Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia
8 novembre 2006
Ok, quindi quello che vorrei fare oggi è mostrarvi come costruire una camera a flusso, una camera di fusione per l'acquisizione di immagini su un microscopio eretto. Quello che faccio poi è creare due spazi utilizzando un film. Quindi prendo il film di parafilm e lo taglio in piccole strisce.
Successivamente, formerò fondamentalmente i canali per le pareti e li asciugo con un flusso d'aria inclinato. Pongo il vetrino coprioggetto sopra il para e, a questo punto, il preparato è completo. Quindi lo riscaldo su un blocco termoregolato per fondere il para e creare fondamentalmente un sigillo.
Ciò che abbiamo qui è il vetrino coprioggetto, e sopra di esso si trovano due strati di phim, come si vede proprio qui. E sopra a questo, nuovamente, c'è un vetrino da 22 per 22 millimetri. Questo qui, che ho premuto contro il param per formare il sigillo.
Ok, quindi il liquido entra da una parte qui e posso aspirarlo con una carta da filtro da questa parte qui. E tra poco vi mostrerò come fare. Quello che mi piace fare è metterlo in una camera umidificata, che è molto semplice.
Prendere due tipi di strisce rialzate e posizionare un filtro di carta al di sotto. Per mantenere il sistema sigillato, metto il coperchio, ovvero il coverslip, sulla camera di flusso. Ora, per introdurre una soluzione nella camera, è sufficiente posizionare la punta della pipetta all'ingresso della camera e lasciar defluire il liquido.
Ora procedo incubando la camera con il coperchio chiuso per 10 minuti. Per aspirare il liquido dall'altro lato, di solito prendo una carta filtrante e la taglio in strisce sottili come questa. Prendo quindi una di queste strisce sottili e applico contemporaneamente la soluzione all'ingresso, posizionando la carta filtrante all'uscita per aspirare il liquido di scambio.
Quindi vedrete il liquido scorrere attraverso la soluzione. Dopodiché attendo cinque minuti per la chiusura intermedia. Ora sono pronto per inserire effettivamente l'actina, che devo polimerizzare; la polimerizzo all'interno della camera di flusso, seguendo esattamente le stesse procedure di prima.
Quindi, poiché è così, e ora che l'azione è polimerizzata, rimuovo tutto l'eccesso di azione non polimerizzata utilizzando un grande volume di solo tampone. Qui ho circa cento microlitri, pari a qualche volume della camera di reazione di tampone. Semplicemente, sapete, quando la carta da filtro è satura, devo cambiare direzione. Va bene?
E quindi sono pronto per eseguire l'acquisizione di immagini con questo sistema. Quindi, camera di perfusione con actina fissata ad essa. Ora prendo il vetrino, lo monto sotto il microscopio e, poiché sto acquisendo le immagini con un obiettivo ad immersione in olio, metterò un po' di olio di immersione sulla superficie superiore del coprivetrino, a contatto con la soluzione tampone, in modo da poter analizzare la soluzione o la proteina o qualsiasi altra sostanza presente sull'actina all'interno.
Quindi quello che faccio è scambiare effettivamente la soluzione durante l'acquisizione dell'immagine in time lapse. In questo modo.
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Panoramica
In questo articolo viene illustrata la costruzione di una camera a flusso e di una camera di fusione per l'acquisizione di immagini su un microscopio eretto. Il processo prevede la creazione di canali utilizzando parafilm e la loro sigillatura mediante riscaldamento.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia
Sfondo
- Le camere di flusso sono essenziali per varie tecniche di imaging.
- La costruzione di una camera di fusione consente capacità di imaging migliorate.
- Il Parafilm è comunemente utilizzato nei laboratori per creare sigilli.
- Comprendere il processo di costruzione è fondamentale per i ricercatori del settore.
Scopo dello studio
- Fornire una guida passo dopo passo per la costruzione di una camera a flusso.
- Illustrare l'uso del parafilm nella creazione di camere per imaging.
- Migliorare l'accessibilità delle tecniche di imaging per i ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Tagliare il parafilm in strisce per formare canali.
- Asciugare le strisce con aria inclinata.
- Posizionare un coprioggetto sopra il parafilm.
- Riscaldare l'insieme su un blocco termoregolato per creare una sigillatura.
Risultati principali
- Una camera di flusso funzionale è stata costruita con successo.
- Il processo di sigillatura si è rivelato efficace nella creazione di un ambiente stabile per l'acquisizione di immagini.
- Il metodo descritto è riproducibile per l'uso in laboratorio.
- I ricercatori possono utilizzare questa tecnica per diverse applicazioni di imaging.
Conclusioni
- La costruzione di camere di flusso e di fusione è semplice.
- Questo metodo può facilitare studi avanzati di imaging.
- L'accessibilità a tali tecniche può migliorare i risultati della ricerca.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la preparazione riproducibile di microambienti controllati per l'immagine di cellule vive, supportando studi meccanicistici sulla dinamica del citoscheletro. Standardizzando il montaggio della camera a flusso, riduce la variabilità nei saggi basati sulla perfusione, migliorando la coerenza dei dati tra diversi gruppi di ricerca. Il metodo facilita l'analisi quantitativa della cinetica di disassemblaggio dell'actina, un processo chiave nella motilità cellulare e nella trasduzione del segnale, rilevante per la validazione di bersagli in oncologia e immunologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'osservazione diretta della dinamica di depolimerizzazione dell'actina per analizzare i regolatori del rimodellamento del citoscheletro.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma standardizzata per testare gli effetti di composti sul turnover dell'actina in cellule vive.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Supporta lo sviluppo di letture basate sulla fluorescenza per i tassi di disassemblaggio dell'actina come punto finale di un saggio funzionale.
- Valore operativo: Permette lo scambio di soluzione durante l'acquisizione di immagini in differita per valutare le relazioni dose-risposta in condizioni di perfusione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la dinamica dell'actina a fenotipi cellulari rilevanti per metastasi, invasione e formazione della sinapsi immunitaria.
- Valore operativo: Consente la valutazione preclinica di inibitori della via mediante biomarcatori di imaging quantificabili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dallo screening dell'interazione con il bersaglio alla validazione funzionale in sistemi cellulari pertinenti alla malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui regolatori del citoscheletro attraverso la visualizzazione in tempo reale del flusso di actina.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili del disassemblaggio dell'actina in condizioni di perfusione controllate.
- Analisi: Genera dati di intensità fluorescente risolti nel tempo, consentendo la modellizzazione cinetica del turnover dell'actina.
- Ricerca traslazionale: Collega il meccanismo molecolare ai fenotipi cellulari in modelli preclinici di migrazione cellulare.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di perfusione riutilizzabile, adattabile a diversi bersagli citoscheletrici e tipi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli coinvolti nella regolazione dell'actina mediante letture funzionali dirette.
- Valore operativo: Una preparazione standardizzata delle camere migliora la riproducibilità del saggio tra diversi siti e operatori.
- Valore strategico: Consente decisioni più tempestive di prosecuzione o interruzione dello sviluppo, collegando la modulazione del bersaglio a esiti funzionali sul citoscheletro.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione di composti aggiustata in base al rischio, basandosi sugli effetti sui fenotipi di motilità e invasione cellulare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine di cellule vive e nel controllo del flusso microfluidico.
- Presuppone l'accesso a microscopi eretti dotati di controllo ambientale e capacità di perfusione.
- Necessita della standardizzazione dello spessore del parafilm e dei parametri di sigillatura per garantire coerenza tra diverse camere.
- L'adattamento a diversi tipi cellulari potrebbe richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di rivestimento della superficie e di polimerizzazione dell'actina.
- I limiti pratici includono gli effetti potenziali dello stress da taglio sulle cellule durante perfusioni prolungate, come indicato nel protocollo.
