Name: Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: Impara un metodo efficiente per estrarre il veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale in polietilene. Questo protocollo facilita lo studio della composizione proteica e delle funzioni del veleno.

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Riconosciamo il sostegno finanziario della Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Hainan (Sovvenzione n. 323QN262), della Fondazione Nazionale per le Scienze Naturali della Cina (Sovvenzione n. 31701843 e 32172483), del Fondo per l'Innovazione Scientifica e Tecnologica dell'Agricoltura del Jiangsu (Sovvenzione n. CX(22)3012 e CX(21)3008), la Fondazione "Shuangchuang Doctor" della provincia di Jiangsu (sovvenzione n. 202030472) e il fondo di avvio dell'Università agraria di Nanchino (sovvenzione n. 804018).

1. Allevamento di insetti
<ol><li>Somministrare Corcyra cephalonica con farina di mais ad una temperatura di 26 ± 1°C e un'umidità relativa del 40% ± 10%.</li>
	<li>Allevare il ceppo di T. dendrolimi dell'insetto Jilin indoor utilizzando le uova di Corcyra cephalonica come ospiti. Nutrire gli adulti di vespe con acqua di saccarosio al 10% in provette di Drosophila a una temperatura di 26 ± 1 °C, umidità relativa del 70% ± 10%, luce (L): buio (D) periodo di 14 h: 10 h.</li>
</ol>2. Preparazione delle carte uovo in film plastico di polietilene
<ol><li>Prendi una pellicola di plastica in polietilene con una lunghezza di 16 cm, una larghezza di 12 cm e uno spessore di 20 μm. Pressare 30 sporgenze semicircolari con un diametro di 2-3 mm e un'altezza di circa 3 mm utilizzando un'asta di molatura del vetro secondo la disposizione standard della piastra PCR di 96 fori. NOTA: Il processo di pressatura di 30 sporgenze semicircolari utilizzando un'asta di macinazione del vetro deve essere eseguito prestando attenzione alla pressione perché una pressa troppo dura perforerà la plastica e contaminerà l'asta di macinazione senza veleno estratta.</li>
	<li>Disinfettare il film plastico di polietilene pressato esponendo entrambi i lati alla luce ultravioletta (UV) per 1 ora.</li>
	<li>Aggiungere una piccola quantità di alcol polivinilico al 10% sulla superficie semicircolare.</li>
</ol>3. Parassitismo di Trichogramma dendrolimi 
<ol><li>Dopo l'anestesia CO2 , posizionare le vespe femmine di T. dendrolimi in una scatola di raccolta e il numero di vespe era ~ 3000.</li>
	<li>Posizionare il lato convesso della carta uovo in pellicola verso la scatola di raccolta e fissare i bordi con un elastico.</li>
	<li>Aggiungere 4 μL di soluzione aminoacidica (6 g/L di leucina, 4 g/L di fenilalanina, 4,25 g/L di istidina) a ciascuna protrusione semicircolare. Copritela con una pellicola di plastica piatta in polietilene lunga 16 cm e larga 12 cm. Utilizzare un elastico per coprire ermeticamente il contenitore di raccolta con due fogli di plastica.</li>
	<li>Lasciare che le vespe T. dendrolimi parassitino liberamente per 4-8 ore e forniscano il 10% di acqua di saccarosio attraverso il cotone bagnato.</li>
</ol>4. Raccolta del veleno di T. dendrolimi 
<ol><li>Ottenere la soluzione di amminoacidi parassitati dalla sporgenza interna della scheda uovo artificiale e trasferirla nel tappo delle provette da 1,5 mL.</li>
	<li>Coprire il tappo della provetta con una rete di nylon da 10 μm di diametro 25 mm, fissare saldamente la rete di nylon e la provetta da centrifuga. Posizionare la provetta da centrifuga in posizione verticale per una centrifugazione breve utilizzando una minicentrifuga (1360 x g) per 10 secondi e raccogliere la soluzione filtrata (~100 μL di veleno di T. dendrolimi ).</li>
	<li>Misurare la concentrazione del veleno di T. dendrolimi raccolto utilizzando un kit per il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Conservare il veleno a -80 °C per ulteriori analisi.</li>
</ol>5. Analisi SDS-PAGE
<ol><li>Aggiungere 30 μL di veleno di T. dendrolimi a 10 μL di tampone di caricamento del campione su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (Tabella dei materiali) e riscaldare a 95 °C per 10 min.</li>
	<li>Eseguire il ciclo del gel SDS-PAGE a 130 V per 120 min.</li>
	<li>Colorare e decolorare il gel SDS-PAGE utilizzando l'apparato di colorazione delle proteine (Tabella dei materiali).</li>
</ol>

Parassita artificiale dell'ospite mediante Trichogramma dendrolimi ed estrazione del veleno

<ol><li>Pennacchio, F., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+developmental+strategies+in+parasitic+hymenoptera%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera.</a> Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).</li>
<li>Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advances+on+composition%2C+function+and+evolution+of+venom+proteins+in+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps.</a> Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Asgari, S., Rivers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+proteins+from+endoparasitoid+wasps+and+their+role+in+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions.</a> Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).</li>
<li>Moreau, S. J. M., Guillot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+prospects+on+biosynthesis%2C+structures%2C+and+functions+of+venom+proteins+from+parasitic+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).</li>
<li>Yan, Z. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+venom+serpin+splicing+isoform+of+the+endoparasitoid+wasp+Pteromalus+puparum+suppresses+host+prophenoloxidase+cascade+by+forming+complexes+with+host+hemolymph+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases.</a> Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).</li>
<li>Woelke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+biology+of+two+new+egg+parasitoid+species+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+reared+from+eggs+of+Heliconiini+butterflies+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%3A+Heliconiinae%29+in+Panama%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+History%22%5BJournal%5D)">Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama.</a> Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).</li>
<li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+with+Trichogramma+in+China%3A+History%2C+present+status%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives.</a> Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).</li>
<li>Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+potassium+chloride+and+magnesium+sulfate+on+parasitoid+wasp+oviposition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition.</a> Science. 218, 4568(1982).</li>
<li>Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kairomonal+stimulation+of+oviposition+into+an+artificial+substrate+by+the+endoparasitoid+Microplitis+croceipes+%28Hymenoptera%29Braconidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).</li>
<li>Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Habrobracon+hebetor%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Biological+Control%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Habrobracon hebetor.</a> Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).</li>
<li>Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+Trichogramma+ostriniae+with+artificial+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs.</a> Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).</li>
<li>Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviposition+behavior+of+twelve+species+of+Trichogramma+and+its+influence+on+the+efficiency+of+rearing+them+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro.</a> Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).</li>
<li>Xing, J. Q., Li, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+of+an+egg+parasite+Anastatus+japonicus+Ashmead+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro.</a> Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).</li>
<li>Moreau, S. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22It+stings+a+bit+but+it+cleans+well%22%3A+Venoms+of+Hymenoptera+and+their+antimicrobial+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">"It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).</li>
<li>Moreau, S. J. M., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+proteins+from+parasitoid+wasps+and+their+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function.</a> Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).</li>
</ol>

L'autore non ha nulla da rivelare e non ha interessi finanziari concorrenti.

Qui, presentiamo un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. I punti chiave dell'esperimento di raccolta del veleno sono i seguenti. (1) Durante la preparazione, T. dendrolimi deve essere anestetizzato rapidamente con un'adeguata concentrazione di CO2 . Se la concentrazione di CO2 è troppo bassa, sarà insufficiente per anestetizzare rapidamente il Trichogramma . Al contrario, se la concentrazione è troppo alta, i Trichogramma ...

Le vespe parassitoidi sono insetti imenotteri parassiti che rappresentano importanti risorse per la lotta biologica1. Esiste un'ampia varietà di vespe parassitoidi, con oltre 600.000 specie stimate2. La diversità delle vespe parassitoidi supera di gran lunga quella di altri artropodi velenosi, come serpenti, lumache a cono, ragni, scorpioni e api. Il veleno è un importante fattore parassitario nelle vespe parassitoidi. Per il successo del parassitismo, il veleno viene iniettato nell'ospite, modulando il comportamento, l'immunità, lo sviluppo e il metabolismodell'ospite 3. Inoltre, il veleno delle vespe parassitoidi mostra una notevole diversità nelle sue strutture molecolari, nei suoi bersagli e nelle sue funzioni, riflettendo la complessa coevoluzione con i loro ospiti. Pertanto, il veleno parassitoide è una risorsa preziosa e sottovalutata di molecole attive per scopi insetticidi o medici4. A differenza del veleno di serpenti, lumache, ragni, scorpioni e api, il veleno di vespe parassitoidi non può essere raccolto mediante stimolazione diretta o elettrostimolazione5. L'attuale metodo di estrazione del veleno di vespa parassitoide consiste nel sezionare il serbatoio del veleno. Tuttavia, le vespe parassitoidi sono spesso piccole e la dissezione delle vespe parassitoidi richiede elevate competenze tecniche. Pertanto, se riusciamo a trovare un modo per raccogliere il veleno delle vespe parassitoidi in modo efficiente e conveniente, sarà di grande aiuto ricercare il veleno delle vespe parassitoidi.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) è un genere di minuscole vespe parassitoidi (lunghe ~0,5 mm)6. Queste vespe sono tra gli agenti di biocontrollo più utilizzati, in particolare per le uova di vari parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Ad esempio, T. dendrolimi, una delle specie di Trichogramma più utilizzate in Cina, è stata ampiamente applicata per controllare una varietà di parassiti agricoli e forestali, come Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis e Chilo suppressalis. Studi precedenti hanno dimostrato che le vespe Trichogramma potevano iniettare le loro uova in ospiti artificiali7. Gli ospiti artificiali possono essere creati utilizzando materiali come cera8, agar9, Parafilm10 e film plastico11. La soluzione in ospiti artificiali che induce un'ovideposizione sufficiente per Trichogramma può essere semplice, come amminoacidi o sali inorganici12. Sulla base della caratteristica che T. dendrolimi può parassitare gli ospiti artificiali, questo studio fornisce un nuovo metodo per estrarre il veleno dalle vespe parassitoidi utilizzando ospiti artificiali. Questo approccio mira ad affrontare le carenze di bassa resa, bassa purezza e suscettibilità alla contaminazione nelle attuali tecniche di estrazione. Utilizzando questo metodo, è possibile estrarre una grande quantità di veleno ad alta purezza da T. dendrolimi , che soddisfa le esigenze della ricerca scientifica e dello screening di molecole bioattive per scopi insetticidi o medici.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; m Rete di nylon</td><td>Millipore</td><td>NY1002500</td><td>Per filtrare le uova</td></tr><tr><td>10% Alcool polivinilico</td><td>Aladino</td><td>P139533</td><td>Per attirare&nbsp; T. dendrolimi&nbsp; per deporre le uova</td></tr><tr><td>10% Acqua di saccarosio</td><td>Sinopharm Reagente chimico&nbsp;</td><td>10021463</td><td>Feed Trichogramma dendrolimi</td></tr><tr><td>4x LDS buffer di caricamento</td><td>Ace Hardware</td><td>B23010301</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Scatola di raccolta</td><td>Deli</td><td>8555</td><td>Contenitore per T. dendrolimi parassitismo</td></tr><tr><td>Futuro PAGE&nbsp; 4&ndash; 12% (12 pozzetti)Ace</td> <td>Hardware</td><td>J70236502X</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>GenScript eStain L1 apparato di colorazione delle proteine</td><td>GenScript</td><td>L00753</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Asta di macinazione in vetro&nbsp; &nbsp;</td><td>Applygen</td><td>tb6268</td><td>Sporgenze semicircolari&nbsp;</td></tr><tr><td>L- Leucina</td><td>Solarbio</td><td>L0011</td><td>Componenti dell'ospite artificiale</td></tr><tr><td>L-Istidina</td><td>Aladino</td><td>A2219458</td><td>Componenti dell'ospite artificiale</td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Solarbio</td><td>P0010</td><td>Componenti dell'ospite artificiale</td></tr><tr><td>Mini-Centrifughe</td><td>Scilogex</td><td>D1008</td><td>Centrifuga</td></tr><tr><td>MOPS-SDS buffer di funzionamento</td><td>Ace Hardware</td><td>B23021</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio istantaneo delle proteine BCA Omni-Easy</td><td>Shanghai Yamay Biomedical Technology&nbsp;</td><td>ZJ102</td><td>Per l'esimazione della concentrazione proteica del veleno</td></tr><tr><td>Layout della piastra PCR di 96 fori</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1400L</td><td>Protrusioni semicircolari&nbsp;</td></tr><tr><td>Film plastico in polietilene</td><td>Suzhou Aopang Trading &nbsp;</td><td>001c5427</td><td>Carta dell'uovo artificiale</td></tr><tr><td>Marcatore proteico di colore prestained (10&ndash; 180 kDa)</td><td>YiFeiXue Biotech</td><td>YWB007</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Elastico</td><td>Guangzhou qianrui biologia scienza e tecnologia</td><td>009</td><td>Stringere il film plastico e la scatola di raccolta</td></tr><tr><td>Tappetino per setti in gomma siliconica, 96 pozzetti, foro rotondo</td><td>Sangon Biotech</td><td>F504416-0001</td><td>Sporgenze semicircolari&nbsp;</td></tr></tbody></table>

estrazione del veleno dalla vespa parassitoide trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Le vespe parassitoidi sono un gruppo eterogeneo di insetti imenotteri che fungono da risorse inestimabili per il biocontrollo dei parassiti. Per garantire il successo del parassitismo, le vespe parassitoidi iniettano veleno nei loro ospiti per sopprimere l'immunità dei loro ospiti, modulare lo sviluppo, il metabolismo e persino il comportamento degli ospiti. Con oltre 600.000 specie stimate, la diversità delle vespe parassitoidi supera quella di altri animali velenosi, come serpenti, lumache a cono e ragni. Il veleno di vespa parassitoide è una fonte poco esplorata di molecole bioattive con potenziali applicazioni nel controllo dei parassiti e nella medicina. Tuttavia, la raccolta del veleno parassitoide è impegnativa a causa dell'impossibilità di utilizzare la stimolazione diretta o elettrica e della difficoltà di dissezione a causa delle loro piccole dimensioni. Trichogramma è un genere di vespe parassitoidi di minuscole (~0,5 mm) uova ampiamente utilizzate per il controllo biologico dei parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Riportiamo qui un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. Questi ospiti artificiali vengono creati con film di polietilene e soluzioni di amminoacidi e poi inoculati con vespe Trichogramma per il parassitismo. Il veleno è stato successivamente raccolto e concentrato. Questo metodo consente l'estrazione di grandi quantità di veleno di Trichogramma evitando la contaminazione da altri tessuti causata dalla dissezione, un problema comune nei protocolli di dissezione del serbatoio del veleno. Questo approccio innovativo facilita lo studio del veleno di Trichogramma , aprendo la strada a nuove ricerche e potenziali applicazioni.

La concentrazione proteica di campioni di veleno rappresentativi è stata misurata utilizzando il kit di analisi delle proteine, con i risultati presentati nella Tabella 1. I risultati hanno mostrato che la concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo metodo variava da 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mentre il controllo negativo della soluzione di amminoacidi aveva solo una concentrazione proteica compresa tra 0,03 μg/μL e 0,05 μg/μL. La concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo meto...

Qui presentiamo un protocollo per l'estrazione del veleno da Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale creato con film di polietilene e soluzione di amminoacidi.

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

La mancanza di metodi efficienti per l'estrazione del veleno spesso limita la ricerca sul veleno delle vespe parassitoidi, soprattutto nelle minuscole vespe parassitoidi. Questo studio fornisce un metodo efficiente per estrarre il veleno di Trichogramma con follow-up post-studio del veleno di Trichogramma, come la compensazione proteica e l'analisi della funzione del veleno. In precedenza, nessun metodo di scambio del veleno di vespa parassitoide richiedeva la distinzione della riserva di veleno.Tuttavia, le vespe parassitoidi sono minuscole. Non solo i requisiti tecnici per distinguere il veleno erano elevati, ma anche la continuazione di altri tessuti durante la dissezione è comune. Il nostro metodo normale utilizza un ospite artificiale, evitando così tali problemi.In futuro, ci concentreremo sull'agricoltura e sulle applicazioni mediche del veleno di Trichogramma. Il nostro obiettivo è quello di utilizzare specifici geni del veleno insetticida per il controllo dei parassiti. Nel frattempo, abbiamo in programma di studiare il potenziale non sfruttato del veleno di Trichogramma nella metodologia, in particolare la sua utilità prospettica nel miglioramento delle tecniche di immunoterapia e nella scoperta di nuove molecole antibiotiche.

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