Name: Utilizzo di coloranti a basso costo per visualizzare laccumulo di glicogeno e lintegrità intestinale in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri come valutare i livelli di glicogeno e l'integrità intestinale in Caenorhabditis elegans con saggi a basso costo basati su coloranti. Questi protocolli facilitano l'insegnamento della biologia sperimentale agli studenti.

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NOTA: I batteri Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) e i ceppi wild type Bristol N2 possono essere ottenuti dal CGC, Università del Minnesota, USA o da donazione da un laboratorio di C. elegans . Per la sicurezza dei ricercatori, è imperativo utilizzare dispositivi di protezione individuale. Sebbene le concentrazioni di reagenti come l'ipoclorito e l'idrossido di sodio siano basse, è essenziale indossare i DPI raccomandati, come evidenziato nel manoscritto, per ridurre al minimo i potenziali rischi associati a queste sostanze chimiche.
1. Contenuto di glicogeno
<ol><li>Preparazione delle piastre di prova<ol><li>Preparare sei piastre di agar NGMda 60 mm x 15 mm 20 (10 ml di agar del terreno di crescita dei nematodi, NGM, come descritto nella Tabella supplementare 1) per ceppo di verme e lasciarle asciugare per 1 giorno a temperatura ambiente. Tenere le piastre chiuse per evitare contaminazioni.</li>
		<li>Aggiungere 200 μl di coltura liquida OP50 di E. coli (con una densità ottica = 0,600, approssimativamente a una lunghezza d'onda di 600 nm) per piastra per inoculare un totale di quattro piastre NGM da 60 mm x 15 mm per deformazione nella cappa di flusso. Lasciare incubare le piastre chiuse a 37 °C per 1 giorno prima dell'uso. NOTA: Preparare sei piastre (passaggio 1.1) ma inoculare solo 4 con il batterio E. coli OP50. Conservare le due piastre rimanenti a 4 °C per un uso successivo quando si posizionano i vermi in condizioni di fame. Questa analisi può essere eseguita in duplicato.</li>
		<li>Il giorno del test, aggiungere 200 μl di D-glucosio 0,025 M a due piastre di agar NGM (6 mm x 15 mm) per ceppo precedentemente seminate con batteri E. coli OP50. Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente nella cappa di flusso. NOTA: Le piastre di agar NGM seminate con batteri E. coli OP50 possono anche essere essiccate vicino a lampade ad alcool come alternativa all'uso di una cappa a flusso.</li>
	</ol></li>
	<li>Sincronizzazione<ol><li>Circa 3 giorni prima della sincronizzazione, trasferire 3-4 pezzi (3 cm x 3 cm) da un agar NGM di mantenimento con C. elegans Bristol N2 (wild type) in diversi stadi (circa 500 vermi per pezzo) a una nuova piastra (150 mm x 90 mm) che è stata precedentemente seminata con batteri E. coli OP50.</li>
		<li>Posizionare la nuova piastra con le viti in un ambiente controllato a 20 °C e mantenere l'umidità &gt;95% per 3 giorni (72 ore permettono alla maggior parte delle vermi di raggiungere lo stadio adulto gravido). NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la temperatura di crescita a seconda del ceppo o dei ceppi di C. elegans utilizzati.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, raccogliere i vermi dalla piastra preparata con H2O distillato e trasferirli in una provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
		<li>Attendere la sedimentazione dei vermi per gravità (circa 15 minuti) e poi rimuovere il surnatante. Ripeti questo processo 3 volte per eliminare i batteri. Dopo l'ultimo lavaggio, ridurre il volume a 5 ml.</li>
		<li>Aggiungere 10 ml di soluzione decolorante (Tabella supplementare 1) e agitare energicamente con le mani per circa 6 minuti.</li>
		<li>Subito dopo aver completato l'agitazione, riempire le provette fino a una capacità di 50 ml con il tampone M9.</li>
		<li>Centrifugare a 1400 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante fino a 5 mL e quindi aggiungere nuovamente 45 mL di tampone M9. Ripeti questo processo 4 volte.</li>
		<li>Dopo l'ultimo lavaggio, ridurre il volume a 15 ml e mantenerlo a temperatura (20 °C) e umidità (&gt;95%) controllate per circa 14 ore. NOTA: Il processo di sincronizzazione può essere sostituito dall'ottenimento di uova attraverso l'ovideposizione: Trasferire circa 20 vermi adulti gravidi su una piastra NGM (6 mm x 15 mm) precedentemente seminata con 200 μL di E. coli OP50. Lasciare che i vermi depongano le uova per 1 giorno. Dopodiché, rimuovi i vermi gravidi e attendi che le uova si schiudano.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei vermi<ol><li>Utilizzando una pipetta automatica, aggiungere 10 μL di vermi sincronizzati (passaggio 1.2.8) a un vetrino da microscopio e contare il numero di vermi. Calcola quanto volume deve essere pipettato per ottenere 500-1000 vermi/μL.</li>
		<li>Trasferire 500-1000 vermi sincronizzati L1 (passaggio 1.2.8) su piastre di agar NGM (150 mm x 90 mm, Tabella supplementare 1) seminate con batteri E. coli OP50 come fonte di cibo, fino a raggiungere lo stadio larvale 4 (L4) a 20 °C. NOTA: I vermi possono essere trasferiti utilizzando una pipetta automatica. Se non è disponibile una pipetta automatica, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro e i volumi possono essere controllati utilizzando etichette per microprovette o pipette graduate in vetro.</li>
		<li>Dopo 48 ore di sincronizzazione20: raccogliere le larve L4 dalle piastre con tampone M9 (Tabella supplementare 1), con l'aiuto di una pipetta di plastica Pasteur in una provetta conica pulita da 50 mL e lavarle 3 volte con tampone M9 fresco o ripetere i lavaggi fino a quando tutti i batteri E. coli OP50 rimanenti sono completamente rimossi (a temperatura ambiente). NOTA: La fase di lavaggio è importante perché alcuni vermi sperimenteranno la fame durante la procedura.</li>
	</ol></li>
	<li>Esecuzione del test<ol><li>Trasferire 500-1000 viti senza fine L4 (passaggio 1.3.1) da ciascuna delle nuove piastre di agar NGM (60 mm x 15 mm) precedentemente preparate (passaggi 1.1.2 e 1.1.3). Conservarli a 20 °C per 48 ore fino al giorno del test. Questo programma si tradurrà in tre gruppi sperimentali come segue, in duplice copia (Figura 1): A- (fame): i vermi cresceranno su normali piastre di agar NGM senza batteri E. coli OP50; B- (regolare): i vermi cresceranno su piastre di agar NGM regolari seminate con batteri E. coli OP50; C- (alto glucosio): i vermi cresceranno su piastre di agar NGM seminate con batteri E. coli OP50 e contenenti 0,025 M di D-glucosio.</li>
		<li>Il giorno del test (dopo 48 ore): raccogliere i vermi e somministrarli tre brevi lavaggi nel tampone M9 (fasi 1.2.2 e 1.2.3) NOTA: Qui, preparare le piastre di agar NGM con l'aggiunta di D-glucosio (passaggio 1.3) e metterle da parte fino al momento di aggiungere i vermi.<ol><li>Colorazione dello iodio: preparare una soluzione di iodio di Lugol al 5% (v/v) (soluzione di iodio/ioduro di potassio) utilizzando un tampone M9 fresco. NOTA: La soluzione di iodio di Lugol può essere ottenuta da fornitori locali di reagenti o farmacie, pertanto la concentrazione iniziale può variare. Se necessario, calcolare per ottenere una soluzione al 5% (v/v).</li>
		</ol></li>
		<li>Trasferire circa 100 μL di vermi lavati (fase 4.2) da ciascun gruppo alla microprovetta da 1,5 mL contenente la soluzione diluita di Lugol (5% v/v). Utilizzando una pipetta automatica in proporzione 1:5, trasferire 100 μL di vermi in 400 μL di soluzione di Lugol, seguita da una leggera agitazione in un miscelatore per 5 minuti. NOTA: Se non è disponibile un mixer, è possibile agitare accuratamente le microprovette con le mani.</li>
		<li>Subito dopo questi 5 minuti, centrifugare la microprovetta da 1,5 mL (vermi + soluzione di Lugol) a 1400 x g per 3 minuti. NOTA: Se questo test viene eseguito su vermi dallo stadio L4 o oltre, è possibile ottenere la sedimentazione per gravità invece di utilizzare una centrifuga. Lasciare le microprovette aperte in rack sul banco di lavoro per 10 minuti fino a quando tutti i vermi si sono depositati sul fondo della microprovetta.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e lavare i vermi con 1,0 ml di tampone M9 fresco. Ripetere il lavaggio fino a rimuovere tutto lo iodio rimanente dalla soluzione (minimo 3 volte).</li>
		<li>Dopo l'ultima fase di lavaggio, rimuovere il surnatante ad eccezione di un residuo di circa 100 μl. Usalo per risospendere delicatamente i vermi e per l'analisi microscopica.</li>
		<li>Trasferire circa 50 μl della soluzione di verme risospeso su vetrini per microscopia e coprirli con vetrini coprioggetti. Osservare le immagini in campo chiaro utilizzando uno stereomicroscopio (a 1,5x). NOTA: Se non è disponibile uno stereomicroscopio, è possibile utilizzare un normale microscopio e le immagini possono essere acquisite con la fotocamera di un telefono cellulare (a 3,4x) utilizzando un adattatore. Per evitare errori di luce/luminosità/esposizione, è fondamentale che tutte le impostazioni della fotocamera del telefono cellulare rimangano coerenti per tutte le immagini.</li>
	</ol></li>
	<li>Ispezione dei dati<ol><li>Dati quantitativi: Calcola il contenuto di glicogeno in base alla colorazione dello iodio dei vermi.<ol><li>Salva le immagini dallo stereomicroscopio contenenti un minimo di 10 vermi per gruppo come file .jpeg per un'ulteriore elaborazione. A tale scopo, scaricate il software gratuito ImageJ. I dettagli sono forniti nel file supplementare 1, nella figura supplementare 1, nella figura supplementare 2.</li>
			<li>Aprire l'immagine .jpeg utilizzando il software ImageJ (scaricabile gratuitamente all'indirizzo https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Fare clic su Linea segmentata e delineare il verme (un verme alla volta). Fare clic su Analizza, quindi selezionare Misura per ottenere la quantificazione della macchia. I dati verranno visualizzati come media nella tabella. La media indica i dati calcolati dalla densità di colorazione per area del verme.</li>
		</ol></li>
		<li>Dati qualitativi: Ottenere immagini dallo stereomicroscopio di ciascun gruppo e confrontare visivamente la colorazione dei vermi. Creare un sistema di punteggio, se necessario, per analizzare la colorazione: 0 incolore; 1 leggermente macchiato; 2 macchiati e 3 fortemente macchiati. Utilizzando lo stereomicroscopio, contare manualmente circa 10 vermi per gruppo (minimo) con un contatore.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> Figura 1: Schema del saggio del contenuto complessivo di glicogeno in C. elegans. Uno schema dell'esperimento qui eseguito per eseguire il saggio del contenuto di glicogeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Valutazione della permeabilità intestinale
<ol><li>Preparazione dei vermi<ol><li>Circa 14 ore dopo la sincronizzazione (passaggio 1.2.8), trasferire 500-1000 vermi (passaggio 1.3.1 e NOTA) al primo stadio larvale (L1) su ciascuna nuova piastra di agar NGM (60 mm x 15 mm) precedentemente preparata e mantenerli a 20 °C fino al giorno del test. Questo programma porterà a due gruppi sperimentali come segue (Figura 2): A- (giovani): i vermi cresceranno su piastre di agar NGM seminate con il batterio E. coli OP50 fino allo stadio larvale 4 (L4); B- (vecchio): i vermi cresceranno su piastre di agar NGM seminate con il batterio E. coli OP50 fino al 7° giorno di età adulta. NOTA: I vermi mantenuti fino al 7° giorno di età adulta devono essere lavati con tampone M9 ogni giorno e trasferiti su nuove piastre di agar NGM (60 mm x 15 mm) con 200 μL di batteri E. coli OP50 precedentemente seminati per la sostituzione alimentare e la rimozione della progenie. I vermi più giovani galleggiano durante la decantazione e possono essere separati rimuovendo il surnatante. La percentuale di vermi puffi aumenta con l'età. Tuttavia, la valutazione della permeabilità intestinale può essere eseguita in qualsiasi fase ed età, a seconda dello scopo dello studio.</li>
	</ol></li>
	<li>Esecuzione del test<ol><li>Il giorno del test, raccogliere i vermi L4 (2 giorni dopo il passaggio 2.1.1) e i vermi dell'età adulta il 7° giorno ( ora al 9° giorno) con tampone M9 (Tabella supplementare 1) e trasferirli in microprovette da 1,5 ml etichettate.</li>
		<li>Centrifugare a 1400 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante, aggiungere 1,0 mL di M9 e mescolare delicatamente. Ripeti questo processo 3 volte per rimuovere i batteri. Dopo l'ultimo lavaggio, ridurre il volume a 500 μl.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta automatica, aggiungere 10 μl di sedimento del verme a un vetrino da microscopio e contare il numero di vermi. Calcolare il volume da pipettare per ottenere 100 vermi/μL.</li>
		<li>Colorazione dei puffi: preparare una soluzione di sale disodico di erioglaucina al 25% (Tabella supplementare 1) utilizzando acqua distillata. Se necessario, utilizzare il vortice per una migliore solubilizzazione.</li>
		<li>Nelle nuove microprovette precedentemente identificate, utilizzando una pipetta automatica, aggiungere il volume contenente 100 vermi, 100 μL di soluzione di sale disodico di Erioglaucina al 25%, 200 μL di E. coli OP50 e completare con tampone M9 per un volume finale di 500 μL. NOTA: I volumi di Erioglaucine disodium, E. coli e il numero di vermi sono fissi. Il volume del tampone M9 è variabile e può essere utilizzato per portare il volume finale a 500 μl.</li>
		<li>Incubare per 3 h agitando in un miscelatore, al riparo dalla luce, a temperatura ambiente. NOTA: Se non è disponibile un mixer, agitare accuratamente le microprovette con le mani ogni 15 minuti.</li>
		<li>Dopo 3 ore, centrifugare la microprovetta da 1,5 mL a 1400 x g per 3 min. Rimuovere 1,0 mL di surnatante e lavare i vermi con 1,0 mL di tampone M9.</li>
		<li>Ripetere i lavaggi fino a rimuovere dalla soluzione la restante soluzione di sale disodico di erioglaucina. Dopo l'ultima fase di lavaggio, rimuovere il surnatante ad eccezione di un residuo di circa 250 μl. Utilizzarlo per risospendere con cura i vermi e processarli per l'analisi microscopica.</li>
		<li>Trasferire circa 50 vermi di soluzione di vermi risospesi su vetrini per microscopia e coprirli con vetrini coprioggetti. Incubare i vetrini per microscopia in frigorifero a -20 °C per 10 minuti per paralizzare i vermi. NOTA: Un'altra alternativa per paralizzare i vermi è aggiungere 10 μL di soluzione di Levamisolo cloridrato (10 mM ; Tabella supplementare 1) e coprirli con vetrini.</li>
		<li>Osservare e contare il numero totale di vermi e i vermi completamente colorati utilizzando il campo chiaro in uno stereomicroscopio (a 1,5x). Le immagini possono essere ottenute dalla fotocamera di un telefono cellulare (a 3,4x) accoppiata con un adattatore. Per evitare errori di luce/luminosità/esposizione, è fondamentale che tutte le impostazioni della fotocamera del telefono cellulare rimangano coerenti per tutte le immagini.</li>
	</ol></li>
	<li>Ispezione dei dati<ol><li>Dati qualitativi: Ottenere immagini dallo stereomicroscopio di ciascun gruppo (L4 e 7° giorno di età adulta) e confrontare visivamente la colorazione dei vermi.</li>
		<li>Conta il numero totale di vermi e il numero di vermi puffi (vermi blu) usando uno stereomicroscopio.</li>
		<li>Esprimi i risultati come percentuale di vermi puffi confrontando i vermi giovani (L4, come gruppo di controllo) e i vermi anziani (7° giorno di età adulta): A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A Dove, A = numero totale di vermi B= numero di vermi puffi</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> Figura 2: Schema del saggio di permeabilità intestinale complessiva in C. elegans. (A) Preparazione di C. elegans . (B) Colorazione con sale disodico di erioglaucina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione del metabolismo e del modello di invecchiamento in Caenorhabditis elegans

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<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microprovette da 1,5 mL</td><td>Fornitori</td> <td>locali-incubatore</td><td></td></tr> <tr><td>a 37 gradi</td><td>KS 4000i&nbsp;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Fornitori</td> <td>locali-piastre</td><td></td></tr> <tr><td>Petri da 6 cm&nbsp;</td><td>Fornitori</td> <td>locali-Agar</td><td></td></tr> <tr><td>batteriologico</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Bristol N2 (wild type)</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio anidro</td><td>Neon</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>H2O distillato</td><td>Fornitori</td> <td>locali-Sale</td><td></td></tr> <tr><td>disodico Erioglaucina</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td></td> Mylabor <td></td><td></td>con cappa a flusso</tr><tr><td></td><td>Panasonic Healthcare azienda del Nord America, MIR-254-PA.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Levamisolo cloridrato</td><td>RIPERCOL L 150F-Lugol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>soluzione</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Synth</td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga per microcentrifuga</td><td>5425R Eppendorf SE, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>Peptone batteriologico</td><td>&ecirc; xodo cient&iacute; </td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica S8 Apo Stereomicroscopio (S&atilde; o Paulo, Brasile)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>estreptomax</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo di coloranti a basso costo per visualizzare l'accumulo di glicogeno e l'integrità intestinale in caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Il test del contenuto di glicogeno fornisce un metodo robusto e rapido per lo screening di varie condizioni di test, come studi comparativi di diversi ceppi che possono influenzare la sintesi o la degradazione del glicogeno. In questo studio, i vermi L4 sono stati sottoposti a tre distinte condizioni di test: digiuno, alimentazione e gruppi arricchiti di glucosio. Il test è stato eseguito tre volte, con ogni condizione replicata due volte in ogni test; un'immagine rappresentativa è mostrata nella Figura 3. Dopo ogni test, i vermi colorati con la soluzione di iodio di Lugol sono stati osservati utilizzando uno stereomicroscopio ed è stato effettuato un confronto qualitativo tra i gruppi per quanto riguarda la colorazione dei vermi. In termini di osservazione visiva, i vermi nel gruppo a digiuno (fame) hanno mostrato una colorazione meno intensa rispetto ai vermi alimentati con E. coli OP50 (regolare), così come quelli alimentati con E. coli OP50 e D-glucosio (glucosio alto). Inoltre, i vermi alimentati con E. coli OP50 e D-glucosio (glucosio alto) hanno mostrato la colorazione più intensa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> Figura 3: Immagini rappresentative dal saggio del contenuto di glicogeno. I livelli di glicogeno in C. elegans sono stati valutati attraverso la colorazione con iodio. Le immagini microscopiche raffigurano vermi rappresentativi di C. elegans sottoposti a (A) fame, (B) condizioni regolari o (C) di glucosio elevato per 48 ore. I vermi sono stati colorati immergendoli in una soluzione di tampone iodio/M9 di Lugol (1%) per 5 minuti, seguendo la procedura descritta al punto 1.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I risultati della permeabilità intestinale mostrano la differenza nella colorazione dei vermi giovani (L4) con intestino intatto e dei vermi vecchi (7° giorno dell'età adulta) con membrane intestinali danneggiate a causa dell'invecchiamento (Figura 4). L'intestino di C. elegans è un tessuto di importanza centrale per la salute, in quanto svolge un ruolo critico nella digestione e nel metabolismo e funge da centro di segnalazione per la risposta allo stress e la regolazione dell'invecchiamento21. Nei giovani vermi, l'intestino di C. elegans è costituito da una forte barriera che impedisce la fuoriuscita del contenuto intestinale. Tuttavia, con l'avanzare dell'età di questi vermi, la funzione della barriera intestinale diminuisce e diventa più sensibile all'interruzione dovuta alla progressiva degradazione delle cellule e dei microvilli e all'accumulo di batteri nell'intestino che invecchia21,22. Quando i giovani C. elegans ingeriscono il colorante Erioglaucina sale disodico, l'intestino del nematode viene colorato (Figura 4A). D'altra parte, è possibile osservare che i vermi invecchiati presentavano uno stravaso del colorante, che permeava l'intero corpo del verme, il che indica un danno alla membrana intestinale (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> Figura 4: Immagine rappresentativa di C. elegans che colora con sale disodico di Erioglaucina. L'immagine al microscopio mostra C. elegans con intestino intatto (stadio L4) e vermi con intestino rotto (7° giorno di età adulta). I vermi sono stati colorati mediante immersione in una soluzione di sale disodico di erioglaucina al 25% per 3 ore, seguendo il passaggio 2.2.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Schermata ImageJ per la selezione del contorno di C. elegans . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 2 supplementare: Schermata di ImageJ per il calcolo della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Ricette, tampone e colture. Composizione di diversi terreni, buffer e colture utilizzati nel protocollo corrente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Fascicolo supplementare 1: Descrizione dettagliata del software ImageJ per la quantificazione del contenuto di glicogeno nei vermi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Utilizzo di coloranti a basso costo per visualizzare l'accumulo di glicogeno e l'integrità intestinale in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

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Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Questo protocollo viene illustrato come monitorare una traslocazione nucleare della proteina sotto stress da calore utilizzando una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) come indicatore e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Il protocollo di colorazione DAPI è veloce e preserva i segnali di localizzazione sottocellulare della proteina e GFP.

Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Questo protocollo descrive come misurare la permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. Questo metodo è utile per la ricerca biologica di base sulla salute intestinale relativa all'interazione tra i batteri intestinali e il loro ospite e per lo screening per identificare gli agenti probiotici e chimici per curare la sindrome dell'intestino che perde e le malattie infiammatorie intestinali.

Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale della caenorhabditis elegans

Qui, viene presentato un metodo per l'analisi della cinetica di aggregazione proteica nel nematode Caenorhabditis elegans. Gli animali di una popolazione sincronizzata con l'età vengono ripresi in diversi punti temporali, seguiti dal conteggio dell'inclusione semiautomatica in CellProfiler e dall'adattamento a un modello matematico in AmyloFit.

Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans

Scopri come valutare i livelli di glicogeno e l'integrità intestinale in Caenorhabditis elegans con saggi a basso costo basati su coloranti. Questi protocolli facilitano l'insegnamento della biologia sperimentale agli studenti.

Utilizzo di coloranti a basso costo per visualizzare l'accumulo di glicogeno e l'integrità intestinale in Caenorhabditis elegans

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