Name: Isolamento in ununica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Scopri l'isolamento di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi con un dispositivo microfluidico A4F biforcato. Questo metodo consente flusso continuo e automazione per applicazioni biomediche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo tutti i donatori che hanno partecipato a questo studio, il personale del database del genoma lettone per aver fornito i campioni. L'Istituto di Fisica dello Stato Solido dell'Università della Lettonia come Centro di Eccellenza ha ricevuto finanziamenti dal Programma Quadro Horizon 2020 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 739508, progetto CAMART2. Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto n. lzp-2019/1-0142 e progetto n.: lzp-2022/1-0373.

Dispositivo microfluidico per l'isolamento continuo di vescicole extracellulari dall'urina umana

<ol><li>Colombo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Tricarico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+drug+delivery+system+for+cancer+treatment%3A+Current+strategies+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances.</a> Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).</li>
<li>Royo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+separation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Results+of+a+Worldwide+Survey+Performed+by+the+ISEV+Rigor+and+Standardization+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee.</a> Cells. 9 (9), 1955(2020).</li>
<li>Sidhom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+Is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Reshi, Q. U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29+using+benchtop+size+exclusion+chromatography+%28SEC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns.</a> Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Priedols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcated+asymmetric+field+flow+fractionation+of+nanoparticles+in+PDMS-free+microfluidic+devices+for+applications+in+label-free+extracellular+vesicle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation.</a> Polymers. 15 (4), 789(2023).</li>
<li>Zhang, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-flow+field-flow+fractionation+technology+for+exomere+and+small+extracellular+vesicle+separation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).</li>
<li>Talebjedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+microfluidics+for+extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Potential+use+for+standardized+embryo+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment.</a> Front Vet Sci. 7, 620809(2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Bussooa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+oxygen+levels+within+thermoplastic+Organ-on-Chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%3A+X%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices.</a> Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).</li>
<li>Tang, L., Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+route+for+irreversible+bonding+of+plastic-PDMS+hybrid+microdevices+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature.</a> Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).</li>
<li>Borda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+neural+interface+based+on+off-stoichiometry+thiol-ene-epoxy+thermosets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets.</a> Biomaterials. 293, 121979(2023).</li>
<li>Sandström, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+injection+molding+and+direct+covalent+bonding+of+OSTE%2B+polymer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).</li>
<li>Sticker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+based+polymers+as+versatile+materials+for+microfluidic+devices+for+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).</li>
<li>Bajo-Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolation+from+large+volume+samples+using+a+polydimethylsiloxane-free+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).</li>
<li>Claridge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle+therapeutics%3A+Challenges%2C+considerations%2C+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).</li>
<li>Rezaie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+exosomes+application+in+clinical+trials%3A+Perspective%2C+questions%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges.</a> Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).</li>
<li>Aragón, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urinary+tract+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol+Focus%22%5BJournal%5D)">The urinary tract microbiome in health and disease.</a> Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).</li>
</ol>

A.A., G.M. e R.R. sono fondatori, membri del consiglio di amministrazione e azionisti di Cellbox Labs, LLC

Il dispositivo microfluidico presentato offre un metodo promettente per l'isolamento e l'estrazione di vescicole extracellulari da fluidi biologici, affrontando alcuni dei limiti critici dei metodi gold standard esistenti come UC e SEC12. UC e SEC sono noti per essere laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e soffrono di un basso rendimento, il che li rende meno adatti per applicazioni ad alto rendimento in cui sono necessarie grandi quantità di veicoli elettrici21,22. Al contrario, il dispositivo microfluidico descritto è in grado di elaborare in modo continuo un volume sostanziale fino a 20 mL di fluido biologico con un input minimo da parte dell'utente, il che lo rende un potenziale punto di svolta per ambienti industriali o clinici. Uno dei principali vantaggi di questo dispositivo microfluidico è la sua capacità di standardizzare l'isolamento delle vescicole extracellulari e migliorare la riproducibilità rispetto ai metodi tradizionali che prevedono passaggi manuali. Riducendo la variabilità della produzione di dispositivi di isolamento EV attraverso la produzione di massa, le prestazioni del dispositivo possono essere meglio controllate e coerenti, il che è fondamentale per applicazioni come la terapia e la diagnostica basate su EV. Inoltre, la compatibilità del dispositivo con la produzione di grandi volumi tramite stampaggio a iniezione a reazione di substrati idonei ne migliora ulteriormente il potenziale di scalabilità e di adozione più ampia.
Per garantire la riproducibilità e la costanza delle prestazioni, è necessario un protocollo esteso e ben definito, sia per produrre il chip che per il suo utilizzo negli esperimenti. Il chip è stato progettato pensando all'industrializzazione. Tuttavia, durante la fabbricazione del dispositivo nell'ambiente di laboratorio, è necessario prestare attenzione a evitare la formazione di bolle, garantire un legame preciso e robusto e condurre test approfonditi a velocità di flusso più elevate di quelle previste negli esperimenti reali. Questa precauzione è particolarmente importante per i dispositivi COC-OSTE, in quanto possono essere soggetti a perdite a causa di un collegamento non riuscito, soprattutto a portate più elevate. Inoltre, poiché l'OSTE è un materiale fotosensibile, la fabbricazione del dispositivo deve essere eseguita in luce gialla per evitare un'esposizione non necessaria ai raggi UV. Poiché questa tecnologia è ancora nelle sue fasi iniziali, i ricercatori dovrebbero sperimentare diverse velocità di flusso per identificare l'impostazione ottimale per la loro applicazione specifica, poiché i protocolli standardizzati per questo nuovo metodo devono ancora essere stabiliti e la viscosità del liquido può chiaramente influenzare l'efficacia dell'isolamento delle EV sulla base dei nostri risultati. Seguendo queste linee guida e affrontando le sfide della standardizzazione, il potenziale di questo dispositivo microfluidico per l'isolamento delle vescicole extracellulari può essere pienamente realizzato in varie aree di ricerca e applicazioni.
Il metodo di isolamento delle vescicole extracellulari utilizzando il dispositivo microfluidico consente ampie modifiche e risoluzione dei problemi per ottimizzare le prestazioni. Per migliorare la separazione delle particelle, i ricercatori possono esplorare canali più lunghi, diverse porosità della membrana e densità dei pori e dimensioni alterate. Se ci sono molte particelle di grandi dimensioni nell'uscita di piccole particelle, può essere utile testare una velocità di ingresso del tampone più elevata, mentre se ci sono molte particelle piccole nell'uscita di particelle grandi, si consiglia di sperimentare un canale più lungo o una membrana con pori più grandi. Affrontare l'assorbimento delle particelle può comportare la regolazione della velocità del flusso, delle modifiche superficiali e della composizione dell'OSTE o la modifica del tempo di esposizione ai raggi UV. Per i dispositivi che presentano instabilità e perdite, la riduzione della velocità di flusso e la garanzia di un corretto incollaggio sono passaggi cruciali. Per ridurre al minimo i danni causati dalle vescicole extracellulari, i ricercatori possono ridurre la velocità del flusso, lavare con PBS in modo più accurato dopo la sterilizzazione del dispositivo e prendere in considerazione l'utilizzo di pori della membrana più piccoli o tecniche e materiali alternativi per la progettazione di stampi. Attraverso queste regolazioni, il dispositivo microfluidico può essere messo a punto, liberando il suo potenziale per diverse applicazioni nella ricerca sui veicoli elettrici e nei campi correlati. Inoltre, per ottimizzare le prestazioni del dispositivo, è stato possibile incorporare la caratterizzazione del campione a monte, comprese le misure di densità e viscosità, per regolare i parametri di flusso. Inoltre, particolare enfasi deve essere posta sulla natura del campione, data la non sterilità accertata dei biofluidi23. Di conseguenza, la sterilizzazione dei campioni prima della loro somministrazione in applicazioni cliniche dovrebbe essere debitamente presa in considerazione.
Nonostante queste sfide, il dispositivo microfluidico ha un immenso potenziale in varie aree di ricerca. La sua capacità di isolare continuamente le vescicole extracellulari da grandi volumi di campioni altamente eterogenei apre le porte all'automazione, facilitando le applicazioni ad alto rendimento e consentendo un'analisi più approfondita delle vescicole extracellulari provenienti da fonti diverse. L'integrazione di questo modulo microfluidico in diversi dispositivi, come le cartucce di bioreattori a fibra cava o i citometri a flusso ad alta risoluzione, potrebbe rendere le applicazioni EV più favorevoli all'industria e guidare l'innovazione in campi come la somministrazione di farmaci, la diagnostica e i cosmetici4. Nel complesso, questo dispositivo microfluidico rappresenta un significativo passo avanti nel campo della ricerca sulle vescicole extracellulari, offrendo un metodo efficiente e standardizzato per l'isolamento delle vescicole extracellulari con applicazioni promettenti in un'ampia gamma di ambienti di ricerca e industriali.

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana derivate dalle cellule che comprendono due tipi principali: esosomi (30-200 nm) e microvescicole (200-1000 nm)1. Gli esosomi si formano attraverso la gemmazione verso l'interno della membrana endosomiale all'interno di un corpo multivescicolare (MVB), rilasciando vescicole intraluminali (ILV) nello spazio extracellulare dopo la fusione con la membrana plasmatica1. Al contrario, le microvescicole sono generate dalla gemmazione verso l'esterno e dalla fissione della membrana cellulare2. Le vescicole extracellulari svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare trasportando proteine, acidi nucleici, lipidi e metaboliti, riflettendo lo stato fisiologico della cellula, tra cui la crescita, l'angiogenesi, le metastasi, la proliferazione e la resistenza alla terapia3. Di conseguenza, sono emersi come promettenti biomarcatori e bersagli terapeutici per malattie, incluso il cancro, evidenziando il loro potenziale nella diagnostica e nei sistemi di somministrazione dei farmaci4.
Per utilizzare appieno le vescicole extracellulari nella diagnostica e nella terapia delle malattie, è fondamentale un isolamento efficiente da vari biofluidi5. I metodi comuni includono l'ultracentrifugazione (UC), la centrifugazione a gradiente di densità, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la filtrazione e l'immunoisolamento6. L'UC è una tecnica ampiamente utilizzata, ma può produrre particelle di densità simile che non sono EV e possono generare aggregati EV7. La SEC ha guadagnato popolarità grazie alla sua capacità di fornire campioni di purezza più elevata escludendo le particelle in base alle dimensioni piuttosto che alla densità8. Tuttavia, un'attenta selezione della dimensione dei pori appropriata per la colonna SEC e l'ottimizzazione delle condizioni cromatografiche sono essenziali per ridurre al minimo il co-isolamento di particelle indesiderate come i chilomicroni e le lipoproteine a bassa densità8. Nonostante la loro efficacia, entrambi i metodi richiedono molto tempo e sono difficili da automatizzare, soprattutto per campioni di volume maggiore come i terreni cellulari o le urine, limitandone la scalabilità per le applicazioni industriali9.
Negli ultimi anni, il frazionamento asimmetrico del campo di flusso di campo (A4F) si è evoluto come una potente tecnica di separazione per la separazione di particelle di dimensioni micro e nanometriche basata su dimensioni e galleggiabilità10. Il principio di funzionamento di A4F si basa su un canale microfluidico dotato di una membrana porosa alla sua base, che genera una forza esercitata verso la membrana chiamata cross-flow10. Se combinato con il moto browniano e il flusso di Poiseuille inerente al sistema, il flusso incrociato facilita un'efficiente separazione delle particelle grazie alla variazione della posizione delle particelle all'interno della dinamica del flusso11. Nonostante i vantaggi, questo metodo è limitato a volumi di campione nell'ordine dei microlitri12 e richiede un'ulteriore fase di messa a fuoco, prolungando la durata del processo10.
Nell'ultimo decennio, la microfluidica ha guadagnato importanza come strumento per una separazione rapida, efficiente e clinicamente affidabiledelle EV 13. Tuttavia, la maggior parte dei metodi microfluidici progettati per la separazione delle EV sono ottimizzati per campioni di piccole dimensioni e ad alta concentrazione o dipendono da procedure di separazione complesse14. Inoltre, nel campo della microfluidica, il polidimetilsilossano (PDMS) è riconosciuto come il materiale standard aureo grazie alla sua trasparenza ottica, alla biocompatibilità e alla facilità d'uso15. Tuttavia, la sua nota propensione ad assorbire piccole molecole lipofile, comprese le vescicole extracellulari, può essere problematica per la sua applicazione nel campo delle vescicole extracellulari13.
Il copolimero ciclico di olefine (COC) è un materiale frequentemente utilizzato in microfluidica a causa della biocompatibilità, del piccolo assorbimento delle molecole e dell'elevata resistenza chimica15. Tuttavia, la fabbricazione di dispositivi COC comporta spesso processi complessi o apparecchiature specializzate16. In alternativa, il tiolo-ene fuori stechiometria (OSTE) è un'alternativa promettente al PDMS grazie al ridotto assorbimento di piccole molecole, alla stabilità chimica superiore, alla facilità di fabbricazione e al processo di fabbricazione scalabile17,18. Tuttavia, a causa dei complessi collegamenti ai tubi, i dispositivi possono essere soggetti a perdite19.
Lo scopo di questo studio è stato quello di ingegnerizzare e fabbricare un dispositivo microfluidico che combinasse OSTE e COC e il principio A4F biforcato per la separazione delle EV da campioni di grandi volumi come urina o terreni cellulari.

<table><tbody><tr><td>0,1 &micro; m carbossilato FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>Concentrazione di riserva: 3,6 x 1013 perle/mL (dipendente dal LOTTO)</td></tr><tr><td>0,5 mL provette per microcentrifuga</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Siringa a cono Luer monouso senza ago</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &; m polistirene FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>Concentrazione di riserva: 1 x 1010 perline/mL (dipendente dal LOTTO)</td></tr><tr><td>10 mL Pipette sierologiche</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Filtri centrifughi Amicon Ultra</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Provette Protein LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 20 mL</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 &micro; m ID polietere etere chetone</td><td>tubo Darwin Microfluidics</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO unità di filtraggio centrifugo</td><td>Merck Millipore,</td> <td>UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>5 mL siringa medica senza ago</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL provette coniche</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti rotore per ultracentrifuga ad angolo fisso</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 &micro; m ID tubo in politetrafluoroetilene</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra a 96 pozzetti, f-bottom, legatura medica</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>piastra ELISA</td></tr><tr><td>B-27 Integratore (50x), senza siero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas piattaforma per vetrini</td> <td>per microscopiaMicrofluidic Chipshop</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas piattaforma per vetrini per microscopia 2 x 16 Mini Luer&nbsp;</td><td>Chipshop Microfluidic 10000387</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di pressione Elveflow OB1</td><td>Gruppo</td><td></td><td></td>Elvesys</tr><tr><td>Connettori Luer</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Allineatore maschera Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>analizzatore di nanoparticelle&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio ottico Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg gratuito. Bioreagenti Fisher. 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PC (diametro dei pori 50 nm, densità 11,8%)</td><td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri, sterili</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/colonna 35 nm</td><td>Colonna</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Izon SP5 SECQSIL 216 Kit elastomero siliconico</td><td>PP& S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resin Tough Black</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti swing ultracentrifuge rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 pallone di sospensione</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc proteina</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>Substrato di perossidasi di rafano</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità di pulizia ad ultrasuoni P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td> <td>universale per micropiastreBio-Tek instruments</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>Tazza per la raccolta delle urine, 150 ml, sterile</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa Whatman Anotop 25</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Sistema di</td><td>diffusione dinamica della luce (DLS)</td> panalitico<td></td>.</tr><tr><td>Zortrax Guglia d'inchiostro</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico a4f biforcato

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Le vescicole extracellulari (EV) hanno un immenso potenziale per varie applicazioni biomediche, tra cui la diagnostica, la somministrazione di farmaci e la medicina rigenerativa. Tuttavia, le attuali metodologie per isolare i veicoli elettrici presentano sfide significative, come la complessità, il consumo di tempo e la necessità di apparecchiature ingombranti, che ostacolano la loro traduzione clinica. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo mirato a sviluppare un innovativo sistema microfluidico basato su copolimero olefinico ciclico fuori stechiometria tiolo-ene (COC-OSTE) per l'isolamento efficiente di EV da campioni di grandi volumi in modo continuo. Utilizzando la separazione basata sulle dimensioni e sulla galleggiabilità, la tecnologia utilizzata in questo studio ha ottenuto una distribuzione dimensionale significativamente più stretta rispetto agli approcci esistenti da campioni di urina e terreni cellulari, consentendo il targeting di specifiche frazioni di dimensioni EV in applicazioni future. Il nostro innovativo design del dispositivo microfluidico COC-OSTE, che utilizza la tecnologia di frazionamento del flusso di campo a flusso asimmetrico biforcato, offre un approccio di isolamento EV semplice e continuo per campioni di grandi volumi. Inoltre, il potenziale per la produzione di massa di questo dispositivo microfluidico offre scalabilità e coerenza, rendendo fattibile l'integrazione dell'isolamento delle vescicole extracellulari nella diagnostica clinica di routine e nei processi industriali, dove l'elevata coerenza e produttività sono requisiti essenziali.

Abbiamo fabbricato un dispositivo microfluidico utilizzando uno stampo a doppio negativo stampato in 3D (Figura 1) tramite litografia morbida (Figura 2A) per la separazione di EV ad alta produttività basata sul principio A4F biforcato (Figura 2B,C). La configurazione richiede una pompa e una stazione di flusso, come si può vedere nella Figura 3, per l'isolamento dei veicoli elettrici in modo automatizzato. In primo luogo, per valutare la prova di concetto dei dispositivi, è stata preparata una miscela di perle di polistirene con diametri di 100 nm e 1000 nm per rappresentare vescicole e detriti cellulari fini, rispettivamente10. Sono stati condotti esperimenti con portate variabili per la miscela di microsfere, sia con che senza flusso biforcato, per studiare l'effetto della velocità lineare sull'efficienza di separazione. In tutti gli esperimenti, il recupero di piccole perle è rimasto costante e superiore al 90%10, dimostrando il potenziale del dispositivo per il recupero delle vescicole extracellulari.
Quindi, abbiamo valutato e confrontato il potenziale del dispositivo COC-OSTE nell'isolare le vescicole extracellulari da grandi volumi (&gt;1 mL) da biofluidi complessi con una pre-elaborazione minima. Pertanto, l'urina di 10 donatori sani (Figura 4) e i terreni cellulari di due diverse linee cellulari prostatiche (Figura 5) sono stati utilizzati come modello per isolare simultaneamente le vescicole extracellulari seguendo tre diverse procedure: ultracentrifugazione (UC), cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e il dispositivo OSTE-COC basato sulla microfluidica A4F. Dopo l'isolamento, il numero totale di particelle e la loro distribuzione dimensionale sono stati valutati utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). In media, il dispositivo OSTE-COC ha mostrato un migliore recupero totale delle particelle dai biofluidi rispetto all'UC, ma la significatività statistica è stata raggiunta solo quando si combinano i numeri di particelle di entrambe le porte (Figura 4A). Al fine di confrontare le prestazioni del dispositivo con altri sistemi, è necessario prendere in considerazione l'uscita R &amp; L insieme. Come mostrato nella Figura 4, le prestazioni dell'uscita L &amp; R nel recupero delle EV superano UC e SEC. Separatamente, la porta L è stata progettata per catturare la piccola frazione EV, mentre la porta R è stata progettata per raccogliere la frazione EV più grande con altre molecole di dimensioni simili. È interessante notare che il recupero utilizzando l'R-PORT del dispositivo OSTE-COC è stato leggermente superiore a SEC e UC da soli (Figura 4A). L'espressione di CD63 ha mostrato un pattern simile (Figura 4C). Questo risultato indica che il dispositivo OSTE-COC è stato più efficace nel recupero totale delle vescicole extracellulari. È stata trovata una distribuzione granulometrica equivalente tra le diverse metodologie, ad eccezione della UC, che mostra una maggiore distribuzione granulometrica (Figura 4B).
Risultati comparabili sono stati osservati nelle colture di terreni cellulari. In entrambi gli scenari, il recupero totale delle particelle da entrambe le porte del dispositivo ha mostrato prestazioni superiori rispetto alle metodologie SEC o UC (come illustrato nella Figura 5A,B). In particolare, le vescicole extracellulari derivate da cellule PC3 hanno dimostrato una distribuzione dimensionale distinta, con una maggiore omogeneità nella distribuzione L-PORT rispetto ad altri gruppi sperimentali (Figura 5C,D). Inoltre, l'analisi dell'espressione di CD63 ha confermato i tassi di recupero delle EV più elevati ottenuti utilizzando il dispositivo COC-OSTE (come illustrato nella Figura 5E,F). Una sintesi che confronta le caratteristiche di isolamento delle diverse metodologie esaminate in questo studio è riportata nella Tabella 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> Figura 1: Dimensioni dello stampo doppio negativo a forma di serpentina 3DP e vista isometrica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> Figura 2: Dispositivo microfluidico COC-OSTE. (A) Schema delle diverse fasi principali di fabbricazione del dispositivo OSTE-COC. (B) Principio di funzionamento del dispositivo. (C) Immagine del dispositivo finito. Barra graduata: 15 mm. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Priedols et al.10 e Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> Figura 3: Configurazione sperimentale del dispositivo. La pompa a siringa è a sinistra, il dispositivo OSTE-COC è al centro e la stazione di recupero è a destra. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Priedols et al.10 e Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> Figura 4: Distribuzione delle dimensioni delle vescicole extracellulari urinarie e recupero delle particelle da 10 donatori utilizzando l'ultracentrifugazione (UC), la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e il dispositivo COC-OSTE. (A) Quantità di particelle recuperata da ciascun metodo di isolamento mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Dati rappresentati come deviazione standard media +/-. Significatività statistica indicata con * (p&lt;0,05). (B) I boxplot mostrano la distribuzione granulometrica media tra tutti i campioni di urina valutati mediante NTA, con baffi che indicano i valori minimo e massimo. I valori P sono stati derivati da confronti con UC, con **** che indica un'elevata significatività statistica (p&lt;0,0001). (C) La mediana e l'intervallo della quantità media di CD63, valutata utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico a doppio sandwich (dsELISA), per ciascun metodo di isolamento, sono stati calcolati su tutti i campioni. Porta L: porta sinistra; Porta R: porta destra. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> Figura 5: Caratterizzazione di EV isolate da cellule PC3 e LNCaP utilizzando metodi diversi. (A) Quantità di particelle recuperata dal mezzo PC3 utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) rappresentata dalla deviazione standard media+/-. (B) Quantità di particelle recuperate dal terreno cellulare LNCaP utilizzando NTA rappresentato come deviazione standard media +/-. (C) La distribuzione granulometrica mediana delle vescicole extracellulari delle colture PC3, insieme all'intervallo, è stata determinata mediante NTA. (D) Distribuzione dimensionale mediana di vescicole extracellulari isolate da colture LNCaP con range. (E) Mediana e range di espressione di CD63 per ciascun metodo di isolamento per EV derivate da linee cellulari PC3, utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico a doppio sandwich (dsELISA). (F) Mediana e range di espressione di EV CD63 derivata da LNCaP mediante dsELISA per ciascun metodo di isolamento. UC: Ultracentrifugazione; SEC: Cromatografia ad esclusione dimensionale; Porta L: porta sinistra; Porta R: porta destra. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UC</td>
			<td>SECONDO</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr><tr><td>Tempo di lavorazione/campione</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>Velocità effettiva</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Costo/campione</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Purezza</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Automatizzazione</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Rendimento EV</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Selezione della taglia</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1. Confronto delle caratteristiche di isolamento delle vescicole extracellulari con i tre metodi: UC SEC e il dispositivo COC-OSTE. UC: Ultracentrifugazione; SEC: Cromatografia ad esclusione dimensionale. COC-OSTE: copolimero olefinico ciclico-off-stechiometria tiolo-ene. +: basso; ++: medio; +++: alto. * A seconda del dispositivo.

Le vescicole extracellulari sono estremamente promettenti per le applicazioni biomediche, ma gli attuali metodi di isolamento richiedono molto tempo e non sono pratici per l'uso clinico. In questo studio, presentiamo un dispositivo microfluidico che consente l'isolamento diretto di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi in modo continuo con passaggi minimi.

Isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Vediamo il potenziale delle vescicole extracellulari, ma riconosciamo anche la difficoltà nel loro isolamento, specialmente da campioni di grandi dimensioni come i terreni del bioreattore. In questa ricerca abbiamo testato se possiamo utilizzare il frazionamento asimmetrico del flusso di campo per isolare le vescicole extracellulari. Al momento, è impossibile isolare le vescicole extracellulari direttamente dai biofluidi in un flusso continuo per l'integrazione nei bioreattori.Invece, i biofluidi devono essere prima raccolti e lavorati, aggiungendo variabilità e manodopera. Il nostro dispositivo progettato per l'isolamento delle vescicole extracellulari da biofluidi di grande volume consente l'integrazione con i bioreattori per il flusso continuo e l'automazione. Abbiamo scoperto che la viscosità del liquido potrebbe influire sull'isolamento delle vescicole extracellulari utilizzando il frazionamento asimmetrico del flusso di campo.Stiamo esplorando se l'adattamento dei flussi di biofluidi e tamponi alla viscosità possa migliorare l'isolamento.

single-step-isolation-extracellular-vesicles-from-large-volume

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Fonte: Watson, DC, et.al. Isolamento e purificazione scalabili di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'isolamento e la concentrazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dalla membrana esterna di batteri geneticamente modificati. Il processo prevede la coltura dei batteri per rilasciare le vescicole extracellulari, seguita da fasi sequenziali di centrifugazione e filtrazione per rimuovere cellule e detriti. Infine,...

Isolamento e arricchimento di vescicole extracellulari derivate dalla membrana esterna da batteri

Fonte: Watson, D. C., et al. Isolamento e purificazione scalabili di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'uso della cromatografia ad esclusione dimensionale con perle di resina porosa per isolare le vescicole extracellulari batteriche (EV) da un filtrato di coltura batterica. Le vescicole extracellulari più grandi eluiscono presto bypassando i pori della resina, mentre le proteine più piccole entrano nei pori ed eluiscono più...

Isolamento di vescicole extracellulari batteriche mediante cromatografia ad esclusione dimensionale 

Dettagli Questo protocollo di un metodo per isolare vescicole extracellulari (EV), piccole particelle membranose rilasciate dalle cellule, da un minimo di 10 campioni di siero microlitri. Questo approccio elude la necessità di ultracentrifugazione, richiede solo pochi minuti di tempo di saggio, e permette l'isolamento di EVs da campioni di volumi limitati.

Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

Questo protocollo descrive un'architettura di sistema per l'esecuzione di separazioni automatizzate di particelle di piccolo volume (0,15-1,5 ml) utilizzando un dispositivo microfluidico e discute i metodi per ottimizzare le prestazioni e il funzionamento del dispositivo acustofluidico.

Una piattaforma per l&#39;elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.

Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione

Qui presentiamo un protocollo prontamente applicabile per valutare la stabilità di stoccaggio delle vescicole extracellulari, un gruppo di nanoparticelle naturali prodotte dalle cellule. Le vescicole sono caricate con glucuronidasi come un enzima modello e immagazzinate in condizioni diverse. Dopo la conservazione, vengono valutati i loro parametri fisico-chimici e l'attività dell'enzima incapsulato.

Valutazione della stabilità di conservazione delle vescicole extracellulari

Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento, la concentrazione e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da colture cianobatteriche. Vengono inoltre discussi gli approcci per purificare le vescicole da colture a diverse scale, i compromessi tra le metodologie e le considerazioni per lavorare con i campioni sul campo.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche

Questo protocollo dimostra come isolare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEV) con una semplice impostazione da banco su scala di laboratorio. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori sEVs e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono caratterizzati rispettivamente dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal saggio della proteina BCA, dal western blot e dal microscopio elettronico a trasmissione.

Un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento rapido e specifico per le dimensioni delle piccole vescicole extracellulari ottimizzando le dimensioni dell'ugello di nebulizzazione dell'aria, la pressione del fluido della guaina, la pressione del flusso del campione, la tensione, il guadagno e i parametri di soglia di attivazione.

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Scopri l'isolamento di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi con un dispositivo microfluidico A4F biforcato. Questo metodo consente flusso continuo e automazione per applicazioni biomediche.

Isolamento in ununica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato (Video) | JoVE Journal

Isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato

Esplora altri video