Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione
10 novembre 2023
L'applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.
Una sfida comune nella preparazione dei campioni di microscopia crioelettronica è la localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua, che fa sì che le particelle adottino orientamenti e denaturano preferenziali. Invece, è meglio che le particelle poggino sulla superficie della griglia, che il film sottile supporta, come il grafene promuove. Un'altra sfida è la necessità di concentrazioni di campioni relativamente elevate, che potrebbero essere affrontate anche dal grafene.
Le griglie rivestite in grafene offrono numerosi vantaggi per la determinazione della struttura crioEM, ma sono state storicamente difficili da fabbricare internamente in modo riproducibile, oltre a costi proibitivi per l'acquisto commerciale. Questo protocollo consente la deposizione robusta di grafene monostrato, abbassando così la barriera per gli utenti che impiegano queste griglie nella loro ricerca. Il grafene è unico per le sue proprietà materiali.
Si tratta di un monostrato di carbonio e quindi presenta un rumore di fondo minimo. Altri supporti della griglia cryoEM, come un sottile strato di fiocchi di carbonio amorfo o ossido di grafene, non possono essere applicati come un singolo monostrato e contribuiscono a un maggiore segnale di fondo. Ora che abbiamo stabilito un protocollo robusto per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM, vorremmo perseguire la funzionalizzazione di griglie rivestite di grafene con maniglie di affinità per la cattura on-grid direttamente dai lisati cellulari.
Ciò potrebbe alleviare un altro collo di bottiglia nella preparazione dei campioni crioEM.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per rivestire griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) con un monostrato di grafene. L'uso del grafene aumenta la densità delle particelle, minimizza le interazioni con l'interfaccia aria-acqua e migliora la distribuzione dell'orientamento delle particelle.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Microscopia elettronica criogenica
- Scienza dei materiali
- Tecniche di preparazione dei campioni
Sfondo
- La localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua è una sfida comune nella microscopia elettronica criogenica.
- Orientamenti preferenziali possono portare alla denaturazione delle particelle.
- I supporti in grafene possono aiutare le particelle a posarsi sulla superficie della griglia.
- Storicamente, la fabbricazione di griglie rivestite con grafene è stata difficile e costosa.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo robusto per il deposito di grafene monocristallino su griglie per microscopia crioelettronica.
- Ridurre gli ostacoli per i ricercatori nell'utilizzo di griglie rivestite con grafene.
- Potenziare i vantaggi della determinazione della struttura mediante microscopia crioelettronica.
Metodi Utilizzati
- Sviluppo di un protocollo per il rivestimento con grafene.
- Valutazione della densità e dell'orientamento delle particelle.
- Confronto tra griglie rivestite con grafene e griglie tradizionali.
- Valutazione della riproducibilità nella fabbricazione delle griglie.
Risultati principali
- Le griglie rivestite di grafene migliorano in modo significativo la localizzazione delle particelle.
- Una densità di particelle più elevata permette una migliore determinazione della struttura.
- Un protocollo robusto facilita la fabbricazione in sede di griglie in grafene.
- Costi ridotti e maggiore accessibilità per i ricercatori.
Conclusioni
- L'uso del grafene nelle griglie per microscopia crioelettronica affronta le sfide principali nella preparazione dei campioni.
- Questo protocollo favorisce un'adozione più ampia delle griglie rivestite di grafene nella ricerca.
- Le proprietà uniche del grafene potenziano le capacità della microscopia crioelettronica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I collo di bottiglia nella preparazione dei campioni in microscopia elettronica criogenica (cryoEM) limitano l'efficienza e l'affidabilità della determinazione di strutture ad alta risoluzione nei flussi di lavoro della scoperta precoce e della biologia strutturale. L'applicazione di grafene monocristallino alle griglie per cryoEM affronta sfide critiche legate alla localizzazione delle particelle, al bias di orientamento e ai requisiti di concentrazione del campione, influenzando direttamente la fiducia predittiva nelle attività di validazione del target e negli studi meccanicistici. Protocolli robusti e riproducibili per griglie al grafene permettono un'adozione più ampia a livello aziendale, sostenendo l'avanzamento del portafoglio progettuale con gestione del rischio e un'allocazione efficiente delle risorse.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi strutturale ad alta fedeltà di bersagli macromolecolari a risoluzione quasi atomica.
- Riduce la denaturazione del campione e il bias di orientamento, favorendo la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Facilita una valida conferma del bersaglio migliorando la densità delle particelle e la coerenza delle immagini.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara supporti a griglia standardizzati e riproducibili per flussi di lavoro crioelettronici successivi.
- Migliora l'affidabilità del saggio riducendo al minimo il rumore di fondo e potenziando gli output quantitativi dell'imaging.
- Consente lo screening su larga scala di complessi strutturalmente diversi a concentrazioni di campione più basse.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette studi strutturali di complessi rilevanti per le malattie, sostenendo l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Garantisce continuità dall'elucidazione strutturale in fase di scoperta alla validazione preclinica dei meccanismi molecolari.
- Riduce il rischio di fallimento biologico in fase avanzata assicurando la qualità dei dati strutturali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La preparazione della griglia in grafene monocristallino si integra nel flusso di lavoro della criomicroscopia elettronica, dalla fase iniziale di scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti e alla ricerca preclinica, sostenendo la determinazione strutturale guidata da ipotesi e fornendo spunti meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta test robusti dell'ipotesi nulla consentendo confronti strutturali accurati tra diverse condizioni.
- Screening: Fornisce griglie riproducibili con basso fondo per l'imaging quantitativo e la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Offre schemi di diffrazione e mappe di densità di alta qualità per l'analisi statistica e il processo decisionale.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la continuità dei dati strutturali per bersagli e complessi rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità scalabile e riproducibile di preparazione delle griglie per programmi R&S diversificati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi strutturali.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione delle griglie, migliora la riproducibilità e riduce i requisiti di input del campione.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale riducendo i collo di bottiglia nella preparazione dei campioni.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e lo sviluppo di target validati strutturalmente con una gestione del rischio adeguata.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione del grafene e nella preparazione delle griglie per microscopia crioelettronica (cryoEM).
- Necessita dell'accesso a spin coater, unità per scarica al plasma (glow discharge) e pulitori a ozono-UV.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi sistemi macromolecolari o tipi di campione.
- I limiti pratici includono la gestione della fragilità e la garanzia dell'integrità del monostrato durante il trasferimento.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
