Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione
November 10th, 2023
L'applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.
Una sfida comune nella preparazione dei campioni di microscopia crioelettronica è la localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua, che fa sì che le particelle adottino orientamenti e denaturano preferenziali. Invece, è meglio che le particelle poggino sulla superficie della griglia, che il film sottile supporta, come il grafene promuove. Un'altra sfida è la necessità di concentrazioni di campioni relativamente elevate, che potrebbero essere affrontate anche dal grafene.
Le griglie rivestite in grafene offrono numerosi vantaggi per la determinazione della struttura crioEM, ma sono state storicamente difficili da fabbricare internamente in modo riproducibile, oltre a costi proibitivi per l'acquisto commerciale. Questo protocollo consente la deposizione robusta di grafene monostrato, abbassando così la barriera per gli utenti che impiegano queste griglie nella loro ricerca. Il grafene è unico per le sue proprietà materiali.
Si tratta di un monostrato di carbonio e quindi presenta un rumore di fondo minimo. Altri supporti della griglia cryoEM, come un sottile strato di fiocchi di carbonio amorfo o ossido di grafene, non possono essere applicati come un singolo monostrato e contribuiscono a un maggiore segnale di fondo. Ora che abbiamo stabilito un protocollo robusto per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM, vorremmo perseguire la funzionalizzazione di griglie rivestite di grafene con maniglie di affinità per la cattura on-grid direttamente dai lisati cellulari.
Ciò potrebbe alleviare un altro collo di bottiglia nella preparazione dei campioni crioEM.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per rivestire le griglie per microscopia elettronica criogenica (cryoEM) con un monostrato di grafene. L'uso del grafene migliora la densità delle particelle, minimizza le interazioni con l'interfaccia aria-acqua e migliora la distribuzione dell'orientamento delle particelle.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Microscopia elettronica criogenica
- Scienza dei materiali
- Tecniche di preparazione dei campioni
Sfondo
- La localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua è una sfida comune nella cryo-EM.
- Le orientazioni preferite possono portare alla denaturazione delle particelle.
- I supporti di grafene possono aiutare le particelle a riposare sulla superficie della griglia.
- Storicamente, le griglie rivestite di grafene sono state difficili e costose da fabbricare.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo robusto per la deposizione di monostrato di grafene su griglie cryoEM.
- Abbassare le barriere per i ricercatori nell'utilizzo di griglie rivestite di grafene.
- Migliorare i vantaggi della determinazione della struttura cryo-EM.
Metodi utilizzati
- Sviluppo di un protocollo per il rivestimento di grafene.
- Valutazione della densità e dell'orientamento delle particelle.
- Confronto tra griglie rivestite di grafene e griglie tradizionali.
- Valutazione della riproducibilità nella fabbricazione delle griglie.
Principali risultati
- Le griglie rivestite di grafene migliorano significativamente la localizzazione delle particelle.
- Una densità di particelle migliorata permette una migliore determinazione della struttura.
- Il protocollo robusto facilita la fabbricazione in casa delle griglie di grafene.
- Costi inferiori e migliore accessibilità per i ricercatori.
Conclusioni
- L'uso del grafene nelle griglie cryo-EM affronta le sfide chiave nella preparazione del campione.
- Questo protocollo consente un'adozione più ampia di griglie rivestite di grafene nella ricerca.
- Le proprietà uniche del grafene migliorano le capacità cryo-EM.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
