Name: Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Impara a costruire una camera di flusso per microscopia time-lapse usando parafilm e un blocco termico. Questo metodo facilita l'imaging avanzato in neuroscienza e biologia cellulare.

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<ol><li> Costruire una camera di flusso, come mostrato nel video. Assicurarsi che la guarnizione parafilm è stretto e l&#39;utilizzo coprioggetto lavato. </li><li> Incubare actina-legante nella camera per &#39;5-10. </li><li> Blocco siti di legame non specifici sul vetrino di vetro con una proteina di blocco. </li><li> Actina polimerizzano all&#39;interno della camera di flusso in G-actina in polimerizzazione buffer. </li><li> Washout actina non polimerizzato da che scorre in tampone in eccesso. </li></ol>

monitoraggio actina smontaggio con time-lapse microscopia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ok, quindi quello che vorrei fare oggi è mostrarvi come costruire una camera a flusso, una camera di fusione per l'acquisizione di immagini su un microscopio eretto. Quello che faccio poi è creare due spazi utilizzando un film. Quindi prendo il film di parafilm e lo taglio in piccole strisce.Successivamente, formerò fondamentalmente i canali per le pareti e li asciugo con un flusso d'aria inclinato. Pongo il vetrino coprioggetto sopra il para e, a questo punto, il preparato è completo. Quindi lo riscaldo su un blocco termoregolato per fondere il para e creare fondamentalmente un sigillo.Ciò che abbiamo qui è il vetrino coprioggetto, e sopra di esso si trovano due strati di phim, come si vede proprio qui. E sopra a questo, nuovamente, c'è un vetrino da 22 per 22 millimetri. Questo qui, che ho premuto contro il param per formare il sigillo.Ok, quindi il liquido entra da una parte qui e posso aspirarlo con una carta da filtro da questa parte qui. E tra poco vi mostrerò come fare. Quello che mi piace fare è metterlo in una camera umidificata, che è molto semplice.Prendere due tipi di strisce rialzate e posizionare un filtro di carta al di sotto. Per mantenere il sistema sigillato, mett

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Immagini microscopiche dal vivo di cellule endoteliali che esprimono GFP-actina permette la caratterizzazione dei cambiamenti dinamici nelle strutture del citoscheletro. A differenza delle tecniche che utilizzano campioni fissati, questo metodo fornisce una valutazione dettagliata delle variazioni temporali del citoscheletro di actina nelle cellule stesse prima, durante e dopo vari stimoli fisici, farmacologici o infiammatoria.

Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina

I microtubuli sono intrinsecamente polimeri instabili, e il loro passaggio tra la crescita e l'accorciamento è stocastico e difficile da controllare. Qui si descrivono i protocolli utilizzando microtubuli segmentato con tappi di stabilizzazione photoablatable. Depolimerizzazione dei microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo l'analisi delle proposte di risoluzione con lo smontaggio estremità del microtubulo.

Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Descriviamo come tecniche di micro - e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all'interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

Presentato qui è un protocollo completo per eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi miosina-5, che potrebbe essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi. Il protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell'apparato sperimentale alla preparazione del campione, all'acquisizione dei dati e all'analisi.

Dissezione delle proprietà meccanoenzimatiche delle miosine processive con spettroscopia ultraveloce a force-clamp

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Questo protocollo descrive la formazione di doppi strati lipidici supportati e l'aggiunta di filamenti citoscheletrici e proteine motorie per studiare la dinamica delle reti citoscheletriche ricostituite e legate alla membrana utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Questo articolo presenta protocolli per l'ingegnerizzazione e la caratterizzazione di reti composite tridimensionali sintonizzabili di filamenti di actina co-entangled e microtubuli. I compositi subiscono una ristrutturazione attiva e un movimento balistico, guidati dai motori della miosina II e della chinesina, e sono sintonizzati dalle concentrazioni relative di actina, microtubuli, proteine motorie e reticolanti passivi.

Ricostituzione e caratterizzazione di compositi actina-microtubuli con dinamica e meccanica azionata da motori sintonizzabili

In questo lavoro, un approccio di ricostituzione in vitro è impiegato per studiare la poroelasticità dei gel di actomiosina in condizioni controllate. Viene quantificata la dinamica del gel di actomiosina e del solvente incorporato, attraverso la quale viene dimostrata la poroelasticità della rete. Discutiamo anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.

La meccanica delle reti di actiosina contrattile (poro-)elastica come sistema modello del citoscheletro cellulare

Qui, presentiamo metodi per la preparazione di assemblaggi di actina quasi bidimensionali (2D) entangled, reticolati e a cristalli liquidi da proteine purificate.

Regolazione delle modalità di contrattilità e deformazione di assemblaggi attivi basati su actina in vitro: dalle reti attive bidimensionali alle gocce di cristalli liquidi

Impara a costruire una camera di flusso per microscopia time-lapse usando parafilm e un blocco termico. Questo metodo facilita l'imaging avanzato in neuroscienza e biologia cellulare.

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

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