non essere conveniente per la maggior parte dei laboratori23. Visaggio et al. hanno sviluppato un biosensore bioluminescente basato su cellule intere, che consente una quantificazione rapida, sensibile e in un unico passaggio della piochelina. Tuttavia, questo metodo non è in grado di fornire una quantificazione per i siderofori totali e la pioverdina24.
I sistemi di assorbimento del ferro sideroforo potrebbero avere un'applicazione antimicrobica nella somministrazione di farmaci per batteri multiresistenti, poiché svolgono un ruolo cruciale nella sopravvivenza e nella virulenza batterica. Questo approccio può offrire un nuovo modo per combattere i batteri multiresistenti25. I farmaci che non possono penetrare la membrana cellulare batterica possono essere collegati a un sideroforo e il complesso Fe-sideroforo risultante può essere trasportato all'interno della membrana batterica26.

Gli organismi hanno bisogno di ferro per svolgere varie funzioni vitali, come il trasporto di elettroni e la replicazione del DNA1. Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunista Gram-negativo, è noto per possedere una varietà di fattori di virulenza per stabilire l'infezione nell'ospite, tra cui un meccanismo è la formazione di siderofori2. Durante le condizioni di esaurimento del ferro, P. aeruginosa rilascia molecole specializzate chiamate siderofori, che estinguono il ferro dall'ambiente circostante. I siderofori chelano il ferro extracellulare e il complesso ferrico-sideroforo risultante viene attivamente trasportato nella cellula3.
P. aeruginosa è nota per produrre due siderofori, la pioverdina e la piochelina. La pioverdina è nota per avere una maggiore affinità chelante del ferro (1:1), mentre la piochelina è nota per avere una minore affinità chelante del ferro (2:1)4. La piochelina è anche chiamata sideroforo secondario perché ha una minore affinità chelante del ferro5. La produzione e la regolazione dei siderofori sono attivamente controllate da sistemi di Quorum Sensing (QS) in P. aeruginosa6.
Oltre alla tempra del ferro, i siderofori sono anche coinvolti nella regolazione dei fattori di virulenza e svolgono un ruolo attivo nella formazione del biofilm7. I siderofori svolgono ulteriori ruoli cruciali, tra cui il coinvolgimento nella segnalazione cellulare, la difesa contro lo stress ossidativo e la facilitazione delle interazioni tra le comunità microbiche8. I siderofori sono tipicamente classificati in base ai gruppi funzionali specifici attraverso i quali chelano il ferro. I tre ligandi bidentati primari in questa classificazione sono il catecolato, l'idrossiammato e il α-idrossicarbossilato3. Le pioverdine sono segni distintivi delle specie fluorescenti di Pseudomonas come P. aeruginosa e P. fluorescens5. Sono costituiti da un cromoforo fluorescente verde misto accoppiato ad un oligopeptide contenente 6-12 amminoacidi. Diverse peptidi sintetasi non ribosomiali (NRP) sono coinvolte nella loro sintesi9. Quattro geni coinvolti nella produzione e nella regolazione della pioverdina sono pvdL, pvdI, pvdJ e pvdD10. La pioverdina è anche responsabile dell'infezione e della virulenza nei mammiferi11. È noto che P. aeruginosa produce piochelina in condizioni moderatamente limitanti il ferro, mentre la pioverdina viene prodotta in ambienti severi che limitano il ferro12. Due operoni coinvolti nella produzione di piochelina sono pchDCBA e pchEFGHI13. Si noti che in presenza di piocianina, la piochelina (catecolato) induce danno ossidativo e infiammazione e genera radicali ossidrilici, dannosi per i tessuti dell'ospite11.
Il test del cromo azurolo solfonato (CAS) è ampiamente adottato grazie alla sua completezza, all'elevata sensibilità e alla maggiore praticità rispetto ai saggi microbiologici che, sebbene sensibili, possono essere eccessivamente specifici14. Il test CAS può essere condotto su superfici di agar o in soluzione. Si basa sul cambiamento di colore che si verifica quando lo ione ferrico passa dal suo complesso blu intenso all'arancione. Il test colorimetrico CAS quantifica l'esaurimento del ferro da un complesso ternario Fe-CAS-tensioattivo. Questo particolare complesso, costituito da metallo, colorante organico e tensioattivo, ha un colore blu e presenta un picco di assorbimento a 630 nm.
Questo rapporto presenta un metodo per la rilevazione qualitativa della produzione di siderofori, in cui è possibile rilevare la produzione di siderofori su una piastra di agar. Viene inoltre fornito un metodo per la stima quantitativa della produzione totale di siderofori in una piastra per microtitolazione e la rilevazione e l'analisi quantitativa di due siderofori, pioverdina e piochelina, da P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Agar Agar, Tipo I</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-Idrossichinolina</td><td>Loba Chemie</td><td>4151</td><td></td></tr><tr><td>Casamino Acid</td><td>SRL Sostanze chimiche</td><td>68806</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB)</td> <td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Merck</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>Cromo azurol sulfonato</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Merck</td><td>100241</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio monoidrato</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Merck</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro ferrico esaidrato</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche di vetro</td><td>Borosil</td><td>5100021</td><td></td></tr><tr><td>Provette di vetro</td><td>Borosil</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>King's medium B base</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sali medi minimi</td><td>HIMEDIA</td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO Spettrofotometro UV</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>Peptone Tipo I, Batteriologico</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>TUBI acido libero</td><td>MP Biomedicals</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>Potassio diidrogeno fosfato</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>Proteoso</td><td>peptone HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis Shimadzu</td><td>2072310058</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi qualitativa e quantitativa della produzione di siderofori da pseudomonas aeruginosa

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è noto per la sua produzione di una vasta gamma di fattori di virulenza per stabilire infezioni nell'ospite. Uno di questi meccanismi è l'eliminazione del ferro attraverso la produzione di siderofori. P. aeruginosa produce due diversi siderofori: la piochelina, che ha una minore affinità ferrochelante, e la pioverdina, che ha una maggiore affinità ferro-chelante. Questo rapporto dimostra che la pioverdina può essere quantificata direttamente dai surnatanti batterici, mentre la piochelina deve essere estratta dai surnatanti prima della quantificazione.
Il metodo principale per analizzare qualitativamente la produzione di siderofori è il test su piastra di agar con cromo azurolo solfonato (CAS). In questo saggio, il rilascio di colorante CAS dal complesso Fe3+-Dye porta a un cambiamento di colore dal blu all'arancione, indicando la produzione di siderofori. Per la quantificazione dei siderofori totali, i surnatanti batterici sono stati miscelati in proporzioni uguali con il colorante CAS in una piastra per microtitolazione, seguita da un'analisi spettrofotometrica a 630 nm. La pioverdina è stata quantificata direttamente dal surnatante batterico miscelandolo in proporzioni uguali con 50 mM Tris-HCl, seguita da analisi spettrofotometrica. Un picco a 380 nm ha confermato la presenza di pioverdina. Per quanto riguarda la piochelina, non è stato possibile quantificarla direttamente dal surnatante batterico, quindi è stato necessario estrarla prima. Successive analisi spettrofotometriche hanno rivelato la presenza di piochelina, con un picco a 313 nm.

Prima della quantificazione dei siderofori da isolati clinici, è stato effettuato uno screening qualitativo per la produzione di siderofori per garantire la produzione di siderofori. La rilevazione qualitativa dei siderofori da isolati clinici è stata osservata striando i batteri su piastre di agar CAS. Per lo studio sono stati selezionati tre isolati clinici, ovvero MR1, TL7, J3, insieme a PAO1 (il ceppo di riferimento). Tutti e tre gli isolati clinici e PAO1 hanno mostrato risultati positivi per la produzione di siderofori, dove un chiaro alone arancione intorno alla crescita batterica sulla superficie dell'agar blu ha indicato una produzione positiva di siderofori (Figura 1). La formazione dell'alone sull'agar CAS (Figura 1) ha fornito una stima approssimativa della produzione di siderofori da parte degli isolati clinici. Pertanto, è stata eseguita una stima quantitativa della produzione di siderofori utilizzando il reagente CAS e i mezzi liquidi.
La quantificazione totale dei siderofori è stata eseguita direttamente dal surnatante privo di cellule. Dopo l'incubazione, è stato osservato un cambiamento di colore in cui il colore giallo indicava la rimozione del colorante CAS dal complesso Fe. In questo caso, come controllo è stato utilizzato un colorante CAS con mezzi di crescita non inoculati, che è stato preso per il calcolo dei siderofori. Non c'è stata alcuna differenza significativa nella produzione totale di siderofori negli isolati MR1 e TL7, mentre c'è stata una significativa produzione totale di siderofori in J3 rispetto a PAO1 (Figura 2).
Successivamente, la quantificazione della pioverdina è stata eseguita direttamente da surnatanti privi di cellule. Le pioverdine vengono rilasciate in ambienti cellulari, quindi il surnatante privo di cellule è stato utilizzato per la quantificazione delle pyoverdine. È stata eseguita anche una scansione del campo UV con lo spettrofotometro, dove il picco a 380 nm ha confermato la presenza di pioverdina (Figura 3A). Le letture spettrofotometriche sono state effettuate a 405 nm e i risultati sono stati interpretati come OD405/OD600 nm. Tutti gli isolati hanno mostrato una produzione di pioverdina, mentre gli isolati MR1 e J3 hanno mostrato una pioverdina significativamente inferiore rispetto a PAO1, mentre non è stata osservata alcuna differenza significativa per TL7 (Figura 3B).
La piochelina non può essere quantificata direttamente dal surnatante privo di cellule. Non è stato possibile estrarre la piochelina da 1 mL di surnatante privo di cellule, quindi è stato estratto da 100 mL di surnatante privo di cellule. È stato acidificato con acido citrico 1 M. Poiché la piochelina è un composto altamente instabile, il processo di estrazione è stato eseguito su ghiaccio. Il rilevamento della piochelina è stato eseguito eseguendo una scansione dell'intervallo UV da 300 a 600 nm, dove il picco a OD320 nm ha confermato la presenza di piochelina (Figura 4A). La quantificazione della piochelina è stata eseguita effettuando letture spettrofotometriche a OD320 nm. I calcoli sono stati effettuati dividendo OD320/OD600. Gli isolati MR1, TL7 e J3 hanno mostrato una produzione significativamente più elevata di piochelina rispetto all'isolato di riferimento PAO1 (Figura 4B).
È stata eseguita una produzione comparativa di siderofori in vari terreni di crescita batterica per verificare la quantità di siderofori totali prodotti in vari mezzi di crescita. Sono stati selezionati quattro diversi terreni, in cui il brodo di Luria, il terreno King's B e l'acqua peptonica sono stati estratti con il 3% di 8-idrossichinolina e il brodo di Luria non estratto è stato selezionato per lo studio. Non c'è stata alcuna differenza significativa tra la produzione di siderofori nel brodo di Luria estratto, il terreno di King's B e il mezzo di acqua peptonica, mentre una differenza significativa è stata osservata per la produzione di siderofori nel brodo di Luria non estratto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> Figura 1: Produzione di siderofori su agar CAS. La crescita di P. aeruginosa su piastre di agar CAS di colture coltivate per 24 ore è stata individuata su piastre di agar CAS e incubata a 30 °C per 24 ore. La presenza di siderofori è indicata da un alone arancione attorno alla colonia batterica (PAO1, MR1, TL7 e J3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> Figura 2: Produzione totale di siderofori. La produzione totale di siderofori è stata valutata per PAO1 e tre isolati clinici (MR1, TL7 e J3). 100 μL di surnatante privo di cellule (di PAO1, MR1, TL7 e J3 coltivati per 24 ore in brodo di acqua peptonica) sono stati aggiunti a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti, successivamente sono stati aggiunti 100 μL di colorante CAS. È stato eseguito il test ANOVA unidirezionale per la significatività statistica. Le barre di errore rappresentano ± deviazione standard (SD) tra tre repliche biologiche. *corrisponde a p &lt; 0,05; ns corrisponde a p &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> Figura 3: Produzione di pioverdina. La produzione di pioverdina del ceppo PAO1 di P. aeruginosa e degli isolati clinici (MR1, TL7 e J3) è stata valutata dopo 24 ore di crescita in mezzi acquosi peptonici. Le colture batteriche sono state centrifugate e 100 μL di surnatante privo di cellule sono stati aggiunti a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Successivamente, sono stati aggiunti 100 μL di Tris-HCl 50 mM (pH 8,0). Il rilevamento della pioverdina è stato effettuato mediante spettrofotometria UV con un intervallo da 350 nm a 600 nm. Analisi spettrometrica a 380 nm di produzione di pioverdina (A). Quantificazione della produzione di pioverdina (B). Le barre di errore indicano l'errore standard rispetto alla media degli esperimenti triplicati. Le barre di errore rappresentano ± SD tra tre repliche biologiche. corrisponde a p &lt; 0,0001, **corrisponde a p &lt; 0,01 e ns corrisponde a p &gt; 0,05 in base al test ANOVA unidirezionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> Figura 4: Produzione di piochelina. Produzione di piochelina di PAO1 (usato come riferimento) e isolati clinici (MR1, TL7 e J3) utilizzando l'estrazione con acetato di etile e solfato di magnesio. Analisi spettrofotometrica con un range da 230 nm a 400 nm (A). Quantificazione della piochelina (B). Per ogni isolato sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano ± SD tra tre repliche biologiche. corrisponde a p &lt; 0,001 in base al test ANOVA unidirezionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Produzione comparativa di siderofori in vari mezzi di crescita batterica. Produzione totale di siderofori in quattro diversi mezzi di crescita in cui sono stati estratti i terreni di King's B, i terreni acquosi di peptone e il brodo di Luria con il 3% di 8-idrossichinolina per rimuovere qualsiasi traccia di ferro da esso, e sono stati selezionati il brodo di Luria (non estratto). L'estrazione mediante 8-idrossichinolina al 3% è stata eseguita aggiungendo al terreno un volume uguale di 8-idrossichinolina al 3%. Le barre di errore rappresentano ± SD tra tre repliche biologiche. **corrisponde a p &lt; 0,001 e ns corrisponde a p &gt; 0,5 in base al test ANOVA unidirezionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Ricette dei terreni utilizzati per il presente studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare il file.</a>

Questo protocollo fornisce analisi sia qualitative che quantitative dei siderofori totali, della pioverdina e della piochelina di Pseudomonas aeruginosa.

Analisi qualitativa e quantitativa della produzione di siderofori da Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

I siderofori formano complessi con il ferro e lo trasportano nella cellula durante le condizioni limitanti del ferro. I siderofori sono potenti fattori di virulenza che aiutano a stabilire una grave infezione nell'ospite e sono noti per svolgere un ruolo nella regolazione del quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. La nostra ricerca mira a stimare quantitativamente la produzione di siderofori in Pseudomonas.I siderofori sono molecole extracellulari, quindi i siderofori totali, insieme alla pioverdina e alla piochelina, vengono quantificati utilizzando il surnatante privo di cellule. Poiché la piochelina non viene rilevata in piccoli volumi, l'estrazione viene eseguita da un grande volume di surnatante privo di cellule. Recentemente, LCMS e biosensori sono stati sviluppati per la quantificazione della piochelina.L'LCMS è una configurazione costosa per i piccoli laboratori, mentre i biosensori sono in grado di quantificare solo la piochelina. Questo protocollo semplice e illustrato utilizza una quantità minima di reagenti e strumentazione di laboratorio e consente la stima del sideroforo da surnatante privo di cellule utilizzando meno tempo.

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