Generazione di una linea cellulare RIP1 knockout U937 utilizzando il sistema CRISPR-Cas9

La nostra ricerca si concentra sul programma di morte cellulare nei mammiferi, studiando in particolare l'equilibrio tra apoptosi e necroptosi nel contesto dell'iperglicemia. Più recentemente, è stato dimostrato che la proteina di morte cellulare RIP1 chinasi modula l'espressione genica durante la necroptosi. La nostra attuale sfida sperimentale è la manipolazione genetica delle cellule immunitarie che crescono in sospensione, in particolare l'eliminazione del gene per la chinasi RIP1 utilizzando CRISPR-Cas9.

Il nostro protocollo offre due vantaggi distinti. Migliora i metodi di trasfezione per le cellule immunitarie che crescono in sospensione utilizzando lentivirus ed elimina la necessità di clonazione di singole cellule durante il processo di creazione di un knockout genetico utilizzando CRISPR-Cas9, I nostri risultati hanno aperto la strada allo studio del ruolo della chinasi RIP1 nello spostamento iperglicemico nella necroptosi. Per iniziare la striscia del quadrante, Escherichia coli che ospita l'RNA guida vettoriale lentivirale su piastre di Luria-Bertani o LB agar integrate con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per uno o due giorni fino a quando le singole colonie sono visibili nell'area più diluita della piastra. Dopo l'incubazione, utilizzando un circuito sterile, selezionare una singola colonia e aggiungerla a cinque millilitri di brodo LB, integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina in una provetta conica da 50 millilitri. Sfiatare e fissare con nastro adesivo il tappo del tubo.

Incubare la provetta in un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius e 225 giri/min per otto ore. Nel frattempo, aggiungere 40 millilitri di brodo LB, integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina in quattro provette da 50 millilitri. Dopo l'incubazione, trasferire 40 microlitri della coltura coltivata in ciascuna delle quattro provette.

Sfiatare e fissare con nastro adesivo i tappi delle provette prima di incubarle in un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius e 225 giri/min per 12-16 ore. Il giorno successivo, centrifugare le colture a 3, 220 x g in un rotore a secchiello oscillante per 20 minuti. Decantare i surnatanti in un becher di scarto e unire tutti e quattro i pellet in 10 millilitri di brodo LB, integrato con ampicillina.

Centrifugare i pellet combinati alla massima velocità in un rotore a secchiello oscillante per 20 minuti per ottenere un singolo pellet e scartare la maggior parte possibile dei surnatanti nel becher dei rifiuti. Seminare HEK293T cellule a una concentrazione da tre a cinque volte 10 alla potenza di sei cellule in un pallone T25 contenente DMEM. Incubare il pallone per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Nel frattempo, preparare la miscela di trasfezione utilizzando un rapporto 1:1:1:1 di plasmidi e un rapporto 3:1 tra reagente di trasfezione e DNA plasmidico con terreno sierico ridotto. Mescolare 75 microlitri di reagente di trasfezione, 2.500 microlitri di terreno sierico ridotto e 25 microgrammi di DNA plasmidico totale. Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 15-30 minuti.

Quindi, pipettare con cura la miscela di trasfezione sulle cellule HEK293T confluenti nel pallone contenente il terreno. Agitare delicatamente il pallone per garantire un'adeguata omogeneizzazione della miscela e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Dopo due giorni di incubazione, trasferire il terreno dal matraccio di HEK293T cella del produttore in una provetta conica da 15 millilitri.

Centrifugare la provetta a 800 x g per cinque minuti per pellettare eventuali celle HEK293T rimanenti. Rimuovere con cura tutto il virus contenente surnatante senza disturbare il pellet e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Contare e calcolare il volume richiesto della sospensione di celle U937 per ottenere un pellet di 2 x 10 alla potenza di sei celle.

Quindi centrifugare la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri a 400 x g per 10 minuti e decantare il surnatante, lasciando il pellet cellulare nella provetta. Risospendere il pellet cellulare nel virus contenente surnatante e centrifugare la provetta a 290 x g per 60 minuti. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per risospendere il pellet con il virus contenente il surnatante nella provetta.

Posizionare il tubo su un rotatore da un'estremità all'altra per 60 minuti. Quindi centrifugare la provetta a 400 x g per 10 minuti e risospendere il pellet in un rapporto 1:1 del virus contenente surnatanti e del terreno RPMI 1640 completo, integrato con FBS inattivato al calore al 10%. Trasferire la miscela cellulare in un nuovo pallone di coltura tissutale T25 e incubarla a 37 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule U937 a 400 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con un terreno RPMI 1640 completo, integrato con il 10% di FBS inattivato a caldo e cinque microgrammi per millilitro di puromicina. Trasferire la coltura cellulare in un matraccio T25.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due o tre settimane, controllando le cellule ogni uno o due giorni per segni di crescita. L'analisi Western blot ha confermato la perdita dell'espressione della proteina RIP1 nelle cellule mutanti CRISPR RIP1 senza segnale rilevabile rispetto al segnale forte nelle cellule di controllo wild-type e non bersaglio. Il trattamento con TCZ ha indotto una significativa morte cellulare necroptotica nelle cellule di controllo wild-type e non bersaglio, che è stata invertita dal trattamento con necrostatina-1.

Al contrario, le cellule knockout CRISPR RIP1 hanno mostrato una morte cellulare significativamente inferiore rispetto alle cellule di controllo wild-type e non bersaglio senza alcun effetto di necrostatina-1, indicando una perdita della funzione di RIP1. La microscopia a fluorescenza su cellule vive ha mostrato un aumento significativo della produzione di superossido mitocondriale nelle cellule di controllo wild-type e non bersaglio dopo il trattamento con TCZ, che è stata ridotta con il trattamento con necrostatina-1. Le cellule knockout CRISPR RIP1 hanno mostrato una produzione minima di superossido mitocondriale senza alcun effetto osservabile del trattamento con necrostatina-1s.