Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia
November 8th, 2006
Ok, quello che vorrei fare oggi è mostrarvi come costruire una camera di flusso, una camera di fusione per l'imaging su un microscopio verticale. Quello che poi faccio è creare due spazi usando la pellicola. Quindi quello che faccio è prendere la pellicola para, tagliarla in piccole strisce.
Successivamente, questo formerà fondamentalmente i canali per le pareti, e li asciugherò con aria inclinata. Ho messo il vetrino coprioggetti sopra il paragrafo, ed ecco il finito. Poi lo riscaldo su un blocco termico per sciogliere il parametro e creare sostanzialmente una tenuta.
Quindi quello che è, è il vetro di copertura qui, e poi sopra il vetro di copertura ci sono due strati di phim come vedete proprio qui. E poi, in cima a questo, di nuovo, c'è un vetrino di 22 metri per due da due metri. Questo proprio qui, che ho premuto contro il param per far cadere il sigillo.
Ok, quindi il liquido va in una direzione qui e posso aspirarlo con una carta da filtro qui in questa direzione. E tra un po' vi mostrerò come farlo. Quindi quello che mi piace fare è metterlo in una camera umidificata, che è molto semplice.
Prendi due tipi di strisce rialzate e metti un filtro di carta sotto. E per mantenerlo rumoroso come me, ho messo il coperchio, il vetrino sulla camera di flusso. Ora, il modo in cui si introduce una soluzione alla camera è quello di mettere semplicemente la punta della pipetta all'ingresso della camera e si divide semplicemente.
Ora quello che faccio è incubare la camera con il coperchio chiuso per 10 minuti. Quello che faccio di solito per aspirare il liquido dall'altra parte è usarlo, prendere una carta da filtro e tagliarlo a strisce sottili come questa. E prendo una di queste strisce sottili e contemporaneamente applico la soluzione all'ingresso mentre metto la carta da filtro all'uscita per aspirare lo scambio, la soluzione.
Quindi vedrai il liquido scorrere attraverso la soluzione. E poi aspetto cinque minuti per la chiusura centrale. Ora quello che sono pronto a fare è mettere effettivamente l'actina e l'actina, in realtà devo polimerizzare, polimerizzo all'interno della camera di flusso e sono solo le stesse procedure di prima.
Quindi, perché in questo modo, e quindi ora che l'azione è polimerizzata, lavo via tutta l'azione non polimerizzata in eccesso utilizzando un grande volume di solo tampone. Quindi qui ho circa un centinaio di microlitri e sono pochi volumi di camera di reazione di tampone. Solo, sai, quando la carta da filtro si satura, devo cambiare direzione. Ok?
E quindi sono pronto a fare l'imaging con questo. Quindi camera di perfusione con actina attaccata ad essa. Ora prendo il vetrino, lo monto al microscopio e, dato che sto visualizzando con un obiettivo a olio, metterò un po' di olio da immersione sulla superficie superiore del coperchio, a contatto con l'erba, in modo da valutare la soluzione o le proteine o qualsiasi cosa sull'azione all'interno.
Quindi quello che faccio è poter effettivamente scambiare il lato della soluzione mentre sto facendo l'imaging time lapse. In quanto tale.
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Panoramica
Questo articolo dimostra la costruzione di una camera di flusso e di una camera di fusione per l'imaging su un microscopio verticale. Il processo prevede la creazione di canali utilizzando parafilm e il loro sigillamento con il calore.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia
Sfondo
- Le camere di flusso sono essenziali per varie tecniche di imaging.
- La costruzione di una camera di fusione permette capacità di imaging avanzate.
- Il parafilm è comunemente utilizzato in ambienti di laboratorio per creare sigilli.
- Comprendere il processo di costruzione è cruciale per i ricercatori nel campo.
Obiettivo dello studio
- Fornire una guida passo-passo per la costruzione di una camera di flusso.
- Illustrare l'uso del parafilm nella creazione di camere per l'imaging.
- Migliorare l'accessibilità delle tecniche di imaging per i ricercatori.
Metodi utilizzati
- Taglio del parafilm in strisce per formare i canali.
- Asciugatura delle strisce con aria inclinata.
- Posizionamento di un vetrino di copertura sopra il parafilm.
- Riscaldamento dell'assieme su un blocco riscaldante per creare un sigillo.
Risultati principali
- È stata costruita con successo una camera di flusso funzionale.
- Il processo di sigillamento è stato efficace nel creare un ambiente stabile per l'imaging.
- Il metodo dimostrato è riproducibile per uso di laboratorio.
- I ricercatori possono utilizzare questa tecnica per varie applicazioni di imaging.
Conclusioni
- La costruzione di camere di flusso e di fusione è semplice.
- Questo metodo può facilitare studi di imaging avanzati.
- L'accessibilità a tali tecniche può migliorare i risultati della ricerca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
