Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Il nostro obiettivo è comprendere come i segnali meccanici e biochimici correlano la morfogenesi animale, incluso il rilevamento e la risposta alle forze da parte di cellule e molecole. È stato scoperto che altre molecole sono meccanosensibili, funzionando in modo diverso a diversi livelli di tensione. Tuttavia, il contesto fisiologico e la funzione di questi eventi sensibili alla forza rimangono in gran parte sconosciuti.

A causa della natura dinamica degli eventi sensibili alla forza, il nostro campo si basa in gran parte sull'imaging a fluorescenza ad alta velocità e sulla registrazione time-lapse per catturare i comportamenti molecolari e cellulari. Molte proteine marcate con fluorescenza non sono abbastanza luminose per essere visualizzate e richiedono una risoluzione spazio-temporale senza sbiancamento significativo. D'altra parte, i metodi di immunofluorescenza tradizionali possono catturare solo un'istantanea del dispositivo molecolare e cellulare dopo la fissazione.

Questo metodo apre la strada per tracciare dinamicamente la localizzazione di molti recettori proteici a bassa abbondanza delle principali vie di segnalazione, come Notch, Wnt e le vie BMP. Alla fine, oltre alle tradizionali cascate di segnalazione lineare, possiamo individuare e dove si verificano gli eventi di segnalazione su scale subcellulari.